专利名称：一种定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法
技术领域：
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及利用调控技术分别定向催化合成胞苷磷
酰化合物的方法。
背景技术：
胞苷二磷酸(CDP)作为胞嘧啶的衍生物，是一种重要的生化试剂。它和二磷酸肌 苷在核苷酸磷酸酶的作用下制备聚肌胞(Poly I:C)。聚肌胞是一种高效的干扰素诱导剂， 具有广谱抗病毒及免疫抑制作用，广泛用于多种疾病的治疗。 胞苷三磷酸(CTP)是三分子的磷酸结合在胞苷核糖5' -OH基上的核苷酸，是机体 细胞内的一种正常成分，分布广泛，是RNA合成的直接前体。它在体内参与核酸和磷脂类 (卵磷脂，脑磷脂，丝氨酸磷脂、鞘磷脂等)的生物合成过程，磷脂是神经组织的重要成分， 也是一种天然的脂肪乳化剂，具有健全大脑和神经组织，增强智力和记忆力并有促进体内 胆固醇、脂肪的运输，改善脂肪代谢，从而防止堆积的作用。CTP作为生化药物广泛用于治疗 多种神经、血管疾病。 胞二磷胆碱(CDPC)，又称胞磷胆碱钠，是脑代谢激活剂，可促进神经细胞膜卵磷脂
的合成，具有修复脑损伤，抗缺氧，改善记忆，增强智力的作用，临床应用较广。所以，胞二磷
胆碱的合成技术是人们比较关心的研究课题。 CDP、 CTP和CDPC均属于胞苷磷酰化合物的范畴。 目前，文献上所述的CDP制备方法有化学合成法和生物合成法两种。化学合成法 是以CMP为反应物，用二苯磷酰氯磷酸化，再精制得CDP。该法用到多种易挥发的有毒试 剂，操作环境恶劣，而且存在得率低，成本高的问题(Biochim.Biophys. Acta. ，1964,91(1): 1-13)。生物合成法分为两步，先将CMP合成CTP，再将CTP降解生成CDP，可得到高纯度的 CDP，得率在70X以上(化学与生物工程，2005，22(7) :52-54)。 CTP可以利用微生物(以啤酒酵母为主)细胞酶系合成。该工艺所需酵母的来源 广，成本低，受季节限制少；并且产率较高，具有挖掘改进潜力。是目前三磷酸胞苷主要的生 产方式之一。据报导，Kilajima等利用酵母，从CMP合成CTP，反应得率为80 % (HakkoKogaku Zasshi. 1970,48(12) :753-762)。 目前常用CDPC合成方法是微生物转化法，利用微生物的细胞酶系合成。在酵母细 胞中，CMP可以在核苷酸激酶的催化下合成CDP ;CDP可以在核苷二磷酸激酶的作用下生成 CTP，胆碱可以在胆碱激酶的催化下合成磷酸胆碱。然后CTP和磷酸胆碱经磷酸胆碱胞苷 转移酶催化可以生成CDPC与焦磷酸。但是由于细胞酶系复杂，存在反馈调节作用，转化率 普遍偏低，发酵周期太长，致使转化率、产品浓度较低，反应液中存在大量副产物，包括CMP、 CDP和CTP。目前国内还没有利用同一反应体系通过控制反应温度和时间定向催化合成胞 苷磷酰化合物的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种微生物细胞定向催化合成上述三种胞苷 磷酰化合物的方法。 为解决上述技术问题，本发明的思路是 鉴于CDPC的制备过程中，需要消耗大量的能量(ATP)，因此在胞苷磷酰化合物的 制备过程中需要两个酶系即ATP的再生体系和胞苷磷酰化合物合成酶系。ATP的再生体系 以廉价的葡萄糖为底物，通过糖酵解途径(EMP)来实现，该途径是能量再生的最经济的途 径之一 ；胞苷磷酰化合物合成酶系由核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、胆碱激酶和磷酸胆碱胞 苷转移酶构成。 在CDPC合成的整个过程中，胞苷磷酰化合物合成酶系由核苷酸激酶、核苷二磷酸 激酶、胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶起着关键作用。啤酒酵母中的这些酶分别具有不同 的最适温度。四种酶最适温度分别为胞苷酸激酶，25t:;核苷二磷酸激酶，37t:;胆碱激酶， 30°C ;磷酸胆碱胞苷转移酶，3(TC。我们可以通过控制反应温度及时间来生产CDP、CTP和 CDPC中任意一种产品。
本发明的关键在于 1)本发明采用了全细胞催化技术，直接利用了细胞的自有酶系催化CMP合成三种 胞苷磷酰化合物，可以根据需求生产三种物质的任意一种，反应体系简单，无毒，生产成本 低廉。 2)本发明通过控制反应温度作为手段，影响胞苷磷酰化合物合成过程中相关酶的 活性。在不同温度下，会有利于合成一种物质的酶活性得到加强，同时有利于生成其他物质 的酶活性则削弱，这种酶的活性的选择性决定了反应不同的最终产物。控制手段简单易行， 极大方便了工业化中的生产控制。
本发明的具体技术方案如下 —种定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，以CMP、氯化胆碱和磷酸根离子为底 物，以葡萄糖作为能量供体，利用有透性的微生物细胞为酶源，通过改变反应温度为手段， 促使反应体系生物催化合成胞苷磷酰化合物。 其中，所述胞苷磷酰化合物为胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)或CDP-胆碱
