专利名称：：一种优化的蒙药阿给issr分子标记方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及一种优化的蒙药阿给ISSR分子标记方法。
背景技术：
：蒙药阿给[Agi]——冷蒿(ArtemisiafrigidaWilld.)，又名小白蒿、菟毛蒿，为菊科蒿属的小灌木[1]。阿给为蒙医常用药，具有止血、消肿之功效，临床上主治各种出血、关节肿胀、肾热、月经不调、疮痛等，也是蒙医上常用的“人造圣水组成之一”。随着DNA分子标记技术的发展，人们已将这一技术广泛地应用于传统药材资源、鉴定、栽培等方面。阿给的分子生物学水平的研究很少，且都不是作为药物进行研究。目前仅获得了5条DNA序列，它们是小白蒿叶绿体的leu-tRNA基因的片段以及核糖体rRNA基因片段，主要用来分辨各个植物之间的差别。王静等人检测了阿给作为牧草在不同放牧压力下群体的遗传多样性变化。由于阿给是风媒异花受粉，在时间上和空间上有广泛的分布，所面临的环境差异大，个体和种群数目多，基因交流频繁，因此产生新的遗传变异的机会多，这有利于其增加遗传多样性水平，并使之保持较高的水平(多态位点百分率为94.49%),高于高等植物平均遗传多样性水平为70%。遗传多样性随着放牧强度的不同也有所不同。加强蒙药阿给的分子生物学水平的研究，无疑为其种子种苗研究、资源保护、功效应用等提供了坚实的理论基础。ISSR(Inter-SimpleSequenceR印eat，简单重复序列)分子标记是20世纪90年代发展起来的一种新技术，基本原理是利用在植物基因组中常出现的SSR本身设计引物，对位于反向排列的SSR之间的DNA序列进行PCR扩增。ISSR呈孟德尔式遗传，为显性标记，稳定性高，技术简单、快速、成本低廉。由于SSR在真核生物中分布非常普遍，且串联重复的数目是可变的，呈高度多态性，因此ISSR标记技术可以检测基因组许多位点的差异。目前该技术在植物的指纹图谱、遗传多样性、遗传作图和基因定位研究中得到了广泛应用。
发明内容本发明的目的是提供一种优化的蒙药阿给ISSR分子标记方法。本发明的优化的蒙药阿给ISSR分子标记方法包括以下步骤1)提取阿给的基因组DNA；2)进行ISSR扩增，其中，所述ISSR扩增的反应体系为20μ反应体系中含有10XPCR缓冲液2yL，模板DNA50ng,此外，Mg2+为1.5mmol·ΛdNTP为0.25mmol·ΛTaq酶为1.5U,引物为0.75μmo1·lA所述ISSR扩增的条件为94°C退火5min，然后94°Clmin、56°C40s、72°Clmin30s40个循环，最后72°C延伸5min,其中，所述引物序列如以下所示。弓丨物序列(5，-3，)UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGTUBC810GAGAGAGAGAGAGAGATUBC811GAGAGAGAGAGAGAGACUBC823TCTCTCTCTCTCTCTCCUBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYTUBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYTUBC841GAGAGAGAGAGAGAGAYCUBC845CTCTCTCTCTCTCTCTRGUBC857ACACACACACACACACYGUBC864ATGATGATGATGATGATGUBC873GACAGACAGACAGACAUBC887DVDTCTCTCTCTCTCTC本发明所建立的蒙药阿给ISSR反应体系扩增出的条带具有多态性高、特异性强、背景清楚及稳定性强的优点。图1为正交试验设计ISSR-PCR反应体系的扩增结果，1_9为表3的处理组合编号；引物为UBC807图2为12个不同引物的ISSR扩增结果，M:100bpladder；1.UBC807；2.UBC810；3.UBC811；4.UBC823；5.UBC834；6.UBC840；7.UBC841,8.UBC845；9.UBC857；10.UBC864；11.UBC873；12.UBC887。图3为ISSR-PCR反应体系中不同退火温度的扩增结果，1.52.0°C；2.52.3°C；3.52.90C；4.53.8°C；5.55.0°C；6.56.0°C；7.56.6°C；8.57.0°C；M:100bpladder；引物为UBC807。