专利名称：水稻冷诱导启动子p-LTT7及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻冷诱导启动子p-LTT7及其应用。
背景技术：
水稻是重要的粮食作物，冷害是影响水稻生产的重要限制因子之一。芽期、苗期和 孕穗开花期遭遇冷害，将导致水稻幼苗生长迟缓、分蘖减少，最终造成水稻产量的大幅度降 低，因此迫切需要发掘水稻耐冷种质资源，培育出水稻耐冷品种。 普通野生稻是亚洲栽培稻的祖先种，野生稻在演化成栽培稻的过程中，经过自然 选择和人工选择，基因多样性降低，等位基因数减少。据统计，栽培稻的等位基因数约为 野生禾舀的60% (S皿C Q， Wang X K， Li Z C， Yoshimura A. Comparison of thegenetic diversity of common wild rice(0ryza rufipogon Griff.)and cultivatedrice(0. sativa L.)using RFLP markers. Theor A卯l Genet， 2001， 102 :157-162)，从而导致当前 水稻品种选育所面临的遗传瓶颈(genetic bottleneck)问题。因此从水稻的近缘野生种 (普通野生稻Oryza rufipogon Griff.)基因组中发掘和利用在栽培稻中已丢失或削弱的 优异基因，并把它们应用于水稻育种生产中具有十分重要的理论意义和实践价值，也是解 决当前水稻育种难题的一条行之有效的途径。 江西东乡普通野生稻是目前世界上分布生境最北的野生稻之一。具有极强的耐冷 性，它的地下茎能耐-12.8。C的低温并可安全过冬(Chen D Z， Xiao Y Q， Zhao S X， Xiong H J， Pi Y H， Luo L J. Studies on cold tolerance of seedling and headingstage in Dongxiang wild rice. Acta Agric Jiangxi，1996，8 :1-6 (in Chinese) ;Chen D Z， Xiao Y Q， Zhao S X， Pi Y H， Xiong H J， Luo L J. Genetic study on thecold tolerance of Dongxiang wild rice at the seedling stage. Acta Agric Jiangxi，1997，9 :56-59(in Chinese))，而当前栽培稻无一具此抗性，因此江西东乡普通野生稻是水稻耐冷性研究的理 想、禾才茅斗。Liu et al. (Liu F X，Sun C Q，Tan L B，Li DJ，Fu Y C，Wang X K. Identification and mapping of quantitative trait locicontrolling cold_tolerance of Chinese common wild rice(0. rufipogon Griff. )at booting to flowering stages. Chinese Science Bulletin, 2003， 48 :2068-2071)报道了 3个来自东乡野生稻的QTL能提高栽培稻 受体亲本(桂朝2号)的孕穗开花期耐冷性，进一步证实了从东乡野生稻中发掘耐冷性基 因的可行性。 我国野生稻资源丰富，从野生稻中发掘、定位、克隆耐冷相关基因及其冷诱导启动 子，将对水稻生产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻冷诱导启动子p-LTT7及其应用。 本发明提供的水稻冷诱导启动子，其名称为p-LTT7，来源于稻属普通野生稻
(0. rufipogon Griff.)。
本发明提供的DNA片段(启动子)，为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子
1)序列表的序列1自5'末端第75至2036位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列1所示的DNA分子； 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且具有启动子功能的 DNA分子。 上述严格条件可为在O. IXSSPE(或O. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65"条件下 杂交并洗膜。 序列表中序列1所示的DNA由2036个核苷酸组成，含有ABRE、 DRE和CBF作用元 件，能特异性地对冷胁迫、干旱和ABA等逆境起应答反应。 含有所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的 保护范围。 用于构建含有所述启动子的重组载体的出发载体可为pCAMBIA1381、 pBI121、 pBinl9、pCAMBIA2301或pCAMBIA1301-UbiN等。