专利名称：一种用mdck细胞获得流感病毒高产毒株的方法
技术领域：
本发明涉及一种用哺乳动物细胞获得流感病毒疫苗毒株制备方法，特别涉及一种用MDCK细胞获得流感病毒毒株的方法。
背景技术：
流感病毒是威胁人类健康的重大传染病之一，主要通过呼吸道传播，具有传播速度快，致死率高及快速变异的特点，在人类历史上多次发生过多次全球范围的流感大流行。 流感病毒分为A，B，C(又称甲、乙、丙)三型。其中A型病毒容易发生变异，依其两种主要抗原(HA，NA)的不同，区分为不同的亚型。现发现一共有15种HA(H1-H15)及9种NA(N1_N9) 亚型。B型病毒的变异比较缓慢，C型病毒甚少对人类造成威胁。疫苗免疫仍是目前预防控制流感流行的行之有效的手段，临床上应用的是用鸡胚生产的三价灭活疫苗。早在20世纪30年代，流感的灭活疫苗就开展了动物实验研究。1941 年鸡胚培养的流感疫苗在美国首次获得批准。目前应用的流感疫苗为三价灭活疫苗包括 Hmi、H3N2、B型。但是经过多年的临床应用表明，灭活的流感病毒疫苗的效果基本上是肯定的，但也有不理想的地方，主要由于1、疫苗株与当前流行的毒株不匹配，因为疫苗的生产需要经过疫苗株的筛选和制备阶段，耗时的特点限制了它的合理时效；2、鸡胚供应和生长活性的限制，导致流感病毒的低产值；3、部分接种者对鸡胚蛋白过敏，甚至危及到生命。近年来流感病毒全球流行有愈演愈烈之势，对流感病毒疫苗的需求日趋增加。在研发的非鸡胚培养的新型流感疫苗中利用哺乳动物细胞(主要是MDCK细胞) 代替鸡胚培养病毒，可以达到降低成本，减少过敏反应，培养后的病毒株更接近自然分离的病毒(即病毒的抗原性保持不变)的特点。而且经过试验表明，MDCK被连续传代100代， 每代均做鼠的成瘤性实验结果阴性，证明该细胞系不具备致瘤性，用于疫苗生产也是安全可靠的。传统上利用哺乳动物细胞培养新型流感疫苗毒株是利用弱毒株与当前流行的毒株进行基因重配获得，而弱毒株疫苗的生产要有冷适应毒株与流行毒株重配的步骤，通过免疫压力筛选大约需要1-2个月的时间才能获得重组毒株，而在疫苗的生产过程中，疫苗生产周期的长短决定了对流感病毒变异的反应能力，也直接决定了疫苗的质量，因此能否在较短的周期内制备高产的毒株成为疫苗生产过程中亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种制备周期短，只需一周左右时间，具有高产特性的流感病毒疫苗毒株的制备方法。本发明的解决方案是一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，包括以下步骤步骤一对流感病毒毒株进行筛选，选取5 50株原始毒株行10-3-10-4稀释，取 200 μ L-1000 μ L稀释液接种在成片生长的MDCK细胞上，放置在(X)2培养箱中1 2个小时，等到病毒完全吸附后取出，在M 72小时之间加入浓度为1 y g/ml-4 U g/ml TPCK胰酶显 微镜下观察细胞病变(〔？幻，当细胞病变(cpm呈“冊”时，收获病毒；步骤ニ 用50%组织细胞感染量(TCID50)方法或微型生物群落监测方法(PFU 法)来检测和计算病毒株的毒ヵ；步骤三提取流感病毒基因组RNA ；步骤四RT-PCR扩增流感病毒各基因节段；步骤五对PCR产物进行纯化；步骤六用氯化韩法制备感受态宿主菌；步骤七制备质粒DNA限制性内切酶体系，此体系包括IOX限制性内切酶缓冲液 1 y 1-2 U 1lOX乙酰化BSA(lmg/ml) Iu l-2u 1质粒0嫩0.2ug-1.0ug限制性内切酶2U-4U灭菌去离子水10ia-20iU;步骤八0嫩片段回收；步骤九制备以下体系进行连接反应，5XT4DNA Ligase Buffer 2u l-4u 1PGEM-3ZF 载体(50ng/ U 1) 1 U 1-2 U 1PCR 产物(经纯化)2 U 1-5 U 1T4DNA Ligase0. 5 U 1-1 U 1去离子水5 U 1-8 U 1步骤十提取质粒小量；步骤^^一将PCR扩增的片段克隆到pGEM-3zf 载体的Sma 1酶切位点中，采用八81 PRISMTM 377XL DNA %9じ61106『进行测序，从而确定高产毒株的基因序列；步骤十ニ 利用Vector NTI软件进行核酸和蛋白质序列的对比，利用DNASTAR软 件进行蛋白质翻译分析。