专利名称：一种快速高效dna重组的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体为可对靶标DNA进行缺失、突变和插入外源DNA片 段，一种快速高效DNA重组的方法及试剂盒。
背景技术：
DNA重组技术自从20世纪70年代初期问世以来，经过了近40年的发展历程，无论 是在基础理论研究领域，还是在生产实际应用方面，都已经取得了惊人的成绩。DNA重组技 术不仅使整个生命科学的研究发生了前所未有的深刻变化，同时也有力地促进了医学科学 研究的发展，在疾病的临床诊断、遗传病的基因治疗、新型疫苗的研制以及癌症和艾滋病的 研究等诸多科学均已取得了相当的成就。然而，利用限制性内切酶和连接酶为主要工具的传统DNA重组技术，很难对像BAC 文库这样的大分子DNA进行修饰。传统DNA重组技术中，大多要求DNA片段上存在单一的 限制性内切酶位点，而在大分子DNA中一般的内切酶都存在多个位点。另外，大分子DNA的 体外操作困难、易断裂，连接、转化效率也随DNA片段长度的增加而下降。如果可以在细菌体内完成DNA重组操作，将可以解决以上传统DNA重组技术中 存在的不足之处。研究发现，来自发光杆菌(Photorhabdusluminescens)的重组酶—— Plu2935和Plu2936可以在细菌体内协同作用，完成DNA分子之间的重组。Plu2936为5，-3， 核酸外切酶，Plu2935为单链DNA退火蛋白。在进行DNA重组时，Plu2936与双链线性DNA片 段结合并按5，-3，方向降解DNA单链，在另外一条DNA链上产生3，突出端。接着，Plu2935 便与DNA 3，突出端结合，形成蛋白-DNA复合体。在受体DNA进行复制时，蛋白-DNA复合体 寻找同源序列的DNA并退火，新成新的DNA分子。在Plu2935和Plu293重组酶的配合作用 下，带有短同源臂(35 50bp)的供体DNA分子可以在体内重组到受体DNA分子的同源区 域上，从而实现对DNA分子的替换、插入、删除、突变等多种修饰。该重组酶体系对靶标DNA 分子的大小没有限制，不受内切酶位点的限制，不需要体外链接和转化过程，可以对各种大 小DNA分子进行操作，尤其DNA大分子修饰方面具有独特的优势。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种快速高效DNA重组的方法及试剂盒，以 解决背景技术中的问题。一种快速高效DNA重组的方法包括以下两步1.引物设计与PCR扩增因为Plu2935和Plu2936重组酶进行DNA重组时，需要两DNA片段之间有40bp以 上的同源序列，所以在扩增供体DNA的引物5’端应引入40个碱基以上、与受体DNA片段同 源的序列。PCR扩增的条件一般为94°C预变性5min，94°C变性45sec，58°C退火1. 5min， 72°C延伸1 3min(时间长短根据PCR产物大小设定，一般是lmin/lkb DNA)，30个循环， 最后72°C延伸IOmin0
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PCR产物用试剂盒进行纯化，去除模板DNA和剩余的引物。因为模板DNA可能会被 转化进BL-REC的感受态细胞，在抗性平板上生长，给阳性转化子的筛选带来困难。引物则 可以与PCR产物竞争受体DNA的同源序列，从而导致重组效率下降。2. DNA电转化入重组酶表达工程菌的感受态细胞 将纯化的PCR产物(供体DNA)与受体DNA片段按照摩尔比1 1混勻，取DNA混 合物(< IOyg)加入到BL-REC感受态细胞中，混勻后加入到电转杯中，1250v电击一次。 在电击杯中加入ImL复苏液(S0C培养基，0. ImM的MgCl2溶液)，将细菌悬浮并转移至Ep管 中，37°C复苏lh，涂板，37°C倒置培养。挑转化子，对重组DNA进行酶切和PCR鉴定。一种快速高效DNA重组的试剂盒，本发明在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中诱导表达 来自发光杆菌的重组酶基因——plu2935和plu2936，利用重组酶Plu2935和Plu2936共同 作用，在不需要体外酶切、链接的情况下完成DNA重组，达到快速、高效修饰DNA的目的，由 表达重组酶的感受态细胞、对照感受态细胞、标准样品、复苏液组成。在本发明中，所述的重组酶的感受态细胞，由经IPTG诱导过的BL-REC工程菌制 备，所述的BL-REC工程菌，由克隆有发光杆菌重组酶基因的pET32a质粒导入大肠杆菌 BL21 (DE3)中构建而成，所述的发光杆菌重组酶基因，由plu2935和plu2936基因组成的共 表达框，所述的对照感受态细胞，由未经诱导的BL-REC工程菌制备，所述的标准样品，包括 PUC19质粒和含同源序列的氯霉素抗性基因PCR产物组成，氯霉素抗性基因PCR产物，所述 的pUC19质粒，200ng/l·! L的水溶液，所述的氯霉素抗性基因PCR产物，200ng/μ L的水溶 液，所述的复苏液，由SOC培养基和0. ImM MgCl2溶液均勻混合而成。有益效果本发明操作简单，效率较高，尤其在DNA大分子修饰方面具有独特的优势。
图1重组酶Plu2935和Plu2936的工作模型图2重组酶表达质粒pET-plu构建图3试剂盒中标准样品重组效率的检测