所述重组载体可为在pCambia1381的多克 隆位点插入所述DNA片段得到重组质粒。所述重组载体具体可为将序列表中序列1自5' 末端第75至2036位核苷酸所示的DNA分子插入pCambia1381的Smal和Pstl酶切识别位 点间得到的重组质粒。 扩增所述DNA片段的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述DNA片段可应用于启动目的基因表达。所述目的基因表达可为低温诱导表达 和/或组织特异表达。 所述组织特异表达中的组织具体可为水稻芽、水稻柱头和水稻花药等组织中的至 少一种。所述目的基因具体可为GUS基因。 所述DNA片段可应用于培育耐低温的转基因植物。如培育耐低温的转基因水稻。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是在目的植物中用所述DNA片段启动 目的基因的表达，得到所述目的基因表达受低温诱导的转基因植物。所述目的植物可为水 稻，如水稻品种日本晴。所述低温可为0-l(TC，如4t:。所述目的基因具体可为GUS基因； 所述方法具体可为将所述重组载体导入所述目的植物，从而在所述目的植物中用所述DNA 片段启动GUS基因的表达。 本发明启动子的发现和其功能的阐明，将对水稻耐冷分子机制的研究，水稻耐冷
品种的选育具有重要的理论及实际意义。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前
旦 豕。
图1为基因在低温处理前(0h)和低温处理1、3、6、12和24小时后的表达谱。
图2为以IL112基因组DNA为模板，在引物T7GUS引导下的PCR扩增产物，1为 Markerlll (所用Marker为天根生化科技有限公司的Markerlll，货号MD103_01) ， 2为PCR产物。 图3A，B为正常条件下p-LTT7转基因水稻的GUS组织染色结果；图3C为4。C低温 处理3小时后p-LTT7转基因水稻的GUS组织染色结果。
具体实施例方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。所用引物合成及测序工作均由北京奥科生物科技有限责任 公司完成。 耐冷系IL112水稻由中国农业大学孙传清实验室构建的BQ&群体中所获得的一 个系。 pCambia1381:GenBank号AF234302。
日本晴国家种质资源库；库编号I1A13071。
实施例1、水稻冷诱导启动子p-LTT7的发现
—、冷诱导基因的发现 首先以耐冷系IL112水稻及对照亲本桂朝2号水稻为材料进行芯片(芯片为 Affimetrix公司的水稻全基因组芯片(GeneChip Rice Genome Array)，货号900599)
杂交，并在芯片数据分析的基础上，结合比较基因组学分析，筛选耐冷相关基因，经过基因 组比较、耐冷相关性分析，最后获得耐冷基因LTT7，冷处理条件下，基因的表达量明显增加
(图l)，是冷诱导基因。 二、冷诱导启动子p-LTT7的发现 利用primer3引物设计软件设计引物，并在引物两端分别引入限制性内切酶Pstl
和Smal识别位点及保护碱基。引物序列如下 T7GUSF:5' -TCCCCCGGGgttcctggggcagaatgtta-3'; T7GUSR : 5 ， -AACTGCAG gcctggctgtggagtgtagt-3，。 T7GUSF中，带下划线碱基为限制性内切酶Smal识别位点及保护碱基；T7GUSR中， 带下划线碱基为限制性内切酶Pstl的识别位点及保护碱基。 以耐冷系IL112水稻的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为先 94°C 5min ;然后94°C 30sec， 58°C 45sec， 72°C 2min，共30个循环；最后72°C 10min，获得目 的产物。反应结束后，对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示。将 PCR产物进行测序，测序结果表明，PCR产物具有序列表的序列1自5'末端第75至2036位 核苷酸所示的DNA片段，将序列表的序列1自5'末端第75至2036位核苷酸所示的DNA片 段命名为P-LTT7(冷诱导启动子)。 用分析软件(http:〃www. dna. affrc. go. jp/PLACE)对启动子进行分析，发现在 其区域内含有与逆境胁迫相关的顺式作用元件ABRE、 DRE和CBF。
实施例2、 p-LTT7转基因水稻的获得及其鉴定
—、 p-LTT7植物表达载体的构建 1、合成序列表的序列1所示的DNA，以合成的DNA为模板，用特异性引物对 T7GUS (T7GUSF/T7GUSR)进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电 泳检测，回收并纯化1979bp的DNA片段(p-LTT7)(所用回收试剂盒为天根生化科技有限公 司的DNA产物纯化试剂盒，货号DP204-02)。 2、用限制性内切酶Smal和Pstl酶切步骤1回收的PCR产物。
