专利名称：用于检测前列腺癌的检测剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测前列腺癌的检测剂和试剂盒、所述检测剂和试剂盒在检测 TMPRSS2基因与ETS家族基因融合中的用途、以及一种检测TMPRSS2基因与ETS家族基因融合的方法。
背景技术：
前列腺癌(prostate cancer，下文简称为“PCa”)是一种常见的老年男性泌尿生殖系统恶性肿瘤。在欧美国家，前列腺癌居男性恶性肿瘤的第二位(Jemal A, Murray Τ, Samuels A, et al. Cancerstatistics [J]. CA Cancer J，2003，53(1) :5-26.)，病死率仅次于肺癌。在我国，前列腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，已高居泌尿系肿瘤的第三位， 并且发病年龄也日趋年轻化。早期PCa主要表现为组织结构的改变，细胞病理学的改变并不典型，诊断易受病理检查者的主观影响。目前，PSA筛查、直肠指诊、经直肠超声引导穿刺活检是前列腺癌诊断的标准方法。但这三种方法都有其不足。关于PSA筛查方法，当PSA> 10ng/ml时患癌的几率在50 %以上；当PSA为 4 lOng/ml，考虑穿刺活检进一步证实，仅能发现20-40 %的PCa患者，漏诊率高；当PSA < 4ng/ml，不主张做穿刺活检，但近年来发现当PSA为2 ^g/ml时，20 30%的患者也发现有PCa。PSA作为PCa血清学标记不能有效地区分早期PCa和前列腺增生，特别是当 PSA为2 lOng/ml时有必要研究新的早期PCa诊断方法，有效地筛查出PSA在2 IOng/ ml范围内的PCa。而DRE的诊断价值稍低，DRE发现的前列腺癌只有33%被证实为早期局限性前列腺癌(Thompson IM, Emst JJ, Gangai MP, et al. Adenocarcinoma of the prostate results of routine urologicalscreening[J]. J Urol, 1984,132(4) :690-692.)，该诊断方法也会造成患者的生理不适。经直肠超声引导穿刺活检是目前临床术前确诊前列腺癌的常用手段，但是比较容易出现一些并发症，例如，出血(如血尿、血便、血精)、疼痛、感染等，并且当检测点数较低时，常出现漏诊的情况。很多遗传病和一些类型的癌症都与染色体发生易位有关。染色体易位是指两条染色体发生断裂后相互交换无着丝粒断片，形成两条新的衍生染色体的现象。易位是比较常见的染色体结构畸变，在各号染色体间都可发生。染色体易位是由2个没有在正常的基因组里共现的基因相互融合而引起的。某些与染色体异位有关的情况经常发生在相同位置或该位置附近。经常发生断裂的染色体区域称为断裂区。现已知，大约有80 %的前列腺癌患者存在TMPRSS2基因(Genbank登录号为 7113)与ETS基因家族的融合，包括与ERG Qlq22) (Genbank登录号为2078)、ETVl (7p21) (Genbank登录号为2115)、ETV4(17q21) (Genbank登录号为2118)基因的融合改变，发生机理为发生断裂的TMPRSS2基因与发生断裂的ETVl基因相互融合，导致21号染色体与7号染色体发生相互易位；位于21号染色体的ERG基因发生断裂，与TMPRSS2基因发生融合，形成21号染色体重组；发生断裂的TMPRSS2基因与发生断裂的ETV4基因相互融合， 导致21号染色体与17号染色体发生相互易位(Recurrent Fusion of TMPRSS2 and ETS Transcription FactorGenes in Prostate Cancer Scott A. Tomlins Daniel R. Rhodes SvenPerner Science 310,644 (2005)；以及 Maisa Yoshimoto, Anthony M. Joshua, Susan Chilton-MacNeill, et al Neoplasia, June 2006,8(6) :465-469 Three—Color FISH Analysis of TMPRSS2-ERG Fusions inProstate Cancer)。禾中☆巾，
TMPRSS2与ERG融合基因可能还可以预测PCa的进展，有报道，缺乏ERG基因改变的PCa患者的8年生存率达90%。荧光原位杂交技术是一种检测遗传学改变的分子细胞技术，能够在细胞核、染色体水平上显示基因数量、结构的变异。荧光原位杂交技术用荧光染料标记的核酸作为探针， 按照碱基互补的原则，与待检材料中目的核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸，在荧光显微镜下观察并记录结果。荧光原位杂交技术具有操作简单，重复性好、灵敏性及特异性高的特点；比传统方法可更早发现细胞异常，能大幅度降低漏诊率；FISH检测前列腺癌的临床检测敏感性达到 80% 以上，特异性近 100% (Tomlins SA，Mehra R, Rhodes DR, et al. . TMPRSS2 :ETV4 genefusions define a third molecular subtype of prostate cancer. CancerRes.， 2006)，能够为临床提供相比PSA筛查和穿刺活检更为准确、客观的诊断指标，这对于前列腺癌的早期诊断及预后判断有着极其重要的意义。针对现有技术的上述不足，本发明人通过创造性的构思和不懈的实验努力完成了本发明。本发明通过使包含TMPRSS2、ERG、ETVl、ETV4基因的DNA序列带有荧光标记，成为荧光原位杂交探针，通过与从患者身上取得的组织样本等进行杂交，带有荧光标记的原位杂交探针与样本的TMPRSS2、ERG、ETVl、ETV4基因区依次按照碱基互补的原理结合，从而将患者的TMPRSS2、ERG、ETVl、ETV4基因结构变异以荧光信号改变的方式显示。本发明的荧光原位杂交探针组的临床检测灵敏度在80%以上，特异性都近 100%，并具有取材方便等优势，比起传统的前列腺癌检测技术更具有先进性。