图412个不同引物的ISSR扩增，1-12选用引物分别是UBC807、UBC810、UBC811、UBC823、UBC834、UBC840、UBC841、UBC845、UBC857、UBC864、UBC873和UBC887；MIOObpladder。图5ISSR-PCR反应体系中不同循环数的扩增结果，1-4分别表示所用循环数目为30个循环、35个循环、40个循环和45个循环；MIOObpladder；引物为UBC807。具体实施例方式实施例1提取阿给基因组DNA。1、扩增体系的筛选正交优化设计筛选ISSR的最优反应体系(四因素三水平)，选用L9(34)正交表，设计PCR扩增体系各成分的因素-水平正交设计实验表(方案见表2及表3)。以UBC807为引物，利用表3中的9个体系，对阿给进行ISSR扩增。反应体系为20μL，除表中所列因素外，每管含有IOXPCRbuffer2μL，模板DNA50ng。初扩增程序为4°C预变性5min;94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸1.5min，循环45次；72°C延伸5min，4°C保存。表1ISSR扩增引物和序列_引物序列(5，-3，)PrimerPrimersequences(5，_3，)_UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGTUBC810GAGAGAGAGAGAGAGATUBC811GAGAGAGAGAGAGAGACUBC823TCTCTCTCTCTCTCTCCUBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYTUBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYTUBC841GAGAGAGAGAGAGAGAYCUBC845CTCTCTCTCTCTCTCTRGUBC857ACACACACACACACACYGUBC864ATGATGATGATGATGATGUBC873GACAGACAGACAGACAUBC887DVDTCTCTCTCTCTCTC_表2ISSR-PCR反应体系的因素与水平‘S^if平(体系终浓度J3,Mg2+Zmmol·L'11.52.02.5dNTP/mmol·L"10J502025TaqDNA聚合酶/(U·之。+·1)0.51.01.5引物/μιηο·L'1_025_05_0.75表3ISSR-PCR反应体系的正交试验设计[L9(34)]<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>参照何正文等的方法，对电泳条带的强弱和杂带的多少做直接分析。从图1可以看出，在9个处理组合中，由于Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物4种影响因素组合的不同，扩增效果存在着明显差异。第1、6号处理扩增效果较差，谱带弱且多态性低，第3号处理效果最好，谱带强，多态性高。因此获得的最佳ISSR扩增反应体系为反应总体积为20μL，Mg2+为1.5mmol·ΛdNTP为0.25mmol·ΛTaqDNA聚合酶为1.5U，引物为0.75μmol·Γ1。采用优化后的体系，以相同的DNA模板，以UBC807，UBC810，UBC811，UBC823，UBC834，UBC840，UBC841，UBC845，UBC857，UBC864，UBC873，UBC887为引物，进行ISSR扩增，能够扩增出清晰且稳定性好的条带，多态性高(图2)。说明该反应体系适合于阿给ISSR-PCR反应。2、扩增条件的筛选1)根据电泳结果，选用体系3为阿给ISSR反应条件。即在20μL反应体系中，Mg2+为1.5mmol·ΛdNTP为0.25mmol·ΛTaqDNA聚合酶为1.5U，引物为0.75μmol·Λ此外，每个反应体系中含有2μL10XPCRbuffer2μL，模板DNA为50ng，不足体积用灭菌的双蒸水补足。