专利名称：一种高效降解果胶多糖的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种用化学法和酶法相结合降解果胶多糖的方法，尤其涉及一种利用部分酸水解和果胶酶酶解相结合将果胶多糖降解成具有一定生物活性的聚合度为2 11的寡聚半乳糖醛酸的方法。
背景技术：
果胶是一类结构复杂的酸性杂多糖，主要由半乳糖醛酸聚糖(HGA)、鼠李半乳糖醛酸聚糖-I (RG-I)和鼠李半乳糖醛酸聚糖-II (RG-II)三个结构区域构成，其中HGA为光滑区，RG-I和RG-II为须状区。每种果胶随植物来源、组织和发育阶段的不同，其侧链中残基的数目、种类和连接方式以及其它取代基存在的情况都有相当大的变化，体现出果胶多糖在结构上的高度复杂性。目前多是通过降解果胶多糖得到果胶寡糖混合物对其进行结构和活性的研究，果胶寡糖混合物的主要成分是寡聚半乳糖醛酸，寡聚半乳糖醛酸是一类酸性寡糖，由2-20个单半乳糖醛酸分子通过α-1，4糖苷键连接构成，寡聚半乳糖醛酸具有多种生物活性，可以作为植物防御反应的诱导因子，诱导植物的抗性反应；可用作双歧杆菌增殖因子，高效、专一的促进双歧杆菌生长，改善菌群结构；另外，在控制棉花黄萎病、苹果花叶病、辣椒病毒病等方面效果显著。目前果胶多糖的降解方法主要有化学法降解和酶解法降解。化学法降解通常是用酸水解果胶，最大的特点是降解速度快(特别是在加热的条件下)，降解的比较完全，得到大量单糖，寡糖产率低。并且由于在降解过程中引入了各种反应试剂，使得对其降解反应过程的控制难度增大，也使得降解产物的分离纯化工作不易进行下去。因此，目前较少采用单纯酸水解的方法制备寡聚半乳糖醛酸。酶法降解果胶多糖，即选用特定的一种或几种酶对果胶分子进行降解，让其选择性地切断果胶分子中的α -1，4糖苷键，从而制得特定的果胶寡糖。该方法降解果胶多糖不发生副反应，反应条件温和，工艺较易控制，对果胶分子结构几乎没有破坏，是一种较为理想的降解方法。但是，由于果胶结构非常复杂，分子量大，分子中微环境影响果胶酶与作用位点的接触，用果胶酶直接对果胶降解有一定的局限性，降解效率低，寡糖收率低，较难选择合适的酶高效地制备果胶寡糖。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种寡聚半乳糖醛酸含量高且聚合度较高的高效降解果胶多糖的方法。本发明的技术解决方案是本发明提供了一种高效降解果胶多糖的方法，其特殊之处在于所述高效降解果胶多糖的方法包括以下步骤1)果胶多糖的部分酸水解，其具体实现方式是1. 1)将果胶以 2%的质量浓度溶解在0. 5 1. 5mol/L的酸溶液中；1. 2)将步骤1. 1)所得到的溶液在60 100°C水浴中部分酸水解3 7h，反应完成后旋转蒸发蒸干；1. 3)加入上述酸溶液1/4 1/8体积的蒸馏水，充分振荡，离心，上清和沉淀分别收集合并，得到上清与沉淀两个组分；2)对步骤1. 3)所得到的沉淀进行酶解，其具体实现方式是2. 1)将步骤1. 3)制得的果胶沉淀组分以1 % 2%的质量浓度溶于pH 4 5的醋酸钠缓冲液；2.2)将步骤2.1)所得到的溶液用浓度为0.025 0. lmg/ml的果胶酶酶解 IOmin 4h，皂化，中和后除盐，冷冻干燥，得果胶寡糖混合物。上述酸溶液是硫酸溶液、盐酸溶液、三氟乙酸溶液或磷酸溶液。上述步骤2. 2)中的皂化条件是0. 5 lmol/L NaOH溶液室温皂化20min lh。本发明的优点是1、本发明所提供的高效降解果胶多糖的方法在果胶多糖部分酸水解时优选的酸溶液为三氟乙酸，酸水解后，通过多次旋转蒸发除去三氟乙酸，可避免在降解后引入其他的反应试剂，使样品的后续处理过程简单化；2、本发明所提供的高效降解果胶多糖的方法在部分酸水解过程可以降解掉果胶多糖中大部分的中性糖，糖醛酸主要存在于沉淀组分中，因此酶解沉淀组分可高效制备聚合度为2 11的寡聚半乳糖醛酸，为后续的寡聚半乳糖醛酸纯品的分离，活性及其结构的鉴定奠定了基础。
图ι为本发明中果胶多I■的单糖组成HPLC图2为本发明中果胶多II酸水解上清组分的单II组成HPLC图
图3为本发明中果胶多II酸水解沉淀组分的单II组成HPLC图