发明内容
本发明的一个方面是提供用于检测前列腺癌的检测剂，所述检测剂为选自如下的三个探针组(GLP TMPRSS2/ETV1探针组、GLPERG探针组、GLP TMPRSS2/ETV4探针组)中的至少一个1)GLP TMPRSS2/ETV1 探针组包括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针、以及第六探针，其中第一探针、第二探针、和第三探针都是带有第一荧光标记的核酸序列，并且这三个探针各自的核酸序列合起来包含TMPRSS2基因(SEQ ID N0:1)的全部核酸序列以及染色体 21q22上的TMPRSS2基因5，末端以外70kb 170kb的核酸序列和/或3，末端以外150kb 250kb的核酸序列，第四探针、第五探针、和第六探针都是带有第二荧光标记的核酸序列，并且这三个探针各自的核酸序列合起来包含ETVl基因(SEQID NO 2)的全部核酸序列以及染色体7p21
6上的ETVl基因5，末端以外1001Λ 2001Λ的核酸序列和/或3，末端以外801Λ 1801Λ 的核酸序列，所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同。在本发明的一个实施方案中，第一探针、第二探针、和第三探针合起来的核酸序列 (参见附
图1A)为大约3701Λ，这些探针的序列选自购买的BAC clone(购自Children，s Hospital of Oakland ResearchInstitute(CHORI)或 invitrogen)RP11-814F13(其插入片断起止位置chr21 :41704419-41876631, SEQ ID NO :5)、RP11-671L10 (其插入片断起止位置chr21 :41709062-41876646, SEQ ID NO :6)、AL773578 (其插入片断起止位置 chr21 :41559315-41716976, SEQID NO 7)、RP11-635F7 (其插入片断起止位置:chr21 41570022-41735879, SEQ ID NO :8)、以及 CTD-2337B13 (其插入片断起止位置chr21 41896060-41939772，SEQ ID NO :9)中的3个克隆的插入片段，并且优选如下的2组 RP11-814F13、RP11-635F7、CTD-2337B13 或者 RP11-671L10、AL773578、CTD-2337B13，这 2 组探针各自的核酸序列合起来约3701Λ，包含TMPRSS2基因的全部核酸序列和染色体21q22 上的TMPRSS2基因5’和/或3’末端以外的部分序列。在本发明的一个实施方案中，第四探针、第五探针、和第六探针合起来的核酸序列 (参见附图1B)为大约3501Λ，这些探针的序列选自购买的BAC clone(购自Children，s Hospital of Oakland ResearchInstitute(CHORI)或 invitrogen)RPl1-79G16(其插入片断起止位置chr7 :13785785-13935899, SEQ ID NO :10)、RP11-692G10 (其插入片断起止位置chr7 13782597-13947348，SEQ ID NO :11)、RP4-685A2 (其插入片断起止位置:chr7 :13887063-13996421, SEQ IDNO :12)、CTD-2134C13 (其插入片断起止位置chr7 13915125-13973529，SEQ ID NO :13)、AC004909 (其插入片断起止位置 chr7 :13996222-14128271, SEQ ID NO :14)、RP11-313C20 (其插入片断起止位置chr7 13975267-14159425，SEQ ID NO :15)中的3个克隆的插入片段，并且优选如下的2组 RP11-79G16、RP4-685A2、RP11-313C20 或者 RP11-692G10、CTD-2134C13、AC004909，这两组探针各自的核酸序列合起来约3501Λ，包含ETVl基因的全部核酸序列和染色体7p21上的 ETVl基因5’和/或3’末端以外的部分序列。在本发明的一个实施方案中，第一探针、第二探针、和第三探针用红色荧光标记， 第四探针、第五探针、和第六探针用绿色荧光标记，用于检测TMPRSS2/ETV1基因融合，相对于现有技术，本发明的探针组覆盖范围更大，在荧光显微镜下的肉眼检测效果更为显著，并且由于调换标记的颜色，使用更多克隆的插入片段，能够使探针的信号得到显著增强，更有利于观察结果。2) GLP ERG 探针组包括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针，其中第一探针、第二探针都是带有第一荧光标记的核酸序列，并且这两个探针各自的核酸序列合起来包含ERG基因(SEQ ID NO 3)的一部分核酸序列和染色体21q22上的ERG 基因5，末端以外的1601Λ 2601Λ的核酸序列，第三探针、第四探针都是带有第二荧光标记的核酸序列，并且这两个探针各自的核酸序列合起来包含ERG基因的一部分核酸序列和染色体21q22上的ERG基因3’末端以外的1801Λ ^Olib的核酸序列，