所述步骤ー中优选10株原始毒株行10_3-10_4稀释，取500 U L稀释液接种在成片 生长的1 0(细胞上，放置在0^培养箱中1个小时，等到病毒完全吸附后取出，在48小时之 间加入浓度为2 U g/mlTPCK胰酶显微镜下观察细胞病变(CPm，当细胞病变(CP^呈“冊” 时，收获病毒。所述步骤ニ中优选用50%组织细胞感染量(TCID50)方法来检测和计算病毒株的 母カ。所述50%组织细胞感染量(TCID50)方法是将病毒株行倍比稀释，接种对孔板，锋 稀释度设置平行4个复孔，锋孔加入200 Uし稀释液，35"C CO2培养箱孵育1小时后用Hank’ s 液洗ー遍，然后加入含终浓度2 U g/mlTPCK胰酶的维持液3ml后置35でCO^培养箱培养，并 于感染后M，48，72小时再分别加入终浓度2ilg/mlTPCK胰酶，促进病毒增埴，在感染后的 72小时收获病毒。所述步骤三中提取流感病毒基因组8離方法为取10011し病毒液，加入 l 5mLEppendorf管中，然后加入 500ilL Lysis BufferRLT、0-巯基乙醇、60011し 70%乙醇，混勻，吸出600 μ L混合液进行离心，收集离心液，即为纯化提取的病毒RNA。所述步骤四中RT-PCR扩增流感病毒各基因节段，选用病毒反转录试剂盒RT-PCR System对模板RNA进行反转录或Pfu DNAPolymerase进行PCR扩增。所述步骤五中对PCR产物进行纯化的方法是通过PCR产物纯化试剂盒，把纯化柱放置在2mL收集管上，将PCR产物混同5倍体积的PB Buffer,进行离心收集，然后加40 μ L 双蒸水静置充分溶解洗脱DNA。所述步骤六中用氯化钙法制备感受态宿主菌的方法为取DH5CI单菌落，接种无抗菌素LB培养液，振摇培养，当至菌液0D600nm值为0. 4-0. 6时停止培养，于冰上预冷10 分钟，离心后加入灭菌甘油，混勻，分装于Eppendorf管中，贮于低温冰箱中。所述步骤八中DNA片段回收的方法为采用Gibco-BRL DNA凝胶回收试剂盒对酶切产生的线形化载体DNA进行回收。所述步骤十中提取质粒小量的方法为取单菌落于5ml含氨苄青霉素(IOOg/ ml)的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，离心后将沉淀悬浮于150μ 1溶液I(50mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，lOmmol/LEDTA, PH8. 0)，冰浴 5 分钟；加新鲜配制 20 μ 1 溶液 II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，混勻，冰浴 10 分钟；加入 150 μ 1 预冷的溶液 III (3. Omol/L KCl，ρΗ4. 8)，混勻，冰浴10分钟，再次离心，用70%乙醇洗涤沉淀一次，干燥后加入50 μ 1含 RNA 酶 Οθμ /ml)的 TE(10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA，ρΗ8· 0)，37°C 水浴 30 分钟。本发明的流感疫苗毒株制备方法是建立在流感病毒反向遗传学技术基础上的，方便体外对病毒基因的操作，在无辅助病毒存在的情况下，完全由质粒转染的形式获得疫苗病毒株，达到周期短，产量高的效果。流感病毒MDCK细胞高产株反向遗传技术平台的建立，其方法步骤如下1、流感病毒真核表达载体的构建以质粒pHH21为模板，扩增出一段全长27^pDNA产物。该序列含有225bp人源RNA polymerase I启动子和33bp鼠源RNApolymerase I终止子。PCR产物两端引入Avr II和 HindIII酶切位点。引物设计如下AAG CTTPl :5’ -GTG-----CGG AGT ACT GGT CGA CCT CCG AAG-3’HindIIICCT AGGP2 5' -ATC-----GGC GGC CGG GAG GGC GT-3'Avr IIPCR反应条件94°C预变性5分钟；94°C 30秒，55°C 30秒，72 "C 200秒，共30个循环；72°C延伸7分钟。PCR产物琼脂糖电泳检测，与目的片段大小相符，纯化PCR产物备用。