具体实施例方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体图示，进一步阐述本发明。一种快速高效DNA重组的方法及试剂盒，首先制备DNA重组试剂盒1.抽提发光杆菌总DNA将发光杆菌接种到LB斜面，30°C培养6 8h进行活化，然后接一环于50ml LB液 体培养基中，30°C，200r/min摇床培养过夜。离心收集菌体，用TES溶液(lOmMTris-HCl， pH8. 0, ImM EDTA, IOOmM NaCl)冲洗一次。离心，沉淀重悬于TEl (25%蔗糖，25mM Tris-HCl, pH8.0,25mM EDTA)中，加入十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度为2 %，混勻使细胞裂解，加入 IM NaCl溶液，37°C温育5min。离心，取上清，等体积酚氯仿抽提，2倍体积乙醇沉淀，70% 乙醇洗涤，吹干，用溶于一定体积的溶液TE2 (lOmMTris-HCl，pH8.0，ImM EDTA)中，再加入 IMNaCl, 10μ g/mlRNase,0. 6mg/ml蛋白酶K，37°C温育30min。等体积酚氯仿抽提，乙醇沉淀，加IOOml水溶解沉淀，_20°C保存。2. PCR 扩增 plu2935 和 plu2936 基因设计引物两对引物Plu5-F/Plu5-R，Plu6_F/Plu6-R。Plu5_F :5，-GCCCATGGCCA TGAGCACAGCAGTACAAAAAG-3‘ (Nco I), Plu5~R :5’ CTAGGGATCCTTATGATGCCTTTTTCC-3，(Bam H I) :Plu6~F 5’ -AAGGATCCCTAGCAGGAGGAATTCATATGATCAGCAATGAACTCATTC-3’ (BamH I)， Plu6~R :5’ GCGAGCTCTCATTTCCATTGATCGCCAAATTTG-3’ (Sac I)。以发光杆菌总 DNA 为模板， 以 Plu5-F/Plu5-R 或 Plu6_F/Plu6_R 为引物，分别 PCR 扩增 plu2935 基因和 plu2936 基因。 PCR 反应条件为94°C预变性 5min，94°C变性 45sec，58°C退火 1. 5min，72°C延伸 1. 5min，30 个循环，最后72°C延伸lOmin。采用试剂盒回收纯化PCR产物，_20°C保存。3.重组酶基因plu2935和plu2936克隆入pET32a载体Nco I和BamH I双酶切pET32a和plu2935基因的PCR产物，连接、转化DH5 α，获 得的质粒命名为pET-plu2935。BamH I和Sac I双酶切pET_plu2935和plu2936基因的 PCR产物，连接、转化DH5a，获得重组酶表达质粒pET-plu。将pET-plu转入宿主菌BL(DE3) 中，获得工程菌BL21-REC。4.制备高效表达重组酶的工程菌感受态细胞将工程菌BL21-REC接入5ml LB培养基中，37°C培养过夜。按2%接种量转接到 50ml LB培养基中，37°C振荡培养1. 5h左右，至OD600值达0. 2 0. 3，加入终浓度为lmmol/ L 的 IPTG，37°C培养 lh，诱导表达重组酶 Plu2935 和 Plu2936。4°C，IOOOOrpm 离心 5min 收 集菌体，倒净培养基，加入IOmL预冷无菌水，充分悬浮菌体。4°C，IOOOOrpm离心5min收集 菌体，倒净无菌水，加入IOmL预冷无菌水，充分悬浮菌体。4°C，IOOOOrpm离心5min收集 菌体，倒净无菌水，加入0. 5mL无菌水悬浮菌体，将感受态细胞按每管50 μ L分装到EP管 中，_80°C保存。5.制备重组效率测试标准样品和对照样品为了检测4中感受态细胞中重组酶Plu2935和Plu2936的重组活性，我们制备了 用于重组效率测定的标准样品，包括氯霉素抗性基因的PCR产物和pUC19质粒。设计引物 对 Chl-F/Chl-R，PCR 扩增氯霉素抗性基因。Chl-F 5’ -ACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAA AGGAAGAGTTACCTGTGACGGAAGATCACTTC-3，(下划线部分40的碱基为pUC19质粒同源序列，其 余部分为卡那霉素抗性基因的引物部分)，Chl-R :5’ -AATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTG GTCTGACAGCATCCGCTTATTATCACTTATTC-3 ‘(下划线部分40的碱基为pUC19质粒同源序列，其 余部分为氯霉素抗性基因的引物部分)。氯霉素抗性基因的PCR产物中存在40bp与pUC19 质粒同源序列。同时，我们还设置了对照感受态细胞(Control)。除了不加入IPTG进行诱导外，对 照感受态细胞的制备与4中表达重组酶的BL21-REC工程菌制备完成一致。因为没有进行 IPTG诱导，对照感受态细胞中没有重组酶Plu2935和Plu2935表达，无法进行DNA重组，在 相应抗生素平板上不会有克隆子出现。一种快速高效DNA重组的方法1.引物设计与PCR扩增因为Plu2935和Plu2936重组酶进行DNA重组时，需要两DNA片段之间有40bp以 上的同源序列，所以在扩增供体DNA的引物5’端应引入40个碱基以上、与受体DNA片段同
