专利名称：一种节杆菌突变株、利用该突变株生产乳糖酶的方法及用乳糖酶制备乳果糖的方法
技术领域：
本发明涉及食品生物技术领域，具体地，涉及一种节杆菌突变株、对其发酵培养生产乳糖酶的方法及用该乳糖酶作为催化剂催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法。
背景技术：
乳果糖(Lactulose，4-0- β -D-galactopy-ranosyl-D-fructose)，又名乳酮糖，是由半乳糖和果糖以β-1，4-糖苷键结合的二糖。1930年，Montgomery首次发现乳果糖，其后，乳果糖的结构和生理功能研究进展迅速。到目前为止，确定乳果糖主要的生理功用有 ⑴促进双歧杆菌增殖，调整肠道菌群平衡；⑵治疗肝性脑病，降低内毒素；⑶导泻作用， 用于慢性便秘；(4)用于监视肠壁的通透性；(5)预防结肠息肉术后复发；(6)增强机体免疫作用；(7)影响营养物质代谢；(8)影响胆汁酸循环和内分泌。目前，乳果糖的制备主要是利用乳糖在碱性介质中异构化，生成乳果糖的化学方法。但是采用碱性试剂为催化剂时，乳糖会降解生成半乳糖及己糖酸，并伴有颜色副产物产生，降低了乳果糖收率，造成产物分离困难。为此，国内外研究人员将乳果糖生产的研究重点集中于不同催化剂的使用和分离方法的开发，例如US 4，957，564与JP 01-193281采用铝酸钠催化体系，并采用硫酸调节PH生成氢氧化铝沉淀，通过去除沉淀进而除去铝离子。 CN1093410采用加热溶解乳糖，然后保持沸腾，滴加碱溶液，反应结束后调节pH至4-4. 5，脱色，采用阴、阳离子交换树脂脱盐，然后真空浓缩、冷却结晶可制得乳果糖浆。但是，产物得率低、工序复杂，成本高仍是化学法乳果糖制备中有待解决的问题。与之相比，酶法乳果糖制备可以避免产物降解和有色副产物生成等问题，目前国内外的研究尚处在起步阶段。因此，开发可以进行酶法转化制备乳果糖的乳糖酶及其微生物生产菌种具有一定的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种可发酵生产乳糖酶的微生物-节杆菌突变株，及利用该突变株生产乳糖酶的方法。本发明的另一个目的是利用上述乳糖酶作为催化剂催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，克服化学法乳果糖制备中产物易降解以及有色副产物难以去除的缺陷。实现上述目的的技术方案如下一种节杆菌突变株，该菌株分类命名为ArthrcAacter sp. jnsb-2,目前该菌株保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，登记入册的编号是CCTCC M 209210， 保藏日期是2009年9月27日。该菌株具有下述性质1、形态特征菌株在乳糖酵母膏蛋白胨固体培养基上生长良好，菌落为淡黄色，电子显微镜下显示细胞为杆状，两端钝圆。2、生理生化特性(1)培养温度在20-37°C。最适温度为30°C。(2)明胶液化淀粉水解阳性。(3)革蓝氏阳性。(4)乳糖发酵阳性。(5) H2S 生成阴性。3、16S rDNA序列分析长度138!3bp，序列与GenBank中的节杆菌属16S rDNA具有较高的同源性，其中与 Arthrobacter sp. CDBU Arthrobacter sp. AGL 5、Arthrobacter sp. 2-12的相似性为99%。上述节杆菌突变株可应用于发酵生产乳糖酶，利用其发酵生产乳糖酶的方法为将菌株经固体斜面活化、种子培养后再进行发酵培养，其中发酵培养的培养基碳源可选用葡萄糖、乳糖、淀粉、麦芽糖或甘油中的任一种，其质量体积比浓度为0. 2% -2% ； 氮源可选用酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、豆粕或玉米浆中的一种或多种，其质量体积比浓度为 0. 5-2.5% ；无机盐可选用硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或氯化铁中的一种或多种，其浓度为0. 05-23mmol/L ；发酵培养的条件为20_37°C培养12_30h ；后将生成的发酵液经 5000rpm-8000rpm离心得到菌体，随后经破碎细胞、10000-12000rpm离心取上清液即为酶液。进一步地，所述发酵培养基的碳源、氮源、无机盐分别优选乳糖、玉米浆、氯化铁。利用上述乳糖酶作为催化剂催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具体为(1)底物溶液的配制用pH5. 5-8. 