图4为本发明中果胶寡I■混合物的TLC图5为本发明中果胶寡I■混合物的MS图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明本发明提供了一种高效降解果胶多糖的方法，包括以下步骤1、将2g果胶以的质量浓度溶解在0. 5mol/L的三氟乙酸(TFA)中，在80°C水浴中酸水解5h，反应完成后旋转蒸发蒸干，加入上述反应1/6体积的蒸馏水，充分振荡，离心，上清和沉淀分别收集合并，得到上清与沉淀两个组分。上清0.591g，沉淀1. 142g，得率可达86. 65%，其中沉淀部分含量约是上清部分的两倍。上清组分通过荧光辅助糖电泳(FACE)检测，电泳图谱显示上清组分也是果胶寡糖混合物。分别将果胶，果胶上清及沉淀完全酸水解后采用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC) -HPLC 柱前衍生化法测定各部分的单糖组成，所得的液相色谱图如图1，2，3所示。图中各个色谱峰按出峰顺序依次为 1. GalA,2. Gal,3. Glc,4. Ara,5. Xyl、6. Rha。液相色谱条件色谱柱为C18反相柱，流动相为观72的乙腈-水(0. lmol/L的
4醋酸铵缓冲液，PH = 4. 3)，流速为lml/min，检测器为紫外检测器。与混合单糖标准图谱比较计算各组分的单糖组成如表1所示。根据各单糖分子量及其在各组分中的摩尔百分含量结合实际制备量计算可得，上清组分为含中性糖较多的果胶寡糖混合物，而果胶中79. 48%的(ialA都存在于部分酸水解后所得的沉淀中，沉淀中 feilA的含量(质量百分含量)高达98. 22%，只含有微量其它单糖，因此，用果胶酸水解后所得的沉淀为原料，是制备寡聚半乳糖醛酸的有效方法。表1果胶、上清与沉淀的单糖组成比例
单糖(摩尔百分含量)XylGlcAraRhaGalGalA果胶0. 391. 562. 854. 4011. 4879. 32上清0. 724. 235. 6313. 3423. 1452. 94沉淀0. 530. 200. 230. 910. 2997. 842、取实施例1中的果胶沉淀组分以的质量浓度溶于pH 4.5的醋酸钠缓冲 ^43^ ] 0. 05mg/ml 白勺胃月交_ (Pectinase from Aspergillus niger, Fluka) 角军 60min,酶解后的混合物用0. 5mol/L NaOH室温皂化30min，中和后除盐，冷冻干燥，得寡聚半乳糖醛酸混合物。寡聚半乳糖醛酸混合物的TLC图如图1所示，图中1为半乳糖醛酸标准单糖，2为 0. 05mg/ml的酶解液对沉淀酶解60min所得寡糖混合物，A I分别表示半乳糖醛酸及聚合度为2 9的寡聚半乳糖醛酸。纯化后的混合物MS谱图如图2所示，MS峰值与nfeilA对应表见表2。表2nGalA与MS峰值对应表
η(聚合度)1234567891011[M+Na]+217393569745921109712731449162518011977 结果表明，由沉淀组分酶解可得到半乳糖醛酸和聚合度为2 11的寡聚半乳糖醛酸，因此，用果胶部分酸水解后所得的沉淀为原料，是制备寡聚半乳糖醛酸的有效方法，对该混合物进行分离纯化即可得到各个聚合度的半乳糖醛酸纯品。
权利要求
1. 一种高效降解果胶多糖的方法，其特征在于所述高效降解果胶多糖的方法包括以下步骤1)果胶多糖的部分酸水解，其具体实现方式是1. 1)将果胶以 2%的质量浓度溶解在0. 5 1. 5mol/L的酸溶液中；1. 2)将步骤1. 1)所得到的酸溶液在60 100°C水浴中部分酸水解3 7h，反应完成后旋转蒸发蒸干；1.3)加入上述酸溶液1/4 1/8体积的蒸馏水，充分振荡，离心，上清和沉淀分别收集合并，得到上清与沉淀两个组分；2)对步骤1.3)所得到沉淀进行酶解，其具体实现方式是2.1)将步骤1. 3)制得的果胶沉淀组分以 2%的质量浓度溶于pH 4 5的醋酸钠缓冲液；2. 2)将步骤2. 1)所得到的溶液用浓度为0. 025 0. lmg/ml的果胶酶酶解IOmin 4h，皂化，中和后除盐，冷冻干燥，得果胶寡糖混合物。
2.根据权利要求1所述的高效降解果胶多糖的方法，其特征在于所述酸溶液是硫酸溶液、盐酸溶液、三氟乙酸溶液或磷酸溶液。
3.根据权利要求1或2所述的高效降解果胶多糖的方法，其特征在于所述步骤2.2) 中的皂化条件是0. 5 lmol/L NaOH溶液室温皂化20min lh。
全文摘要
本发明提供了一种高效降解果胶多糖的方法，该方法包括以下步骤1)果胶多糖的部分酸水解；2)对步骤1)所得到产物的酶解。本发明提供了一种寡聚半乳糖醛酸含量高且聚合度较高的高效降解果胶多糖的方法。
文档编号C12P19/14GK102191298SQ201010115598
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月1日 优先权日2010年3月1日
发明者王仲孚, 黄琳娟 申请人:西北大学