并且所述四个探针各自的核酸序列合起来要包含ERG基因的全部核酸序列，所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同。在本发明的一个实施方案中，第一探针和第二探针合起来的核酸序列(参见附图2)为大约320kb，这些探针的序列选自购买的BACclone (购自Children，s Hospital of Oakland Research Institute(CHORI)或 invitrogen)中的 3 个克隆 RP11-476D17 (其插入片断起止位置chr21 :38604838-38785541, SEQ ID NO: 16)、CTD-3244I3 (其插入片断起止位置chr21 :38468179-38608049, SEQ ID NO :17)、CTD-2341018 (其插入片断起止位置:chr21 :38465658-38646411, SEQ ID NO :18)的插入片段，其中优选如下的2组， RP11-476D17、CTD-2341018 或者 RP11-476D17、CTD-3244I3，这组探针各自的核酸序列合起来为大约3201Λ，包含ERG基因的一部分核酸序列和染色体21q22上的ERG基因靠近着丝粒端的部分序列。在本发明的一个实施方案中，第三探针和第四探针合起来的核酸序列(参见附图2)为大约320kb，这些探针的序列选自购买的BACclone (购自Children，s Hospital of Oakland Research hstitute (CHORI)或 invitrogen)中的 3 个克隆 RP11-95I21 (其插入片断起止位置chr21 :38821491-39010973, SEQ ID NO :19)、CTD-2506J13 (其插入片断起止位置chr21 :38999889-39191869, SEQ ID NO :20)、RP11-259A4(其插入片断起止位置chr21 :39012507-39144422, SEQ ID NO :21)的插入片段，并且优选如下的2组 RPl 1-95121、RPl 1-259A4或者RPl 1-95121、CTD-2506J13，这两组探针各自的核酸序列合起来为大约3201Λ，包含ERG基因的一部分核酸序列和染色体21q22上的ERG基因靠近端粒端的部分序列。在本发明的一个实施方案中，这4个探针将ERG基因分成两段，靠近着丝粒端的第一探针和第二探针用绿色荧光标记，靠近端粒端的第三探针和第四探针用红色荧光标记， 用于检测ERG基因断裂的克隆插入片段覆盖范围大于现有技术，且在仅选用双色标记的情况下，可以检测到更多的范围，不光包括ERG基因与TMPRSS2基因的融合，更包括ERG基因与非TMPRSS2基因融合的情况，用更容易在荧光显微镜下判断的简单的双色搭配，检测更多的异常类型是本探针设计的优势。3) GLP TMPRSS2/ETV4 探针组包括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针、第六探针以及第七探针，其中第一探针、第二探针、第三探针、和第四探针都是带有第一荧光标记的核酸序列， 并且这四个探针各自的核酸序列合起来TMPRSS2基因的全部核酸序列和染色体21q22上的 TMPRSS2基因5，末端以外801Λ 1801Λ的核酸序列和/或3，末端以外的1501Λ 2501Λ 的核酸序列，第五探针、第六探针、和第七探针都是带有第二荧光标记的核酸序列，并且这三个探针各自的核酸序列合起来包含ETV4基因(SEQID NO 4)的全部核酸序列和染色体17q21 上的ETV4基因5，末端以外180kb 280kb的核酸序列和/或3，末端以外150kb 250kb 的核酸序列，所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同。在本发明的一个实施方案中，第一探针、第二探针、第三探针、第四探针合起来