3、用限制性内切酶Smal和Pstl酶切植物表达载体pCambia1381，回收载体骨架。 4、将步骤2的酶切产物与步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒。 5、将重组质粒进行测序，测序结果表明，得到了重组质粒pCambial381-pLTT7(在
pCambia1381的Smal和Pstl酶切位点之间插入序列表的序列1自5'末端第75至2036位
核苷酸所示的DNA片段)。 二、 p-LTT7转基因水稻的获得 将pCambial381-pLTT7用基因枪法转化日本晴的成熟胚愈伤组织，用含50mg/L潮 霉素的NB培养基进行2轮筛选，每轮筛选20-30天，经预分化、分化得到阳性植株。将阳性 植株进行PCR鉴定，结果表明，得到了 T。代转基因植株。 将pCambia1381用基因枪法转化日本晴的成熟胚愈伤组织，用含50mg/L潮霉素的 NB培养基进行2轮筛选，每轮筛选20-30天，经预分化、分化得到T。代转空载体对照植株。
三、转基因水稻的组织表达特异性分析 对正常培养的的T。代转基因植株和T。代转空载体对照植株的幼芽(生长7天的 幼芽)、根(生长7天的根)、叶(孕穗期)、叶鞘(孕穗期)、茎(孕穗期)、柱头(生殖期) 和花药(生殖期)进行GUS组织染色。结果发现转基因植株的GUS基因在生长7天的幼 芽、生殖期的柱头和花药中具有较高的表达活性，而在其他组织如叶、根、茎和叶鞘中的表 达量极低，甚至不表达(图3A，B);转空载体对照植株其相应组织均不具有GUS表达活性。
四、启动子的低温诱导活性验证 将T。代植株进行自交，得到T。代植株的种子(L代)。 将T。代植株的种子(转基因植株和转空载体对照植株)在常温下培养，待芽长至 5mm左右时，进行4t:低温处理3小时，随后同时进行GUS组织染色。结果发现转基因植株 低温处理后的幼芽中GUS表达活性增强，颜色较正常条件下的更深(图3C);而空载对照在 低温处理前后均没有GUS表达活性。 实施例2的实验重复进行三次，都得到的同样的结果。
权利要求
DNA片段，为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表的序列1自5’末端第75至2036位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
2. 含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3. 如权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为在pCambia1381的多 克隆位点插入权利要求1所述DNA片段得到重组质粒。
4. 如权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将序列表的序列1自 5'末端第75至2036位核苷酸所示DNA片段插入pCambia1381的Smal和Pstl酶切识别位 点间得到的重组质粒。
5. 扩增权利要求1所述DNA片段的全长或其任意片段的引物对。
6. 权利要求1所述DNA片段在启动目的基因表达中的应用。
7. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述目的基因表达为低温诱导表达和/或 组织特异表达；所述组织特异表达中的组织为水稻芽、水稻柱头和水稻花药中的至少一种。
8. 权利要求1所述DNA片段在培育耐低温转基因植物中的应用。
9. 一种培育转基因植物的方法，是在目的植物中用权利要求1所述DNA片段启动目的 基因的表达，得到所述目的基因表达受低温诱导的转基因植物。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于所述目的植物为水稻，优选水稻品种日本 晴；所述低温为0-l(TC，优选4t:;所述目的基因为GUS基因；所述方法为将权利要求4所 述重组载体导入所述目的植物，从而在所述目的植物中用权利要求1所述DNA片段启动GUS 基因的表达。
全文摘要
本发明公开了一个水稻冷诱导启动子p-LTT7及其应用。该启动子为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表的序列1自5’末端第75至2036位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。该启动子含有ABRE、DRE和CBF等逆境响应元件，在水稻幼芽、柱头和花药中特异表达。该启动子对于水稻耐冷性分子机制的研究，以及水稻耐冷性分子育种具有重要的理论及实际意义。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
文档编号C12N15/63GK101768590SQ201010122399
公开日2010年7月7日 申请日期2010年3月11日 优先权日2010年3月11日
发明者付永彩, 刘凤霞, 孙传清, 朱作峰, 苏震, 谢道昕, 谭禄宾 申请人:中国农业大学