(CDPC)，其结构式如下<formula>formula see original document page 6</formula>
其中，胞苷一磷酸，即CMP，其结构式如下
10的水溶液中进行如下三
34"C，反应9
34"C，反应9
15小时，主 15小时；再
<formula>formula see original document page 6</formula> 上述定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法为在pH5 种反应之一，定向合成胞苷磷酰化合物
(a)在28 4(TC下，反应3小时，主要产物为CTP ;
(b)在28 4(TC下，反应3小时；再调整温度至28 要产物为CDPC ; (c)在28 4(TC下，反应3小时；再调整温度至28 调整温度至20 27°C，反应6 10小时，主要产物为CDP。 其中，底物CMP的起始反应浓度为10 100mmol/L，优选20 50mmol/L ;氯化胆碱 的起始反应浓度为10 300mmol/L，优选20 150mmol/L ;磷酸根离子的起始反应浓度为 0. 1 2mol/L，优选0. 2 0. 5mol/L ;葡萄糖的起始反应浓度为0. 1 lmol/L，优选0. 2 0. 5mol/L ;微生物细胞的加入量为按湿菌体计100 800g/L，优选200 600g/L。磷酸离 子可选自正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸等多磷酸，磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等无机 磷酸盐。 其中，反应体系还加入Mr^+离子和二硫苏糖醇的组合物；Mn"起始反应浓度为1 200mmol/L，优选10 100mmol/L ;二硫苏糖醇起始反应浓度为1 200mmol/L，优选10 100,1/L。 其中，所述的微生物细胞是指能够利用CMP合成CDPC的微生物，包括气杆菌属、埃希氏菌属、赛氏杆菌属、微球菌属的细菌；酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德 巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属和酒香酵母属的酵母。优选大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或白球拟酵母。 其中，所述的有透性的微生物细胞是指通过化学、物理或生物方法处理过的细胞 膜的通透性改变过的微生物细胞，具体方法包括表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法、超声 波处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌酶法。 表面活性剂法中使用的表面活性剂为非离子型表面活性剂聚环氧乙烷胺或曲 拉通X-100、阳离子型表面活性剂十六烷基三甲胺 溴化物，或者阴离子表面活性剂月桂 酰 肌氨酸盐，使用量为0. 1 50g/L，优选1 20g/L，即表面活性剂法处理酵母细胞时， 将表面活性剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入0. 1 50g，优选加入1 20g。 有机溶剂法中使用的有机溶剂为二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，使用量
为0. 1 50mL/L，优选1 20mL/L，即有机溶剂法处理生产菌株时，将有机溶剂直接加入反
应液，对于总体积为1L的反应液，加入0. 1 50mL，优选加入1 20mL。 上述酵母的利用形式可以是酵母细胞的干燥物、经过发酵培养分离离心得到的细
胞、细胞的冻干物、市售酵母粉、风干酵母或废酵母泥。 本发明的有益效果为 本发明提供了一种定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，以CMP、氯化胆碱和磷 酸根离子为底物，以葡萄糖作为能量供体，利用有透性的微生物细胞为酶源，通过改变反应 温度为手段，促使反应体系定向生物催化合成胞苷磷酰化合物。本发明可以根据需求生产 三种物质的任意之一种，反应体系简单，无毒，生产成本低廉，控制手段简单易行，极大方便 了工业化中的生产控制。以CMP做底物时CDP、 CTP和CDP-胆碱的得率分别可达到80%、 91. 8%、93. 3%。