8的核酸序列(参见附图3A)为大约3801Λ，这些探针的序列选自购买的BAC clone(购自 Children' s Hospital of OaklandResearch Institute (CHORI)或 invitrogen) RP11-814F13、RP11-671L10、AL773578、RP11-635F7、CTD-2337B13 以及 CTD_3095D11(其插入片断起止位置chr21 :41拟4082-41952283，SEQ ID NO :22)中的4个克隆的插入片段，其中优选如下的 2 组RP11-814F13、RP11-635F7, CTD-2337B13、CTD-3095D11 或者 RP11-671L10、AL773578、CTD-2337B13、CTD-309OT11，这2组探针各自的核酸序列合起来为大约3801Λ，包含TMPRSS2基因的全部核酸序列和染色体21q22上的TMPRSS2基因5，和/ 或3’末端以外的部分序列。在本发明的一个实施方案中，第五探针、第六探针和第七探针合起来的核酸序列为大约3501Λ (参见附图;3B)，这些探针的序列选自购买的BAC clone (购自Children，s Hospital of Oakland ResearchInstitute(CHORI) invitrogen)CTD-2326M16( ^ 插入片断起止位置chrl7 :38879789-38997637, SEQ ID NO 23)、CTD_2321N2(其插入片断起止位置chrl7 :38899792-38997630, SEQ ID NO :24)、AC087650 (其插入片断起止位置chrl7 :38762437-38932045, SEQ ID NO :25)、CTD-3215I16 (其插入片断起止位置chrl7 :38799094-38869021, SEQ ID NO :26)、CTC-420I11 (其插入片断起止位置chrl7 :38997631-39134026, SEQ ID NO :27)、AC068675 (其插入片断起止位 g :chrl7 :38926965-39091575, SEQ ID NO :28)、RP11-147C10 (其插入片断起止位置: chrl7 :39020689-39205553, SEQID NO :29)中的3个克隆的插入片段，并且优选为如下的 2 组CTD-2326M16、CTD-3215I16、CTC-420I11 或者 CTD-2321N2、AC087650、AC068675、 RP11-147C10，这两组探针各自的核酸序列合起来为大约3501Λ，包含ETV4基因的全部核酸序列和染色体17q21上的ETV4基因5’和/或3’末端以外的部分序列。需要说明的是，用于检测TMPRSS2/ETV4基因融合的克隆插入片段的覆盖范围超出现有技术，在荧光显微镜下的肉眼检测效果更为显著，使用更多的克隆能够使探针的信号得到显著增强，更有利于观察结果。在本发明的一个实施方案中，探针组中的探针序列为上述3个探针组中的探针的互补序列，或者选自如下的变体1)在高等严紧条件下与上述3个探针组中的探针的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，2)对上述3个探针组中的探针的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、 添加修饰的核苷酸序列，3)与上述3个探针组中的探针的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5°C (低于探针Tm 5°C )；“高等严紧性”发生在Tm以下约5_10°C；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20°C ；“低严紧性”发生在Tm以下约20_25°C。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6XSSC =极低严紧性；3XSSC =低至中等严紧性；IXSSC =中等严紧性； 0. 5XSSC =高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80%或更多序列同一性的核酸序列。对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如， 选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring HarborPress, Plainview, N. Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液预洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中杂交过夜；随后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗涤两次20分钟。 本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本发明中，所述对上述3个探针组中的探针的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’ 端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与上述3个探针组中的探针的核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在上述3个探针组中的探针的核苷酸序列之每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸，参考序列中多达5%的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5% ；或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5%。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。