0的磷酸缓冲液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖的质量体积比浓度为 2-40%，果糖的质量体积比浓度为-20% ；(2)水解和转苷反应向步骤(1)的溶液中加入250-400U/L乳糖酶，在20_40°C反应4_8h，进行水解和转苷反应，得到酶解液；(3)酶解液的后处理向步骤O)中得到的酶解液中加入无水乙醇，使其终浓度为40-70%，经离心后取上清液经60-65°C加热浓缩后处理即可制得乳果糖浆。在利用乳糖酶进行乳果糖合成中，对乳糖和果糖溶液的浓度没有特殊要求，以配出的溶液粘度适合操作为准，反应温度只要是能保持酶活性的均可，水解时间在4小时以上较好。上述合成乳果糖的酶解液可采用如下方法检测在Agilent HP 1100 高压液相色谱仪上，用 SHODEX SHlOll 8mmX 300mm 柱分析。 色谱条件为柱温50°C ；流动相0. 01mol/L H2SO4 ；流速0. 8mL/min ；示差折光检测器检测， 外标法标定，进样量为5 μ L。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果本发明采用节杆菌的乳糖酶将乳糖和果糖合成乳果糖，与现有的化学法制备乳果糖相比，反应条件温和，没有有色副产物生成。将本发明得到的处理后的酶解液按所述检测
4方法检测，结果表明，产物主要是乳果糖，产物纯度较高。本发明筛选得到的微生物菌株-节杆菌突变株，用其产生的乳糖酶制备乳果糖， 反应条件温和，没有有色副产物生成，产物纯度高，易纯化。菌株培养条件粗放，产酶周期短，操作方便。
具体实施例方式以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1本发明的节杆菌突变株ArthrcAacter sp. jnsb-2可应用于发酵生产乳糖酶，具体如下(1)培养基的配制固体培养基蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、NaCll %，pH 7. 0，琼脂2%，121°C灭菌20min。种子培养基蛋白胨1%、酵母提取物0. 5%、NaCll%，pH 7. 0，121°C灭菌20min。 发酵培养基乳糖 2%，酵母膏 1. 4%, FeCl3 1. 5mmol/L, ρΗ7· 0，121°C灭菌 20min。(2)菌种发酵培养将节杆菌突变株ArthrcAacter sp. jnsb-2固体斜面活化Mh，然后接一环此菌至种子培养基，30°C恒温培养12h，摇瓶转速200r/min。将上述种子菌悬液以10% (ν/ν)接种至发酵培养基，25°C恒温培养Mh，摇瓶转速200r/min。(3)将发酵液以8000rpm离心IOmin收集细胞，用同体积磷酸缓冲液(lOmmol/L， pH7. 0)重悬，经超声波破碎细胞，12000rpm，离心lOmin，取上清即为酶液。实施例2与实施例1基本相同，其不同之处在于步骤(1)中所用发酵培养基为乳糖1%，玉米浆2. 2%，氯化铁1. 5mmo 1/L ；步骤 (2)中接种后的发酵培养条件为30°C恒温培养18h，摇瓶转速200r/min。步骤⑶中发酵液以5000rpm离心15min收集细胞，用同体积磷酸缓冲液 (10mmol/L, pH7. 0)重悬，经超声波破碎细胞，lOOOOrpm，离心15min，取上清即为酶液。实施例3与实施例1基本相同，不同之处在于发酵培养基为葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母 0.5%, KH2PO4 20mmol/L, MgSO4. 7H20 2. 7mmol/L ；步骤(2)中接种后的发酵培养条件为 37°C恒温培养12h，摇瓶转速200r/min。实施例1-3均为利用节杆菌突变株生产乳糖酶的方法，其中对发酵培养基的碳源、氮源、无机盐没有特别的限定，菌种的培养条件粗放，操作方便。实施例4利用本发明的经节杆菌突变株生产得到的乳糖酶作为催化剂催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具体为(1)底物溶液的配制用pH5. 5-8. 0的磷酸缓冲液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖浓度为200g/L，果糖浓度为100g/L ；