将上述PCR产物用Avr II和HindIII双酶切，质粒载体pcDNA3. 1 (+)用Xba I和 HindIII双酶切，纯化回收相应片段；体外连接质粒载体与目的基因，转化大肠杆菌。挑选阳性克隆，酶切鉴定正确后送测序；测序结果与目的基因相符，命名载体为PIVV II ；2、流感病毒反向遗传8质粒及6+2质粒系统的构建将构建成功的PIVV II质粒载体用BSMBl酶切线性化，然后用Qiagen回收试剂盒回收线性化的PIVV II片段。同样，将连接到PGEM-T载体的目的基因片段用BSMBI酶切，回收目的片段。将A/CNIC/246/00(Hmi)的1-8节段分别连接到PIVV II载体上，体系为 3 μ 1目标片段，1 μ 1载体，1 μ 1T4DNA连接酶15 μ lddH20,从而得到连接产物PIVV II-AX 系列8质粒。另外将甲1亚型流行代表株A/沪防/7/99的HA，NA基因片段扩增，依上述方法克隆入PIW II。替代pIVV II-AX系列中的HA，NA质粒，构成6+2系列。3、转化将得到的连接产物转化到感受态菌(Sure菌)中，42°C热休克60秒，冰浴5分钟， 37°C震荡(转速小于200转/分钟)45分钟，离心，取沉淀涂布抗性平板，37°C孵育过夜，次日挑单菌落接种于5ml含抗菌素的LB培养基中，37°C震荡过夜后小提质粒。4、酶切鉴定用内切酶鉴定目标序列是否与载体相连，实验条件参照相关酶的使用说明。5、质粒的大量制备(聚乙二醇沉淀法)挑取单菌落接种5ml含氨苄青霉素(lOOug/ml)的LB培养基中，37°C震荡培养过夜。将培养物转接200ml含氨苄青霉素(lOOug/ml)的LB培养基中，37°C剧烈振荡培养12-16小时，5000rpm离心15分钟，弃上清；重悬细菌于IOOml冰预冷STE (0. Imol/ LTris-HCL, lmmol/L EDTA PH8. 0)。5000rpm 离心 15 分钟，收集细菌；IOml 溶液 1 (50mmol/ L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCL, IOmmo 1/L EDTAPH8. 0)重悬细菌，混勻，冰浴10分钟；加入20ml新配置的溶液2(0. 2mol/L NaOH 1 % SDS)，混勻，冰浴10分钟；加入15ml预冷的溶液3 (3. Omol/L KCL, PH4. 8)，混勻，冰浴10分钟；IOOOOrpm离心15分钟，弃沉淀；加入等体积的预冷异丙醇，混勻，-20°C沉淀1小时；IOOOOrpm离心15分钟，弃上清，干燥； 3ml TE(10mmol/L Tris-HCL, lmmol/L EDTA, PH8. 0)溶解沉淀，再加入 3ml 冰预冷的 5mol/ L LiCl溶液，充分混勻，IOOOOrpm离心15分钟，弃沉淀；上清中加入等体积冰预冷的异丙醇，充分混勻，IOOOOrpm离心15分钟，弃上清，干燥沉淀；用500 μ 1含RNA酶(20 μ g/ml) 的TE(10mmol/L EDTA, ρΗ8· 0)溶解沉淀，转移到Eppendorf管中，室温放置30分钟；加入 500μ 1含13%聚乙二醇8000的1.6mol/L NaCl，充分混勻，_20°C沉淀2小时，于台式离心机上12000rpm离心10分钟，弃上清；400 μ 1 ΤΕ(ρΗ8. 0)溶解沉淀，用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次；转移水相于新的Eppendorf管，加100 μ 1 10Μ乙酸铵，充分混勻，加2倍体积乙醇，-20°C沉淀1小时，12000rpm离心10分钟。70%冰预冷乙醇洗涤沉淀一次，晾干；50 μ 1 ΤΕ(ρΗ8. 0)溶解沉淀，储存于_20°C冰箱备用。6、转染将四31~细胞培养在六孔细胞培养板中。80%成片后，将8个质粒DNA各取Iyg 共8 μ g与20 μ 1LF2000混合在室温放置45分钟，然后加入到培养板内。6小时后，用 optim-MEM维持液在33°C孵箱中继续孵育，分别收获M小时，48小时和72小时的细胞培养上清接种MDCK细胞，维持液中含TPCK-Trypsin至终浓度1 μ g/ml。