5源的序列。PCR扩增的条件一般为94°C预变性5min，94°C变性45sec，58°C退火1. 5min， 72°C延伸1 3min(时间长短根据PCR产物大小设定，一般是lmin/lkb DNA)，30个循环， 最后72°C延伸IOmin0PCR产物用试剂盒进行纯化，去除模板DNA和剩余的引物。因为模板DNA可能会被 转化进BL-REC的感受态细胞，在抗性平板上生长，给阳性转化子的筛选带来困难。引物则 可以与PCR产物竞争受体DNA的同源序列，从而导致重组效率下降。2. DNA电转化入重组酶表达工程菌的感受态细胞将纯化的PCR产物(供体DNA)与受体DNA片段按照摩尔比1 1混勻，取DNA混 合物(< IOyg)加入到BL-REC感受态细胞中，混勻后加入到电转杯中，1250v电击一次。 在电击杯中加入ImL复苏液(S0C培养基，0. ImM的MgCl2溶液)，将细菌悬浮并转移至Ep管 中，37°C复苏lh，涂板，37°C倒置培养。挑转化子，对重组DNA进行酶切和PCR鉴定。利用本发明测定的plu2935和plu2936共表达框序列ATGAGCACAGCAGTACAAAAAGTTTATGAAATCATCAACCCGCTCAAGACTGAATTTGAGCAAATTTGTAGTGAGCCGGGCATAGTATTTAAACGTG
AGTCTGAATTTGCTATGCAGATATTCGCAAATAATGATTTTTTAGCCACAACTGCATTAAATAATCCGGTTTCAGCGCGTAGCGCAGTAATGAACATTGCAGCAATTGGCATTAGTCTAAACCCTGCGCAAAAGCTGGCTTATCTAGTGCCACGAAACAAAAGCGTGTGTCTTGATATCAGTTACATGGGTTTGATGCACATCGCTCAACAATCGGGTGCTATTAAGTGGTGTCAATCCGCTGTTGTTCGAAAAAATGACATATTCAAGCGCACATCTATTGATACTGCGCCAATTCACGAATACAACGAATTCGACACAGCGCAATCGAGGGGGGACATTGTCGGCGCGTATACAGTAATCAAAACGGATGACTGTGATTACATTACTCACACAATGAGAGCATCAGCTATATTTGATATCAGAGATAGATCATCGGCATGGATAGCATATAAAACAAAAGGGAAATCGTGTCCGTGGGTCACGGACGA
GGAACAAATGATTTTAAAAACCGTAGTCAAGCAGGCGGCTAAGTATTGGCCTCGCAGGGAGCGATTAGATAAAGCCATTGACTATGTAAACACAGAGGCGGGTGAAGGAATTGATTTTAGCAAAGGTCAAAACTCTTACATTGACGTAACTCCCGCAGCAGATAGCACAATCGAAAGTATAACAAACTTACTTACAACAATGAATAAAACTTGGGACGATGATTTACTTCCACTTTGTTCAAAGATATTCAGACGACAAATATTATCACCCGCCGAATTAACAGAGTCGGAGGCAATTAAAGCATCTGATTTTTTAAGGAAAAAGGCATCATAAGGATCCCTAGCAGGAGGAATTCATATGATCAGCAATGAACTCATTCTCAGCAAAACAGGGGTTGATTTGCTCACAGTCGAACAGGGAAGTCATGATTGGCAGCGGTTAAGATTGGGAGTAATAACGGCATCGGAAGCCGGAAAAGTGATATCAAAACCGCGTAGTGGTACAAAATGGACAGACATGAAGCTGACATATTTCTATACACTTCTGGGCGAAGTGTGCACAGGTAGTACGCCGGAAGTAAATGCAAAAACATTAGCGTGGGGAAAAAATTACGAAGAATCAGCAAGAGCAACTTTTGAATTTGTAGCTGATGTAAATGTAACGGAAACTTCAATTCTATTTAAAGATGAATCGCTCAGAACCGCATGCTCACCAGATGGTATTTG[0066TAGTGACGGACTTGGGCTTGAACTTAAATGTCCTTTTACTACTGCTGTA[0067TTTATGAAATTCCGCTTGGGTGGTTTTGATGCTATTAAATCTGAATATAT[0068GGCTCAAGTTCAATATTCGATGTGGGTCACAGGTAAAAATGAATGGTAC[0069TTTGCTAATTATGACCCGCGTATGACTCGTGAAGGGATTCATTACGTTGT[0070TGTTGAGCGTGACAACGAATATATGAGTCAGTTTAATGATATGGTTCCC[0071GATTTCATAGAAAAAATGGACGAATCATTAAATGAAATCGGCTTCAAAT[0072TTGGCGATCAATGGAAATGA[0073利用本发明测定的含同源序列的氯霉素抗性基因序列[0074ACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTTACCTGTGA[0075CGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTTGATAC[0076CGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGC[0077ACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGG[0078CGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATG[0079GAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATC[0080GTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAA[0081CCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAA[0082AAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGA[0083TGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGG[0084TGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAAC[0085TGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCA[0086GTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTG[0087GCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAA[0088TCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGAC[0089AACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCG[0090ACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGA[0091TGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGAT[0092GAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTT[0093AAACGCCTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGCTGTC[0094AGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATT[0095以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施
例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也 应视为本发明的保护范围。
权利要求
一种快速高效DNA重组的方法包括以下两步(1).引物设计与PCR扩增Plu2935和Plu2936重组酶进行DNA重组时，需要两DNA片段之间有40bp以上的同源序列，所以在扩增供体DNA的引物5’端应引入40个碱基以上、与受体DNA片段同源的序列。PCR扩增的条件一般为94℃预变性5min，94℃变性45sec，58℃退火1.5min，72℃延伸1～3min(时间长短根据PCR产物大小设定，一般是1min/1kb DNA)，30个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物用试剂盒进行纯化，去除模板DNA和剩余的引物，因为模板DNA可能会被转化进BL REC的感受态细胞，在抗性平板上生长，给阳性转化子的筛选带来困难，引物则可以与PCR产物竞争受体DNA的同源序列，从而导致重组效率下降；(2).DNA电转化入重组酶表达工程菌的感受态细胞将纯化的PCR产物(供体DNA)与受体DNA片段按照摩尔比1∶1混匀，取DNA混合物(＜10μg)加入到BL REC感受态细胞中，混匀后加入到电转杯中，1250v电击一次。在电击杯中加入1mL复苏液(SOC培养基，0.1mM的MgCl2溶液)，将细菌悬浮并转移至Ep管中，37℃复苏1h，涂板，37℃倒置培养。挑转化子，对重组DNA进行酶切和PCR鉴定。
2.一种快速高效DNA重组的试剂盒，其特征在于由表达重组酶的感受态细胞、对照感 受态细胞、标准样品、复苏液组成。
3.根据权利要求2所述的一种快速高效DNA重组的试剂盒，其特征在于所述的重组 酶的感受态细胞，由经IPTG诱导过的BL-REC工程菌制备，所述的BL-REC工程菌，由克隆有 发光杆菌重组酶基因的pET32a质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中构建而成，所述的发光杆菌 重组酶基因，由plu2935和plu2936基因组成的共表达框，所述的对照感受态细胞，由未经 诱导的BL-REC工程菌制备，所述的标准样品，包括pUC19质粒和含同源序列的氯霉素抗性 基因PCR产物组成，氯霉素抗性基因PCR产物，所述的pUC19质粒，200ng/ μ L的水溶液，所 述的氯霉素抗性基因PCR产物，200ng/ μ L的水溶液，所述的复苏液，由SOC培养基和0. ImM MgCl2溶液均勻混合而成。
全文摘要
一种快速高效DNA重组的方法及试剂盒，通过提取发光杆菌的总DNA，以此为模板PCR扩增plu2935和plu2936基因，将plu2935和plu2936基因克隆入pET32a载体，构建获得重组酶表达载体pET-plu，将pET-plu导入BL21(DE3)中，获得可表达重组酶Plu2935和Plu2936的工程菌BL21-REC。IPTG诱导BL21-REC，表达Plu2935和Plu2936重组酶，并制备成感受态细胞。将含有同源序列的两DNA片段工转化入BL21-REC感受态细胞，在相应抗性平板上筛选获得含重组DNA的转化子。
文档编号C12N15/09GK101899431SQ20101011340
公开日2010年12月1日 申请日期2010年2月25日 优先权日2010年2月25日
发明者万俊松 申请人:万俊松