(2)水解和转苷反应向步骤(1)的溶液中加入300U/L乳糖酶，在37°C反应他，进行水解和转苷反应， 得到酶解液；(3)酶解液的后处理向步骤(2)中得到的酶解液中加入无水乙醇，使其终浓度为60%，12000rpm，离心 lOmin，上清液经60°C加热浓缩。经检测，乳果糖含量为19g/L 。实施例5利用本发明的经节杆菌突变株生产得到的乳糖酶作为催化剂催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具体为(1)底物溶液的配制用pH5. 5-8. O的磷酸缓冲液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖浓度为60g/L，果糖浓度为30g/L ；(2)水解和转苷反应向步骤(1)的溶液中加入250U/L乳糖酶，在40°C反应4h，进行水解和转苷反应， 得到酶解液；(3)酶解液的后处理向步骤(2)中得到的酶解液中加入无水乙醇，使其终浓度为70%，12000rpm，离心 lOmin，上清液经60°C加热浓缩。经检测，乳果糖含量为9g/L。实施例6利用本发明的经节杆菌突变株生产得到的乳糖酶作为催化剂催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具体为(1)底物溶液的配制用pH 5. 5-8. O的磷酸缓冲液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖浓度为400g/L，果糖浓度为200g/L ；(2)水解和转苷反应向步骤(1)的溶液中加入400U/L乳糖酶，在30°C反应他，进行水解和转苷反应， 得到酶解液；(3)酶解液的后处理向步骤(2)中得到的酶解液中加入无水乙醇，使其终浓度为40%，12000rpm，离心 lOmin，上清液经65°C加热浓缩。经检测，乳果糖含量为45g/L。最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种节杆菌突变株，其特征在于，该菌株分类命名为ArthrcAactersp. jnsb-2，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 209210。
2.一种如权利要求1所述的节杆菌突变株的应用，其特征在于，所述的节杆菌突变株应用于发酵生产乳糖酶。
3.一种利用如权利要求1所述的节菌突变株生产乳糖酶的方法，将菌株经固体斜面活化、种子培养后再进行发酵培养，其特征在于发酵培养的培养基碳源可选用葡萄糖、乳糖、淀粉、麦芽糖或甘油中的任一种，其质量体积比浓度为0.2%-2%;氮源可选用酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、豆粕或玉米浆中的一种或多种，其质量体积比浓度为0. 5-2. 5% ；无机盐可选用硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或氯化铁中的一种或多种，其浓度为0. 05-23mmol/L ；发酵培养的条件为20-37°C培养12-30h ；将生成的发酵液经5000-8000rpm离心得到菌体，随后经破碎细胞、10000-12000rpm离心取上清液即为酶液。
4.根据权利要求3所述的利用节杆菌突变株生产乳糖酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基的碳源、氮源、无机盐分别优选乳糖、玉米浆、氯化铁。
5.一种用乳糖酶制备乳果糖的方法，其特征在于，用乳糖酶作为催化剂，以乳糖和果糖为底物制备乳果糖；(1)底物溶液的配制用pH5. 5-8.0的磷酸缓冲液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖的质量体积比浓度为 2-40%，果糖的质量体积比浓度为-20% ；(2)水解和转苷反应向步骤(1)的溶液中加入250-400U/L乳糖酶，在20-40°C反应4_8h，进行水解和转苷反应，得到酶解液；(3)酶解液的后处理向步骤O)中得到的酶解液中加入无水乙醇，使其终浓度为40-70%，经离心后取上清液经60-65°C加热浓缩后处理即可制得乳果糖浆。
全文摘要
本发明属于食品生物技术领域，公开了一种节杆菌突变株Arthrobacter sp.jnsb-2，对其发酵培养生产乳糖酶的方法及用该乳糖酶作为催化剂催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法。本发明以节杆菌突变株jnsb-2作为菌种，保藏号为CCTCC NOM 209210，采用碳源、氮源和无机盐组成的发酵培养基进行发酵培养制得乳糖酶，该乳糖酶可以作为催化剂，以乳糖和果糖为底物，酶法转化制备乳果糖。利用本发明的菌株发酵生产乳糖酶，培养条件粗放、产酶周期短、操作方便；同时利用上述乳糖酶采用酶法转化生产乳果糖，克服化学法乳果糖制备中产物易降解以及有色副产物难以去除的缺陷，产物纯度高。
文档编号C12N1/20GK102168028SQ20101011474
公开日2011年8月31日 申请日期2010年2月26日 优先权日2010年2月26日
发明者刘莉, 唐蕾, 孙慧慧, 张建华, 杨瑞金, 毛忠贵 申请人:江南大学