7、重配病毒单向血凝抑制实验鉴定首先RDE处理标准参照血清，然后制备用于血凝抑制试验的4个血凝单位的抗原。 具体实施单向血凝抑制实验的步骤加PBS或生理盐水25 μ 1于96孔板的第B行至H行的每一孔。加1 10稀释的经受体破坏酶处理过的标准血清50 μ 1于A行的每一孔。用多通道移液器从A行各孔取25 μ 1血清，倍比稀释至H排各孔，最后25 μ 1弃去。取25 μ 1被检病毒的4个血凝单位抗原加至相应一排各孔，混勻，室温静置15-30min，所有孔中加50 μ 1的红血球(0. 5%鸡红细胞或0. 75%豚鼠红细胞)，室温静置30-60min(鸡血球30min ；豚鼠血球60min)后观察结果。结果判定血凝被完全抑制的血清最大稀释度的倒数为血凝抑制试验的终点，该孔稀释度即为HI实验的效价。8,6+2重配病毒的基因型鉴定收获重配病毒，依第一章实验方法所述提取病毒核酸，应用甲1亚型特异性引物作RT-PCR，用QIAGEN公司的试剂盒回收PCR产物，然后测定DNA序列，结果提交NCBI比对。
具体实施例方式结合具体实施列进行说明。实施例1通过以下步骤用MDCK细胞获得流感病毒高产Hmi毒株1、高产Hmi毒株的筛选将10株备选毒株Hmi (经MDCK细胞分离，病毒滴度彡1 160的原始毒株)行 10_3，10_4稀释。取500 μ L病毒稀释液接种成片生长的MDCK细胞05cm2培养瓶)，细胞记数约3-4X 106，接种前细胞用Hank，s液洗两遍。正常MDCK细胞，细胞计数密度为3-4X106， 病毒的接种量MOI为1X10_4TCID50/细胞和X10_5TCID50/细胞。维持液中含有TPCK胰酶，并于感染后的对，48小时分别加入，使TPCK胰酶的终浓度达到1 μ g/ml。置于35°C CO2 培养箱培养，于感染后72小时或96小时收获病毒，测定病毒血凝滴度。置35°C CO2培养箱1小时，待病毒完全吸附后，弃感染液，用Hank's液洗一遍。每瓶细胞加入含终浓度2 μ g/ml TPCK胰酶的细胞维持液:3ml，置35°C CO2培养箱培养。并于感染后M，48，72小时再分别加入终浓度2 μ g/mlTPCK胰酶，促进病毒增殖。细胞感染后48 小时，镜下观察细胞病变(CPE)。当CPE呈冊时，收获病毒。病毒滴度测定，采用红细胞凝集实验，计算血凝单位。2、Hmi毒株的毒力检测TCID50检测和计算将Hmi毒株行倍比稀释，接种M孔板，每稀释度设置平行4 个复孔。每孔加入200 μ L稀释液，35°C CO2培养箱孵育1小时后用Hank’ S液洗一遍。然后加入含终浓度2 μ g/mlTPCK胰酶的维持液3ml后置35°C CO2培养箱培养。并于感染后24， 48，72小时再分别加入终浓度2 μ g/mlTPCK胰酶，促进病毒增殖。在感染后的72小时收获病毒。-80°C冰箱冻存，待血凝滴度的测定。PFU检测将Hmi毒株进行倍比稀释，接种于小方瓶，每小方瓶加入500 μ L病毒稀释液，33°C孵育1小时后，用HANKS液冲洗，然后加入第一层覆盖液，33°C孵育72小时后加入第二层覆盖液，24小时后计数空斑。3、HlNl病毒基因组RNA的提取取10(^1^病毒液，加入1.51111^ 611(10什管中，然后加入50(^1^ Lysis Buffer RLT、β -巯基乙醇、600 μ L 70%乙醇，混勻，吸出600微升混合液转入带吸附柱的离心管中，12000rmp离心15秒，弃离心液。将上部剩余的其它液体再此上柱离心。12000rmp离心 15秒,弃离心液。向柱内力口入700yL Washing Buffer冊1，12000rmp离心15秒，弃离心液。将柱子移到新的收集管上，加入500 μ L WashingBuffer RPE，12000rmp离心15秒，弃离心液。再于柱子上加入500 μ L Washing Buffer RPE，13000_14000rmp离心2分钟。将柱子移到一无^ia se污染的Eppendorf管上，加入40 μ LDEPC处理的水，室温放置1_3分钟，12000rmp离心1分钟，收集离心液，即为纯化提取的病毒RNA。4、RT-PCR扩增流感病毒各基因节段使用GIBCO BRL公司的病毒反转录试剂盒THERMOSCRIPT RT-PCRSystem对模板 RNA进行反转录。