在本发明中，所述与上述3个探针组中的探针的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列包括与上述3个探针组中的探针所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90%序列同一性、优选至少91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98% 或99%或更高的序列同一性的那些序列。关于探针的标记方法，可以采用现有技术中的方法使DNA序列带有相应的荧光标记。所述方法包括但不限于采用随机引物法、切口平移法等。随机引物法利用6个碱基的寡核苷酸作引物，在大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段的催化下，沿单链模板起始DNA的合成。如果寡核苷酸的序列不均一，它们就可在模板的多位点上与模板杂交(所述方法具体可以参见，例如，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的 《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)切口平移法需要用两种不同的酶活性参与反应，限制性内切酶DNA酶I可在双链靶DNA两条链上的随机位点切口磷酸二酯键，大肠杆菌DNA聚合酶I则将脱氧核糖核苷酸加到DNA酶I产生的3’羟基端。DNA聚合酶I除具有聚合酶活性，还具有5’ -3’外切核酸酶活性，因而能从切口 5’端去除核苷酸。5’端核苷酸的去除与荧光带有荧光标记的核苷酸的掺入同时进行，使切口沿着DNA链移动，产生高活性比的标记DNA(所述方法具体可以参见，例如，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)所用荧光标记可以是本领域中已知的荧光标记染料，例如下面的表1所示的荧光染料。表1可选用荧光染料，其激发及发射波长
权利要求
1.用于检测前列腺癌的检测剂，所述检测剂为选自如下的三个探针组中的至少一个 1)GLPTMPRSS2/ETV1 探针组包括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针、以及第六探针，其中第一探针、第二探针、和第三探针都是带有第一荧光标记的核酸序列，并且这三个探针各自的核酸序列合起来包含TMPRSS2基因的全部核酸序列以及染色体21q22上的TMPRSS2 基因5，末端以外701Λ 1701Λ的核酸序列和/或3，末端以外1501Λ 2501Λ的核酸序列，第四探针、第五探针、和第六探针都是带有第二荧光标记的核酸序列，并且这三个探针各自的核酸序列合起来包含染色体7p21上的ETVl基因5’末端以外1001Λ 2001Λ的核酸序列和/或3，末端以外801Λ 1801Λ的核酸序列， 所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同；2)GLP ERG探针组包括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针，其中第一探针、第二探针都是带有第一荧光标记的核酸序列，并且这两个探针各自的核酸序列合起来包含ERG基因的一部分核酸序列和染色体21q22上的ERG基因5’末端以外的 160kb ^Olib的核酸序列，第三探针、第四探针都是带有第二荧光标记的核酸序列，并且这两个探针各自的核酸序列合起来包含ERG基因的一部分核酸序列和染色体21q22上的ERG基因3’末端以外的 180kb ^Olib的核酸序列，并且所述四个探针各自的核酸序列合起来要包含ERG基因的全部核酸序列， 所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同；和3)GLP TMPRSS2/ETV4 探针组包括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针、第六探针以及第七探针，其中第一探针、第二探针、第三探针、和第四探针都是带有第一荧光标记的核酸序列，并且这四个探针各自的核酸序列合起来TMPRSS2基因的全部核酸序列和染色体21q22上的 TMPRSS2基因5，末端以外801Λ 1801Λ的核酸序列和/或3，末端以外的1501Λ 2501Λ 的核酸序列，第五探针、第六探针、和第七探针都是带有第二荧光标记的核酸序列，并且这三个探针各自的核酸序列合起来包含ETV4基因的全部核酸序列和染色体17q21上的ETV4基因5’ 末端以外1801Λ 2801Λ的核酸序列和/或3，末端以外1501Λ 2501Λ的核酸序列， 所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同。
2.根据权利要求1所述的检测剂，其中，所述探针分别以包含TMPRSS2、ERG、ETV1、ETV1 这4个基因的核酸序列的克隆插入片段作为探针制备的模板，采用随机引物法或切口平移法进行荧光标记，优选地，所述三个探针组中的第一荧光标记都是四甲基罗丹明，第二荧光标记都是异硫氰酸。
