专利名称：具有促生作用的铁皮石斛内生菌及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种天然药用植物内生细菌一铁皮石斛内生菌及其用途。
背景技术：
铁皮石斛属兰科(Orchidaceae)植物中的第二大属——石斛属(Dendrobium Sff.)，是石斛中的极品，属气生兰科草本植物，它因表皮呈铁绿色而得名，具有滋阴清热、生 津益胃、润肺止咳、明目强身、镇痛消炎等功效；现代药理研究表明，石斛还具有抗肿瘤、抗 衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用。由于其极大的药用价值，使其成 为全国涉及用到石斛类的制药厂和保健品加工企业原料命脉。但铁皮石斛的生长条件十分 苛刻，因此自然产量极为稀少，更因民间长期过度采挖，致使野生资源濒临绝种。据统计我国每年用石斛为原料的药品、保健品产值超过几百亿元，市场需求的数 量每年均在几百万公斤以上，而且逐年呈上升趋势。目前市场上生产的铁皮石斛大部分都 来自人工培育，即先经过组培的方式扩繁铁皮石斛，再经炼苗移栽田间。然而人工培育铁皮 石斛仍存在繁殖育苗难、移栽成活难和生长缓慢三大难题，这无疑是对铁皮石斛的开发利 用的一个严重的阻碍。植物内生菌是能从经过表面消毒的植物组织中分离或者从植物内部的汁液中获 得，并且对植物表观上无危害即不导致明显病症的微生物。植物内生菌包括互惠共利的 (mutualistic)和中性的(neutral)内共生微生物。目前已经从很多植物的各种器官(根、茎、叶、花、果实、种子)中分离到内生菌。它 们在植物体内的普遍性、丰富的生物多样性及功能多样性方面已有不少文献报道。内生菌 经过长期的与植物发生相互作用，它们之间形成较复杂的关系。现已发现内生菌对宿主植 物有以下几个方面的作用(1)促进宿主植物生长，提高宿主的生产力，可增强宿主对病、虫的抗性，因而在农 业生产、生物控制和生物防治方面有着重要意义；(2)、增强宿主植物对环境胁迫的抗性。如对干旱、全球气温上升、盐碱、重金属及 其它有毒物质污染等的抗性；(3)、内生菌产生新的生物活性物质。植物内生菌作为一种特殊生境下的微生物， 在植物体内能产生丰富多样、具有多种生物活性的次生代谢产物，目前人们已从内生菌中 找到许多具有各种生物活性的新物质在医药业、农业方面显示的重要的应用价值。据国内外研究报道，在植物幼苗中引入微生物必将对幼苗的发育、代谢产生积极 影响，可增强对生物和非生物胁迫因子的抗性。接入内生菌也可对植株生长和生理代谢进 行综合调节，使之较快适应外界复杂环境。J Nowak将这种技术称为“biotizafion”，诸如 菌根化(mycorrhization)、细菌化(bacterization)。将有益微生物与微繁苗进行共培养， 是生产高抗优质种苗的崭新途径，这对于中药材的大规模高效优质栽培具有很好的应用前景。目前，国际上关于兰科植物的内生真菌研究较多，但内生细菌的研究较少，更没有铁皮石斛内生细菌用于促长铁皮石斛组培面的研究报告。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种铁皮石斛内生细菌——鞘氨醇单胞菌株，该 菌株用于铁皮石斛种苗促生长，有助于解决目前铁皮石斛种苗生产过程中组培苗生长缓 慢、生产周期长、成本较高的技术难题。为了解决上述技术问题，本发明提供一种鞘氨醇单胞菌株，该鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonas sp.)菌株保藏名称为鞘氨醇单胞菌SHl，保藏单位中国典型培养物保藏 中心，保藏地址中国武汉大学，保藏日期2010年2月4日，保藏号CCTCC NO :M2010041。本发明还同时提供了上述鞘氨醇单胞菌株的用途用于铁皮石斛种苗促生长。作为本发明的鞘氨醇单胞菌株的用途的改进将鞘氨醇单胞菌CCTCC NO M2010041发酵原液或发酵液接种于铁皮石斛组培苗的基部，从而促进铁皮石斛组培苗生 长。