2.1退火温度的筛选在上述试验确定的最佳反应体系基础上，对退火温度进行梯度试验，优化筛选最佳退火温度，根据在引物理论退火温度上下波动2-4°C的原则，在PCR梯度扩增仪上设置最小退火温度为52°C，最大为57°C，PCR仪自动形成8个梯度，即52.0°C>52.3°C>52.9°C、53.8°C>55.0°C>56.0°C>56.6°C>57.0°C。从图3可以看出当退火温度为52.0-53.8°C时，产生的条带不清晰，而当退火温度高于56.0°C时，产生杂带。因而认为UBC807引物的退火温度为56°C较为合适。使用引物UBC810；3.UBC811；4.UBC823；5.UBC834；6.UBC840；7.UBC841,8.UBC845；9.UBC857；10.UBC864；11.UBC873；12.UBC887，以56°C退火温度进行扩增，扩增结果如图4所示，产生的条带清晰。2)循环数的确定根据正交实验及退火温度筛选的结果，进行循环数的确定。循环数依次为30，35，40，45。每个循环设2个重复。根据正交试验及退火温度的结果，选择最佳退火温度进行循环数的检测。从图5可以看出当循环数为30，35时，条带不清晰，循环数为40，45时，条带较清晰，且无杂带，从节约时间和成本的角度考虑，选择循环数40较为合适。结论利用正交试验设计，从Mg2+浓度、dNTP浓度、TaqDNA酶浓度和引物浓度4因素3水平，对蒙药阿给ISSR-PCR反应体系进行优化分析，并在此基础上对PCR的循环数及退火温度进行试验。结果表明，20μL反应体系中，Mg2+为1.5mmol·L—1，dNTP为0.25mmol·ΛTaqDNA酶为1.5U，引物为0.75μmol·L—1时，且ISSR最适的循环数为40，最适退火温度为56°C，扩增效果最好。为阿给遗传多样性的进一步研究奠定技术基础。权利要求一种优化的蒙药阿给ISSR分子标记方法，所述方法包括以下步骤1)提取阿给的基因组DNA；2)进行ISSR扩增。其中，所述ISSR扩增的反应体系为20μL反应体系中含有10×PCR缓冲液2μL，其中Mg2+为1.5mmol·L-1，模板DNA50ng，dNTP为0.25mmol·L-1，Taq酶为1.5U，引物为0.75μmol·L-1。所述ISSR扩增的条件为94℃退火5min，然后94℃1min、56℃40s、72℃1min30s40个循环，最后72℃延伸5min。其中，所述引物序列如以下所示引物序列5’-3’UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGTUBC810GAGAGAGAGAGAGAGATUBC811GAGAGAGAGAGAGAGACUBC823TCTCTCTCTCTCTCTCCUBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYTUBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYTUBC841GAGAGAGAGAGAGAGAYCUBC845CTCTCTCTCTCTCTCTRGUBC857ACACACACACACACACYGUBC864ATGATGATGATGATGATGUBC873GACAGACAGACAGACAUBC887DVDTCTCTCTCTCTCTC。全文摘要本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及一种优化的蒙药阿给ISSR分子标记方法。根据本发明的优化的蒙药阿给ISSR分子标记方法包括以下步骤1)提取阿给的基因组DNA；2)进行ISSR扩增，其中，所述ISSR扩增的反应体系为20μL反应体系中含有10×PCR缓冲液2μL，模板DNA50ng，此外，Mg2+为1.5mmol·L-1，dNTP为0.25mmol·L-1，Taq酶为1.5U，引物为0.75μmol·L-1。所述ISSR扩增的条件为94℃退火5min，然后94℃1min、56℃40s、72℃1min30s40个循环，最后72℃延伸5min。本发明所建立的蒙药阿给ISSR反应体系扩增出的条带具有多态性高、特异性强、背景清楚及稳定性强的优点。文档编号C12Q1/68GK101818197SQ201010108950公开日2010年9月1日申请日期2010年2月8日优先权日2010年2月8日发明者冯金朝,刘越,周宜君,孙洪波,张淑萍,张琳霞,王俊丽,王斌,王真,申刚义,韦善君,高飞申请人:中央民族大学