专利名称：一种苯乙烯环氧化酶基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及的基因和与已报道的环氧化酶基因大小一致，氨基酸数也相同，但相似度不到80%，为亲缘关系较远的基因。连接与之间碱基数和序列也有所不同，已报道的假单胞菌这两者之间的碱基数为54bp，而本发明的与之间碱基数为53bp，相似度〈70%。本发明的·5 与s tyB之间连接序列如下 CGCCCCCTCCGCTGGCCATGCCAGCGGACCCTTTAAATTTGCAGGTGATCCAA
利用本发明的基因，经克隆并在重组菌中表达，可转化苯乙烯及类似物生成相应的手性环氧化物。其具体过程如下
1.基因的扩增
上-弓+丨功^ 4；iAGOAGGTCMBZ]5A4A4ACXGmTCCiGTATT(5TTG Nde I酶切泣貞
x游引均5* -TiiAQyOrrrrTAATTCAGGGGCAGCGGATTG.
HdicTO 酶切 ft α
2.重组载体构建
将上述PCR产物经Nde I /Hindm酶切后连入具有同样酶切位点的pET-28a(+)表达载体，构建重组载体ΡΕΤΑΒ，化学转化至Ε. coli BL21 (DE3)感受态细胞，得重组子Ε. coli(pETAB)o本发明的环氧化酶基因可以连入其他载体中表达，基因扩增时设计引物添加的酶切位点根据载体有所不同。该基因连入PCW或者PUC19表达载体或者PPIC9K，表达宿主分别为pET载体在大肠杆菌BL21 (DE3)表达；pCW和pUC19载体在大肠杆菌DH5a表达；pPIC9K在毕赤酵母KM71中表达。3.苯乙烯环氧化酶的表达
挑取重组子疋coli (pETAB)单菌落，在含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB培养基中于370C，230rpm培养16h作为种子培养基，以1%接种量接种于TB培养基中，37°C振荡培养3h，而后降温至20°C诱导基因表达，诱导18 21h后，4°C冷冻离心，收获菌体。重组质粒PETAB表达StyA、StyB蛋白电泳图见附图
3。4.全细胞生物转化
取适量新鲜培养的湿菌体，重悬于磷酸盐缓冲液(O. I M, pH 6. 5)，加入适量环己烷或者BEHP (邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯)和O. 19Γ0. 5% (体积或者质量)浓度的底物。30°C，240rpm震荡反应24h。反应完成后，反应液离心处理(300(T6000rpm，4°C，IOmin)，取有机相；水相用乙醚萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂。初产物经柱层析分离，得到手性环氧化产物。本发明可以用重组酶完成上述生物转化。本发明的苯乙烯环氧化酶底物范围较宽，可以转化苯乙烯及多种类似物，如间氣苯乙稀、对漠苯乙稀、1_苯基_1，3- 丁二稀、{E) -I-苯基-I-丙稀、2_苯基-I-丙稀、1，2- _■氧蔡、2_乙稀基蔡、I-苯基-2-甲基_1-丙稀、4_乙稀基-2，3- _■氧苯并咲喃、I-苯基-3-甲基-I-丁稀、2-苯基-I- 丁稀、2-苯基-I-戍稀、1_苯基_1_环己稀、4-苯基-3- 丁稀~2~醇、2_乙稀基卩比淀、3-苯基_2_丙稀-I-醇、I-苯基_3-氣丙稀。其中，对漠苯乙稀、2-乙稀基蔡、4_乙稀基-2，3- _■氧苯并咲喃、1_苯基_1，3-丁_■稀、2-苯基-1-丁稀、I-苯基-3-甲基-I- 丁烯、I-苯基-I-环己烯、2-苯基-I-戊烯、4-苯基-3- 丁烯-2-醇、3-苯基-2-丙烯-1-醇等为未曾报道底物。量体u本发明构建的重组菌能够在不同条件下将上述多种烯烃转化为高光学纯度的环氧化物，最高转化率100%，对映体过量>99%。说明书附图
图I为环氧化酶基因系统进化分析,其中sp. LQ 26为本发明styAB基因来源的原始菌株。图2是环氧化酶基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。图3是重组质粒pETAB表达StyA、StyB蛋白电泳图。
具体实施例方式实施例I筛选苯乙烯环氧化酶基因
将环境样品富集于含有M12无机盐(Hartmans et al. (1989) APPI. Environ.Microbiol. , 55(11)，2850-2855)和苯乙烯2mM的培养基中培养8天，稀释后涂布于筛选平板上(M12 +苯乙烯2 mM + 4-氯吲哚O. I mM + O. 01%酵母粉+ I. 5%琼脂粉)于30°C培养2天，出现蓝色菌落，挑出，进一步纯化，获得单菌落。将筛选菌株以苯乙烯(IOmM)为唯一碳源培养，生长状态良好。筛选菌株在含有M12、苯乙烯3mM、0. 05%酵母粉、O. 05%胰蛋白胨、O. 1%葡萄糖的培养基中生长8-10h，离心，收获菌体。将湿菌体重悬于pH7. O的磷酸盐缓冲液中，加入O. 5mM的4-氯卩引哚，37°C,240rpm转化20min,生成深蓝色物质。因此，所筛菌株可以降解苯乙烯和转化4-氯吲哚生成靛蓝，为产环氧化酶微生物。本发明涉及的基因来源的原始菌株/zsewt/offlmas sp. LQ26以16S rRNA鉴定，引物为通用引物27f和1492r。其序列如下(1498bp)