3.根据权利要求2所述的检测剂，其为选自如下的三个探针中的至少一个探针组 1)GLP TMPRSS2/ETV1 探针组第一探针、第二探针、和第三探针分别以选自BAC cloneRPll-814F13、RP11-671L10、AL773578、RP11-635F7、以及CTD-2337B13中的3个克隆的插入片段作为探针制备的模板， 并且优选地，这 3 个克隆是 RP11-814F13、RP11-635F7, CTD-2337B13 或者 RP11-671L10、 AL773578、CTD-2337B13，第四探针、第五探针、和第六探针分别以选自BAC cloneRPll-79G16、RP11-692G10、 RP4-685A2、CTD-2134C13, AC004909、RP11-313C20 中的 3个克隆的插入片段作为探针制备的模板，并且优选地，这3个克隆是RP11-79G16、RP4-685A2、RP11-313C20或者 RP11-692G10、CTD-2134C13、AC004909 ；2)GLP ERG探针组第一探针、第二探针分别选自以 BAC clone RP11-476D17, CTD-3244I3, CTD-2341018 中的2个克隆的插入片段作为探针制备的模板，并且优选地，这2个克隆是RP11-476D17、 CTD-2341018 或者 RP11-476D17、CTD-3244I3，第三探针、第四探针分别选自以 BAC clone RPl 1-95121、CTD-2506J13、RPl 1-259A4 中的2个克隆的插入片段作为探针制备的模板，并且优选地，这2个克隆是RP11-95I21、 RP11-259A4 或者 RPl 1-95121、CTD-2506J13 ；3)GLP TMPRSS2/ETV4 探针组第一探针、第二探针、第三探针、第四探选自以BAC cloneRPll-814F13, RP11-671L10、 AL773578、RP11-635F7、CTD-2337B13 以及 CTD-3095D11 中的 4个克隆的插入片段作为探针制备的模板，并且优选地，这4个克隆是RP11-814F13、RP11-635F7, CTD-2337B13、 CTD-3095D11 或者 RP11-671L10、AL773578、CTD-2337B13、CTD-3095D11，第五探针、第六探针、和第七探针分别选自以BAC cloneCTD-2326M16, CTD-2321N2、 AC087650、CTD-3215I16、CTC-420I11、AC068675、RP11-147C10 中的 3 个克隆的插入片段作为探针制备的模板，并且优选地，这3个克隆是CTD-23^M16、CTD-3215I16、CTC-420I11或者 CTD-2321N2、AC087650、RP11-147C10。
4.用于检测前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括溶解在TEBuffer中的权利要求1_3中任一项所述的检测剂，并且所述检测剂中的探针组的浓度为50 300ng/y 1。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其还包括GLP杂交缓冲液；优选地，所述试剂盒还包括缓冲液的储存液、缓冲液、变性液、乙醇溶液、甲酰胺洗涤液、洗涤液、快洗洗涤液、30% (w/v)酸性亚硫酸钠溶液、蛋白酶K储存液、蛋白酶K工作液、以及甲醛固定液。
6.权利要求1-3中任一项所述的检测剂、或者权利要求4或5所述的试剂盒在检测 TMPRSS2基因与ETS家族基因融合中的用途。
7.一种检测TMPRSS2基因与ETS家族基因融合的方法使用权利要求1-3中任一项所述的检测剂、或者权利要求4或5所述的试剂盒，通过荧光原位杂交检测TMPRSS2基因与ETS家族基因的融合状况。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所用检测样本为选自如下的任一种前列腺石蜡包埋组织切片、穿刺、冰冻石蜡组织切片、前列腺分泌液。
9.根据权利要求8所述的方法，还包含如下步骤收集20位正常人的组织样本与探针组杂交，分别分析100个细胞，计算显示异常信号细胞的百分比的平均值及标准差，将平均值+3倍标准差定义为异常阈值；观察待测样本杂交后的整张玻片，确定看到异常细胞区域，分别分析100个细胞，计算显示异常信号细胞的百分比，并与异常阈值相比较，当该百分比大于所述阈值时，样本为阳性；反之样本为阴性。
10.根据权利要求9所述的方法，还包含如下步骤 对于如下的情形不要进行分析1)细胞核轮廓不清或有重叠的计数细胞；2)杂交不均勻的区域；3)背景深影响信号判断的区域；4)超过25%的细胞核内信号太弱的区域；5)超过10%的细胞质内有信号的区域。
全文摘要
本发明涉及用于检测前列腺癌的检测剂和试剂盒。具体地，所述检测剂为选自如下的三个探针组中的至少一个1)GLPTMPRSS2/ETV1探针组；2)GLP ERG探针组；和3)GLPTMPRSS2/ETV4探针组。具体地，所述试剂盒包括溶解在TE Buffer中的所述检测剂，其中所包括的探针组的浓度为50～300ng/μl。本发明还涉及所述检测剂和试剂盒在检测TMPRSS2基因与ETS家族基因融合中的用途、以及一种检测TMPRSS2基因与ETS家族基因融合的方法。
文档编号C12Q1/68GK102162006SQ20101011300
公开日2011年8月24日 申请日期2010年2月20日 优先权日2010年2月20日
发明者吴晓东, 程晓蕾, 阴层层, 陈忠 申请人:北京金菩嘉医疗科技有限公司