本发明的铁皮石斛内生菌是发明人从铁皮石斛植株中分离到的一株细菌， 经传统方法鉴定和分子鉴定表明它属于鞘氨醇单胞菌，将其命名为鞘氨醇单胞菌 SHl (Sphingomonas sp. SHl)。具体为该铁皮石斛内生菌分离自野生的铁皮石斛植株的根，可通过如下方法从野生的铁 皮石斛植株分离培养得到1)、将野生铁皮石斛的根经表面消毒处理后，切成小块，接种于特制NA培养基平 板，于28 32°C下培养1 3天；该特制的NA培养基由基础NA培养基和研磨后的新鲜铁皮石斛组成，基础NA培养 基的成分组成为蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂15-20g* H2OlOOOml,在上述基础 NA培养基上添加5g研磨后的新鲜铁皮石斛，并用lmol/L的NaOH调节pH = 7. 4 7. 6，得 特制的NA培养基。2)、挑取单菌落于同上述步骤1)的特制NA培养基平板划线纯化分离，置于28 32°C下培养1 3天；3)、重复多次分离纯化培养，直至获得纯培养物。本发明的铁皮石斛内生菌——鞘氨醇单胞菌菌SHl (Sphingomonas sp. SHl)已于 2010年2月4号保藏在中国典型微生物保藏中心(CCTCC)，保藏号CCTCC NO =M 2010041。本发明的铁皮石斛内生菌一一鞘氨醇单胞菌SHl(以下简称为鞘氨醇单胞菌 CCTCCN0 :M 2010041)具有如下生物学特征1.菌落形态特征在基础NA培养基上生长良好，细菌菌落特征菌落呈圆形，黄 色，光滑，边缘整齐，菌落中心突起脊状。2.菌体形态特征球状，直径为0. 5 1. 5 μ m，革兰氏阴性。3.主要生理生化特征该菌可在基础NA培养基上，在生长温度为20 40°C、pH 值为6. 0 8. 0的环境中生长良好。4.遗传学特征根据《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英，科学出版社， 2001)，本发明的鞘氨醇单胞菌CCTCC NO =M 2010041的形态特征上，与国内命名的解聚乙 二醇鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas macrogoltabidus)最接近；经该鞘氨醇单胞菌CCTCCM2010041的16S rDNA序列分析表明，鞘氨醇单胞菌CCTCC M 2010041应属于鞘氨醇单胞菌
jM ο本发明的铁皮石斛内生细菌SHl对铁皮石斛组培苗有促生长作用，可促进组培苗 的平均根长增加10% 25%，增加植株的高度10% 30%，增加植株的鲜种和干重5% 20%，可缩短铁皮石斛组培苗的生产时间10 20天；对人畜无毒无害，对环境不造成污染。 可在铁皮石斛组培苗的生产中得到应用，产生一定的经济效益。本发明的铁皮石斛内生细菌用于促进铁皮石斛生长时，只需将该铁皮石斛内生细 菌一鞘氨醇单胞菌CCTCC NO =M 2010041的发酵原液或发酵液接种于铁皮石斛组培苗基 部，即可获得促进铁皮石斛组培苗生长的效果。
具体实施例方式实施例1、鞘氨醇单胞菌CCTCC NO =M 2010041的分离培养方法，依次进行以下步 骤1、于浙江桐庐采集野生的健康的铁皮石斛植株的根样品，用自来水充分清洗， 25KHz超声波处理5分钟；2、在无菌条件下，对步骤1所得的供试材料用无菌水冲洗2次，然后依次用体积 浓度75%的酒精和饱和漂白粉溶液对供试材料进行表面消毒，从而杀灭供试材料表面微生 物；3、在无菌环境中，将步骤2所得的供试材料用无菌水冲洗3次，取100 μ 1最后1 次冲洗所产生的无菌水冲洗液涂布接种于基础NA培养基中，30°C培养24h后，观察有无菌 落产生。据此验证此消毒方法是否全部杀死供试材料表面微生物。如果观察结论为没有菌落产生，则进行下述的步骤4 ；如果观察结论为有菌落 产生，则返回步骤2。4、将处理好的根样品切成0. 5 Icm小段，接入特制NA培养基平板中，放置于 30°C培养1 3天；该特制NA培养基由基础NA培养基和新鲜铁皮石斛研磨料渣组成；基础NA培养基 的成分组成为蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂18g和H2OlOOOml,在上述基础NA培 养基上添加5g研磨后的新鲜铁皮石斛，并用lmol/L的NaOH调节pH = 7. 4 7. 6，得特制