具体实施例方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1 : 酵母培养基葡萄糖40g/L，尿素2. Og/L，磷酸二氢钾1. 5g/L，七水合硫酸锌 4. OX 10—3g/L，七水合硫酸亚铁3. OX 10—3g/L，四水合氯化锰0. 3X 10—3g/L，无水氯化钙 1. 0 X 10—3g/L，生物素0. 05 X 10—3g/L。酵母接种量10^，于30。C下120rpm摇床培养24小时，离心4000rpm，20分钟。取
酵母泥，-7t:保藏备用。 实施例2 :利用CMP定向生产CTP。 在容量15L的反应槽中调制由CMP 300mmol、氯化胆碱100mmol、葡萄糖5mol、硫酸 锰500mmol、二硫苏糖醇300mmol、按实施例1的方法培养的枯草芽孢杆菌2400g，磷酸二氢 钾3mo1，曲拉通X-1001g和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为7.0，温度为35t:，反应 3小时后结束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对产物进行定量分析，转化液中主要产物为CDP，其含量为18. 6mmol/L，得率为62. 1 % ，此时CDP含量为2. 5mmol/L， CDPC含量为5. 8,1/ L。 实施例3 :利用CMP定向生产CTP。 在容量15L的反应槽中调制由CMP 300mmol、氯化胆碱3000mmol、葡萄糖5mol、硝 酸锰500mmol、二硫苏糖醇300mmol、按实施例1的方法培养的酿酒酵母2500g、磷酸二氢钾 3mol、甲苯10mL和水组成的反应液IOL，用氢氧化钠调pH为7. O，温度为4(TC，反应3小时 后结束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对产物进行定量分析，转化液中主要产物为CDP，其含 量为27. 5mmol/L，得率为91. 8%，此时CDP含量为0. 7mmol/L， CDPC含量为0. 8mmol/L。
实施例4 :利用CMP定向生产CDPC。 在容量15L的反应槽中调制由CMP 300mmol、氯化胆碱3mol、葡萄糖5mol、硫酸锰 500mmol、二硫苏糖醇300mmol、按实施例1的方法培养的大肠杆菌2500g，磷酸二氢钾3mo1， 丙酮10mL和水组成的反应液IOL，用氢氧化钠调pH为7. O，温度为35。C，反应3小时后，温 度调整为28°C ，继续反应9小时结束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对产物进行定量分析，转 化液中主要产物为CDPC，其含量为28mmol/L，得率为93. 3%，此时CDP含量为0. 8mmol/L， CTP含量为0. 3mmol/L。 实施例5 :利用CMP定向生产CDPC。 在容量15L的反应槽中调制由CMP 300mmol、氯化胆碱3mol、葡萄糖5mol、硫酸锰 500mmol、二硫苏糖醇300mmol、按实施例1的方法培养的毕赤酵母2500g，磷酸二氢钾3mo1、 乙酸乙酯10mL和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为7. O，温度为40°C，反应3小时后， 温度调整为34°C ，继续反应15小时结束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对产物进行定量分析， 转化液中主要产物为CDPC，其含量为21mmol/L，得率为70. 0%，此时CDP含量为1. 2mmo1/ L， CTP含量为0. 7mmol/L。
实施例6 :利用CMP定向生产CDP。 在容量15L的反应槽中调制由CMP 100mmol、氯化胆碱100mmol、葡萄糖lmol、硫酸 锰20mmol、二硫苏糖醇10mmol、按实施例1方法培养的大肠杆菌1000g、磷酸二氢钠2mo1、 曲拉通X-IOO 50g、甲苯50mL和水组成的反应液IOL，用氢氧化钠调pH为6. 0，温度为35°C ， 反应3小时后，温度调整为28t:，继续反应9小时，温度再调整为2(TC，继续反应6小时结 束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对产物进行定量分析，转化液中主要产物为CDP，其含量为 8mmol/L，得率为80. 0%，此时CTP含量为lmmol/L， CDPC含量为0. 8mmol/L。
实施例7 :利用CMP定向生产CDP。 在容量15L的反应槽中调制由CMP 1000mmol、氯化胆碱3000mmol、葡萄糖lOmol、 氯化锰500mmol、二硫苏糖醇2mol，按实施例1方法培养的白球拟酵母经反复冻融3次 8000g、磷酸二氢钠5mo1和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为9.0，温度为4(TC，反 应3小时后，温度调整为34t:，继续反应15小时，温度再调整为27t:，继续反应10小时结 束反应，用高氯酸沉淀，用HPLC对产物进行定量分析，转化液中主要产物为CDP，其含量为 42mmol/L，得率为42. OX，此时CTP含量为0. 5mmol/L， CDPC含量为11mmol/L。