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAG
CTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAA
GGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGT
CGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACAC
TGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCA
GCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACC
TTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAA
GCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACC
TGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGT
AGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAG
CAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTG
GCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCC
GCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTT
CCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT
GGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCC
GGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTG
CAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGT
ACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACG
GTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTTGCC
经NCBI比对，该菌株为假单胞菌属细菌。根据报道的假单胞菌环氧化酶基因序列设计引物 PSEF :5’ -ATG AAA AAGCGTATCGGTAATG ；PSER: 5’ -TTCGAAGGCATGAAGCATG,该引物扩增片段包含环氧化酶基因。PCR产物电泳图见附图2。 经测序，目标产物1900bp，包含和styB基因，从而获得本发明所述的环氧化酶基因序列。实施例2苯乙烯环氧化酶表达条件的优化
重组子疋(pETAB)构建及表达方法见说明书。为了表达得到活力较高的重组蛋白，对表达温度、诱导剂浓度进行了单因素初步优化。表达温度优化诱导剂IPTG为1禮时，分别于371、301、251、201、151、101诱导siWi 基因表达，诱导不同时间取样，冷冻离心，收获菌体，以4-氯吲哚为模式底物检测StyAB活性，结果是20°C和15°C在诱导18 21h时总酶活最高，两者总活力无明显差异，选择20°C为表达温度。诱导剂浓度优化加入IPTG的浓度分别为0、0. 05、0· 1、0· 5、lmM，于20°C诱导 基因表达，诱导18 21h后冷冻离心，收获菌体，以4-氯吲哚为模式底物检测StyAB活
性，不加IPTG时反应活性最高。综上，不需要外加IPTG诱导，在20°C条件下表达18 21h，即可获得较高的表达量，4°C冷冻离心后，收集菌体用于纯化蛋白及全细胞转化。实施例3苯乙烯环氧化酶全细胞生物转化条件优化
蛋白表达采用实施例2优化条件，将收集的湿菌体用于全细胞生物转化。对转化反应温度和pH值进行了单因素初步优化。最适反应温度分析取等量新鲜培养的湿菌体，重悬于磷酸盐缓冲液(O. 1M,pH6. 5)，加入 10%BEHP 和等量 4-Bromostyrene。分别于 25O、28O、30O、32O、35O、40O、450C，240rpm震荡反应24h，取有机相通过HPLC检测环氧产率，30°C时环氧产率最高。最适反应pH分析取等量新鲜培养的湿菌体，分别重悬于pH为6. 0,6. 5,7. O、7. 5,8. O 的 O. IM 磷酸盐缓冲液，加入 10%BEHP 和等量 4-Bromostyrene，于 30°C、240rpm 震荡反应24h，取有机相通过HPLC检测环氧产率，pH为6. 5时环氧产率最高。综上，以30°C，ρΗ=6· 5为全细胞生物转化条件。实施例4苯乙烯环氧化酶的纯化和酶动力学参数