NA培养基。5、挑取上述步骤4所得的特制NA培养基平板上长出的菌种于特制NA培养基平板 划线纯化分离，置于30°C培养1 3天，挑取单菌落；重复上述操作，直至得到单菌落为止。6、将步骤5挑取所得的单菌落接于特制NA培养基斜面保存于4°C冰箱中。所得的一种单菌落为铁皮石斛内生菌——鞘氨醇单胞菌SHl (Sphingomonas sp. SHl)，已于2010年2月4号保藏在中国典型微生物保藏中心(CCTCC)，保藏地址中国武 汉大学，保藏日期2010年2月4日，保藏号CCTCC NO =M 2010041。其序列如SEQID NO 1 所示。实施例2、鞘氨醇单胞菌CCTCC NO =M 2010041的培养制种方法，依次进行以下步 骤
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1、将鞘氨醇单胞菌CCTCC NO =M 2010041转接到基础NA培养基斜面，30°C培养2 天；得斜面种子；基础NA培养基斜面配方为蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂18g和 H2OlOOOml, ρΗ = 7. 4 7. 6。2、用接种环挑取0. 5g步骤1所得斜面菌种，接种于装有100ml LB液体培养基的 250ml三角瓶中，于28°C以200r/m转速振荡培养30h，得鞘氨醇单胞菌CCTCC NO :M2010041 发酵原液；LB液体培养基配方为蛋白胨10g，酵母膏10g，NaCl 58和H201000ml，pH = 7. 4 7. 6。实施例3、鞘氨醇单胞菌CCTCC NO =M 2010041对铁皮石斛组培苗生长的促进实 验下述实验均用已在改良的铁皮石斛组培培养基中进行培养的铁皮石斛组培苗作 为实验对象。改良的铁皮石斛组培培养基的配方为采用1/2MS为基本培养基，添加香蕉汁 10% /L，琼脂7g/L，蔗糖20g/L，用lmol/L的NaOH调整ρΗ值为5.8。即在每L的1/2MS 中添加0. IL香蕉汁、7g琼脂和20g蔗糖，并调整ρΗ值为5. 8。实验1、鞘氨醇单胞菌CCTCC NO =M 2010041发酵原液对铁皮石斛组培苗促生长试
验一利用上述实施例2所得的鞘氨醇单胞菌CCTCC NO =M 2010041发酵原液，用无菌水 将发酵原液进行稀释，使其菌液浓度调整为103CFU/ml，将该稀释后发酵原液接种于已在改 良的铁皮石斛组培培养基中培养了 15天的25株铁皮石斛组培苗基部，作为实验组；具体 为在每株铁皮石斛组培苗基部加入50 μ 1的稀释后发酵原液。将相同体积的无菌水代替上述稀释后发酵原液，其余内容相同，作为空白对照组。上述实验组和空白对照组均在25°C恒温、全天IOOOIx的光照强度条件下进行培养。培养结果如下60天后可见，实验组的铁皮石斛组培苗的平均生长状况明显优于空白对照组， 实验组中组培苗平均根长比空白对照组增加了 20.5%，植株高度比空白对照组增加了 17. 8%，组培苗植株鲜重和干重分别比空白对照组增加了 16. 3%和15. 9%。实验2、鞘氨醇单胞菌CCTCC NO =M 2010041发酵原液对铁皮石斛组培苗促生长试