权利要求
一种定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特征在于以CMP、氯化胆碱和磷酸根离子为底物，以葡萄糖作为能量供体，利用有透性的微生物细胞为酶源，通过改变反应温度为手段，促使反应体系生物催化合成胞苷磷酰化合物。
2. 根据权利要求1所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特征在于所述胞苷 磷酰化合物为胞苷二磷酸、胞苷三磷酸或CDP-胆碱，其结构式如下
3. 根据权利要求2所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特征在于在 <formula>formula see original document page 2</formula>pH5 10的水溶液中进行如下三种反应之一，定向合成胞苷磷酰化合物(a) 在28 4(TC下，反应3小时，主要产物为CTP ;(b) 在28 4(TC下，反应3小时；再调整温度至28 34"，反应9 15小时，主要产 物为CDPC ;(c) 在28 4(TC下，反应3小时；再调整温度至28 34"，反应9 15小时；再调整 温度至20 27t:，反应6 10小时，主要产物为CDP。
4. 根据权利要求1 3中任意一项所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其 特征在于底物CMP的起始反应浓度为10 100mmol/L，氯化胆碱的起始反应浓度为10 300mmol/L，磷酸根离子的起始反应浓度为0. 1 2mol/L，葡萄糖的起始反应浓度为0. 1 lmol/L，微生物细胞的加入量为按湿菌体计100 800g/L。
5. 根据权利要求1 3中任意一项所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特 征在于所述的反应体系还加入Mr^+离子和二硫苏糖醇的组合物；Mn"起始反应浓度为1 200mmol/L，二硫苏糖醇起始反应浓度为1 200mmol/L。
6. 根据权利要求1 3中任意一项所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特 征在于所述的微生物细胞是指能够利用CMP合成CDPC的微生物，包括气杆菌属、埃希氏菌 属、赛氏杆菌属、微球菌属的细菌；酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵 母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属和酒香酵母属的酵母。
7. 根据权利要求1 3中任意一项所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特 征在于所述的有透性的微生物细胞是指通过化学、物理或生物方法处理过的细胞膜的通透 性改变过的微生物细胞，具体方法包括表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法、超声波处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌酶法。
8. 根据权利要求7所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特征是表面活性剂 法中使用的表面活性剂为非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂或者阴离子表面活性 剂，使用量为0. 1 50g/L。
9. 根据权利要求7所述的定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，其特征是有机溶剂法 中使用的有机溶剂为二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，使用量为0. 1 50mL/L。
全文摘要
本发明公开了一种定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法，以CMP、氯化胆碱和磷酸根离子为底物，以葡萄糖作为能量供体，利用有透性的微生物细胞为酶源，通过改变反应温度为手段，促使反应体系定向生物催化合成胞苷磷酰化合物。本发明可以根据需求生产三种物质的任意之一种，反应体系简单，无毒，生产成本低廉，控制手段简单易行，极大方便了工业化中的生产控制。以CMP做底物时CDP、CTP和CDP-胆碱的得率分别可达到80％、91.8％、93.3％。
文档编号C12P19/30GK101792786SQ20101011820
公开日2010年8月4日 申请日期2010年3月4日 优先权日2010年3月4日
发明者应汉杰, 柏建新, 汤佳鹏, 熊健, 陈勇, 陈晓春 申请人:南京工业大学