酶纯化取3g经诱导表达的新鲜重组菌细胞，以溶菌酶处理的(pH=7. 0,0. IM磷酸钾缓冲液，并加入 ImM PMSF，20% 甘油，O. ImM DTT, O. 5M KC1，5mM 咪唑)，超声破壁(5s，30s，30次)，离心，上清经由上述缓冲液平衡的Ni亲和层析柱吸附，再用含20%甘油，O. ImM DTT,
O.5M KCl, O. 25M咪唑的O. IM磷酸钾缓冲液(pH=7. O)洗脱，收集目的蛋白。酶动力学参数测定反应体系组成0. IM磷酸钾缓冲液(ρΗ=6· 5), 20%ΒΕΗΡ, O. 16Μ甲酸钠，O. 2mM NADH, O. 8mM NAD, O. 03mM FAD,20mM StyB(NADH_FAD 氧化还原酶)，20mM FDH(甲酸脱氢酶)，8mM 3七7么斤40依赖型羟化酶)，不同浓度苯乙烯，301，240印111震荡反应Ih，反应完成后，取有机相以HPLC检测底物转化情况。经计算，Michaelis-Menten拟合得StyA^cat=L Smirf1, Km=O. 41 + 0. ImM, ^cat/Km=3. TmmoF1 · Γ1 · mirf1。实施例5苯乙烯环氧化酶重组菌对苯乙烯的催化作用
取新鲜培养的湿菌体I. Og，重悬于5ml磷酸盐缓冲液(O. 1M, pH6. 5)，加入环己烷或者邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(BEHP) 1ml，苯乙烯10μ I或10mg。于30°C，240rpm震荡反应24h。反应完成后，反应液离心处理(4000rpm，10min，4°C )，取有机相；水相用乙醚20ml萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂。初产物经柱层析分离，得到环氧化产物C )-环氧苯乙烷，转化率100%。反应式如下所示
权利要求
1.一种苯乙烯环氧化酶基因,其特征是:styA为1248Βρ,5· _^为513bp,分别编码苯乙烯单加氧酶SMO和还原酶Reductase ;连接sty A与styB之间碱基长度为53bp。
2.权利要求I所述的苯乙烯环氧化酶基因，其特征是^汴A基因序列为 ATGAAAAAGCGTATCGGTATTGTTGGTGCTGGCACGGCCGGCCTGCATCTCGGTCTCTTCCTCCGCCAGCATGACCATGACGTCACCGTGTACACCGACCGGCAGCCTGATGAATATGCGGGCCTTCGGCTGCTGAACACCGTGGCTCATCACGCGGTGACCGTTCAACGCGAAGTCGACCTCGGCGTGAACGAGTGGCCATCTGATGAATTCGGTTACTTTGGCCACTACTACTATGTCGGCGGCCCACAGCCCATGCGCTTCTACGGCGACCTCAAGGCCCCGAGCCGCGCTGTCGACTACCGTCTTTATCAGCCTATGCTTATGCGTGCCCTCGAAGCACGGGGTGGCAAATTCTCATACGACGCCGTATCTGTCGAAGATCTGGAGTCGCTGTCGGATCAGTATGATTTGCTGGTCGTGTGCACTGGCAAGAACTCACTGGGGCAGTTGTTCGAAAAACAACCCGAAAACTCGCCCTTCGAAAAACCGCAGCGGGCTCTCTGTGTCGGTCTCTTCAAAGGTATCAAGGAAGCTCCGATTCGCGCAGTGACCATGTCGTTTTCACCAGGGCATGGTGAGCTGATCGAAATTCCAACGCTCTCGTTCAACGGCATGACCACAGCCCTGGTCCTTGAGAATCACATCGGCGGTGACCTCGAAGTACTTGCGCACACGAAGTATGAAGAGAATCCACGCGCATTCCTTGATCTCCTGTTCCAAAAGCTGCACGCACATCACCCATCGATTGCCGAGCGAATTGACCCAGAAGAGTTCGATCTCGCGAACAGCTCTCTGGATATCCTCCAGGGCAGCGTGACCCCGGTATTCCGCAACGGCCATGCAACCCTCAAAAACGGTAAGACCATCATCGGTCTGGGGGACGTACAAGCGACCGTTGACCCGGTTCTGGGTCAAGGCGCGAACATGGCATCCCACGCTGCCTGGATTTTGGGCGAAGAAATCCTGAGCCACTCCGTGTATGACCACCGTTTCTGTGAGCACCTGGAGCGCCGGCGCCAAGATCGTGTTCTCTGCGCTACTCGCTGGACGAACTTCACCATGGGGGCTCTCCAAGCGCTTCCACCGGAGTTCATTGCATTCCTTCAAGTGCTCAGCCAGAGCCGTGAAATGGCCGATGAATTCACGGACAACTTCAACTATCCGGAACGTCAGTGGGACCGCTTCTCTAGCCCTGAGCGCATCGGTCACTGGTGCAGTCAGTATGCGCCGACCATTGCAGCCTGAsty