验二将稀释后的菌液浓度由103CFU/ml改成lOtFU/ml，以在改良的铁皮石斛组培培养 基中培养了 30天的铁皮石斛组培苗作为实验对象；其余等同实验1。培养结果如下60天后可见，实验组的铁皮石斛组培苗的平均生长状况均明显优于空白对照组， 实验组中组培苗平均根长比空白对照组增加了 11.3%，植株高度比空白对照组增加了 14. 7%，组培苗植株鲜重和干重分别比空白对照组增加了 10. 2%和9. 7%。实验3、鞘氨醇单胞菌CCTCC NO =M 2010041发酵液对铁皮石斛组培苗促生长试验
将上述实施例2所得的鞘氨醇单胞菌CCTCC NO =M 2010041发酵原液用孔径为 0. 45 μ m的滤膜过滤，得无菌发酵液。取该无菌发酵液接种于已在改良的铁皮石斛组培培养 基中培养了 15天的25株铁皮石斛组培苗，作为实验组；具体为在每株铁皮石斛组培苗基 部加入50 μ 1的无菌发酵液；15天后，再在每株铁皮石斛组培苗基部加入50 μ 1的无菌发 酵液。将相同体积的无菌水代替上述无菌发酵液，其余内容相同，作为空白对照组。上述实验组和空白对照组均在同实验1的条件下进行培养，培养结果如下60天后可见，实验组的铁皮石斛组培苗的平均生长状况优于空白对照组，实验组 中组培苗平均根长比空白对照组增加了 7.8%，植株高度比空白对照组增加了 7.3%，组培 苗植株鲜重和干重分别比空白对照组增加了 6. 6%和6. 3%。实验4、鞘氨醇单胞菌CCTCC NO =M 2010041发酵液对铁皮石斛组培苗促生长试验将上述实施例2所得的鞘氨醇单胞菌CCTCC NO =M 2010041发酵原液用孔径为 0. 45 μ m的滤膜过滤，得无菌发酵液。取该无菌发酵液接种于已在改良的铁皮石斛组培培养 基中培养了 30天的25株铁皮石斛组培苗，作为实验组；具体为在每株铁皮石斛组培苗基 部加入100 μ 1的无菌发酵液。将相同体积的无菌水代替上述无菌发酵液，其余内容相同，作为空白对照组。上述实验组和空白对照组均在同实验1的条件下进行培养，培养结果如下60天后可见，实验组的铁皮石斛组培苗的平均生长状况优于空白对照组，实验组 中组培苗平均根长平均根长比空白对照组增加了 4.5%，植株高度比空白对照组增加了 5. 3%，实验组中组培苗植株鲜重和干重分别比空白对照组增加了 6. 和5. 3%。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
一种鞘氨醇单胞菌株，其特征是该鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株保藏名称为鞘氨醇单胞菌SH1，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉大学，保藏日期2010年2月4日，保藏号CCTCC NOM 2010041。
2.如权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌株的用途，其特征是用于铁皮石斛种苗促生长。
3.根据权利要求2所述的鞘氨醇单胞菌株的用途，其特征是将鞘氨醇单胞菌CCTCC NO =M 2010041发酵原液或发酵液接种于铁皮石斛组培苗的基部，从而促进铁皮石斛组培 苗生长。
全文摘要
本发明公开了一种鞘氨醇单胞菌株，该鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株保藏名称为鞘氨醇单胞菌SH1，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉大学，保藏日期2010年2月4日，保藏号CCTCC NoM 2010041。本发明还同时公开了上述鞘氨醇单胞菌株的用途用于铁皮石斛种苗促生长；具体为将鞘氨醇单胞菌CCTCC NoM2010041发酵原液或发酵液接种于铁皮石斛组培苗的基部，从而促进铁皮石斛组培苗生长。
文档编号C12N1/20GK101921718SQ201010125409
公开日2010年12月22日 申请日期2010年3月16日 优先权日2010年3月16日
发明者俞婕, 张珊珊, 胡秀芳, 董飞, 赵凯鹏, 陈集双 申请人:浙江理工大学