B基因序列为ATGACGCTAAAGACAGATGCGGCGGTGGAAATCGACGCCGCTAGCTTTCGCCAAGCTGTAGCACTATTCGCCACGGGCATTGCTGTACTGAGCGCTGAAACAGCCGACGGTGAAGTTCATGGCATGACCGTTAACAGCTTCACTTCTATCAGTCTCGATCCACCGACAGTCATGGTTTCGCTGAAAACGGGTCGCATGCATGAGCTTTTGACTCAGGGCCGGCGCTTCGGTGTAAGCCTGCTGGGTGAAGGGCAAAAGGTACTGTCGGCCTTCTTCAGCAAGCGGATGCTCGATGACAGTCCGCCTCCGGCCTTCACCGTGCAGAACAGCCTGCCCACGCTACAGGACGCCATGGCCTGGTTTGAGTGTGAAGTGGAGTCGACAGTCCAAATCCACGATCACACGCTTTTTTTCGCACGTGTCAGCGCATGTGGTCGACCTGAGGCTACGGCTCCCCAGCCGCTTCTGTTCTTCGCCAGCCGTTATCACGGCAATCCGCTGCCCCTGAATTAA。
3.权利要求2所述的苯乙烯环氧化酶基因，其特征是^编码的蛋白质含有415氨基酸，其序列为MKKRIGIVGAGTAGLHLGLFLRQHDHDVTVYTDRQPDEYAGLRLLNTVAHHAVTVQREVDLGVNEWPSDEFGYFGHYYYVGGPQPMRFYGDLKAPSRAVDYRLYQPMLMRALEARGGKFSYDAVSVEDLESLSDQYDLLVVCTGKNSLGQLFEKQPENSPFEKPQRALCVGLFKGIKEAPIRAVTMSFSPGHGELIEIPTLSFNGMTTALVLENHIGGDLEVLAHTKYEENPRAFLDLLFQKLHAHHPSIAERIDPEEFDLANSSLDILQGSVTPVFRNGHATLKNGKTIIGL⑶VQATVDPVLGQGANMASHAAWILGEEILSHSVYDHRFCEHLERRRQDRVLCATRWTNFTMGALQALPPEFIAFLQVLSQSREMADEFTDNFNYPERQWDRFSSPERIGHWCSQYAPTIAA sty i 编码的蛋白质含有170氣基酸，其序列为MTLKTDAAVEIDAASFRQAVALFATGIAVLSAETADGEVHGMTVNSFTSISLDPPTVMVSLKTGRMHELLTQGRRFGVSLLGEGQKVLSAFFSKRMLDDSPPPAFTVQNSLPTLQDAMAWFECEVESTVQIHDHTLFFARVSACGRPEATAPQPLLFFASRYHGNPLPLN。
4.权利要求I所述的苯乙烯环氧化酶基因，其特征是连接《sixA和B序列之间的喊基序列为CGCCCCCTCCGCTGGCCATGCCAGCGGACCCTTTAAATTTGCAGGTGATCCAA。
5.权利要求I所述的苯乙烯环氧化酶基因，其特征是其表达载体为ρΕΤ或者pCW或者PUC19或者pPIC9K ;表达宿为pET载体在大肠杆菌BL21-DE3表达，pCW和pUC19载体在大肠杆菌DH5a表达，pPIC9K在毕赤酵母KM71中表达。
6.利用权利要求I或2或3或4或5所述的苯乙烯环氧化酶基因克隆并构建重组菌用于生物转化，相应环氧产物对映体过量>99%。
7.利用权利要求I或2或3或4或5所述的苯乙烯环氧化酶基因构建的重组菌环氧化酶蛋白表达后，全细胞或者酶用于转化苯乙烯及其类似物。
8.利用权利要求I或2或3或4或5所述的苯乙烯环氧化酶基因构建的重组菌环氧化酶蛋白表达后，全细胞或者酶用于转化间氯苯乙烯或对溴苯乙烯或I-苯基-1，3-丁二烯或{B)-I-苯基-I-丙烯或2-苯基-I-丙烯或1，2- 二氢萘或2-乙烯基萘或I-苯基-2-甲基-I-丙烯或4-乙烯基-2，3- 二氢苯并呋喃或I-苯基-3-甲基-I- 丁烯或2-苯基-I- 丁稀或2_苯基-I-戍稀或I-苯基-I-环己稀或4_苯基-3- 丁稀-2-醇或2_乙稀基卩比卩定或3-苯基-2-丙稀-I-醇或I-苯基-3-氣丙稀。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及基因工程、生物转化和生物催化技术，公开了一种假单胞菌属细菌的苯乙烯环氧化酶基因及其在催化不对称环氧化反应中的应用。本发明苯乙烯环氧化酶基因的styA为1248bp，styB为513bp，分别编码苯乙烯单加氧酶SMO和还原酶Reductase；连接styA与styB之间碱基长度为53bp。本发明苯乙烯环氧化酶基因构建的重组菌环氧化酶蛋白表达后，全细胞或者酶用于转化苯乙烯及其类似物。本发明具有转化率高，条件温和，易于工业化等优点。
文档编号C12N9/02GK102816774SQ201010120969
公开日2012年12月12日 申请日期2010年3月10日 优先权日2010年3月10日
发明者吴中柳, 林晖, 刘艳, 乔婧 申请人:中国科学院成都生物研究所