取一只无Rnase，无Dnase的Eppendorf管，依次加入RNA 模板5 μ L引物 F QOpM) 1 μ LddH204 μ L混勻后，在90°C水浴中加热3分钟，置于冰浴3分钟使之迅速冷却。然后加入cDNA Buffer 4 μ LDEPC-water 1 μ L0. IM DTT1 μ LRnase OUT1 μ LdNTPs2 μ LRT1 μ L60°C作用1小时，85°C 5分钟，然后置冰上。加foiaseH 1 μ L 37°C作用30分。即为反转录好的cDNA。此步反应由通用引物完成全部8个基因节段的反转录。使用STRATAGENE 公司 Pfu DNA Polymerase 进行 PCR 扩增 PCR 反应体系10XPCR Buffer 5μ LdNTPs1 μ LPrimer F(20pM) 1 μ LPrimer R(20pM) 1 μ LPfu 酶(5U/ μ L) 1 μ LcDNA2 μ LddH2040 μ LTotal50 μ LPCR反应条件94 °C预变性5分钟94°C30 秒55°C30 秒72 "C 420 秒；共 30 个循环72 °C延伸5分钟5、PCR产物的纯化采用PCR产物纯化试剂盒，具体步骤如下把纯化柱放置在aiiL收集管上，将PCR 产物混同5倍体积的PB Buffer，上柱，13000rmp离心45秒，弃离心液。向纯化柱中加 750 μ L的PE Buffer, 13000rmp离心45秒，弃离心液。以同样的速度再离心1分钟充分去除洗液。将柱子放在一支干净的Eppendorf管上，加40 μ L双蒸水静置充分溶解洗脱DNA。 13000rmp离心1分钟收集离心液，_20°C保存。
6、用氯化钙法感受态宿主菌的制备取DH5ci单菌落，接种无抗菌素LB培养液，37°C振摇培养过夜，次日按1 100转入新的LB中继续培养2小时左右，至菌液0D600nm值为0. 4-0. 6时停止培养。于冰上预冷10分钟，4°C、5000rpm离心10分钟，弃上清；以IOml冰预冷的0. lmol/L CaCl2重悬细胞，放置于冰浴中20分钟；4°C、5000rpm离心10分钟，弃上清；按每50ml培养物加入2ml 冰预冷的0. lmol/L CaCl2的比例重悬细胞沉淀，再加入15%体积灭菌甘油，混勻，分装于 Eppendorf管中，贮于_70°C低温冰箱中备用。7、质粒DNA限制性内切酶消化取一灭菌Eppendorf管，依次加入限制性内切酶缓冲液、乙酰化BSA、质粒DNA、限制性内切酶，并以灭菌的去离子水补充至所需体积。以20 μ 1总反应体系为例IOX限制性内切酶缓冲液2μ1IOX 乙酰化 BSA(lmg/ml) 2μ 1质粒DNAΙ.ΟμΙ限制性内切酶4U灭菌去离子水补充至20 μ 1混勻，于离心机上快速离心5秒，将反应管至于37°C水浴保温1-4小时。8、DNA片段回收采用Gibco-BRL DNA凝胶回收试剂盒对酶切产生的线形化载体DNA进行回收，方法如下将待回收的DNA片段经电泳分离后，在长波紫外光下从琼脂糖凝胶上切下所需DNA 片段，转移到1. 5mlEppendorf管中，于天平上称量，然后用1个吸头捣碎，动作轻柔；加入60 μ 1 Ll Buffer,在50°C水浴中加热15min，每!Bmin摇动1次，使琼脂糖完全融化。将液体转入吸附柱中，放在套管上，13000rpm离lmin;倒掉套管中的液体，向吸附柱中加入 500 μ 1 Ll Buffer，，室温下放置lmin，1300rpm离Imin ；弃去套管中的液体，向吸附柱中加入700μ1 L2 Buffer，室温下放置5min，13000rpm离Imin ；弃去管中的液体，再以1300rpm 离Imin ；将吸附柱放于1. 5mlEppendorf管中，加入30μ 1去离子水(或TE溶液，IOmmol/ LTris-HCL, lmmol/L EDTA，ph8. 0)，室温下放置 lmin，13000rpm 离心 2min，所得液体中即含有回收的DNA片段，置于-20°C保存。9、连接反应体系的制备与转化按下列体系进行连接反应5XT4DNA Ligase Buffer4μ 1PGEM-3ZF 载体(50ng/ μ 1)2 μ 1PCR产物(经纯化)5 μ 1T4DNA Ligase1 μ 1去离子水8μ1 混合均勻后，于4°C连接过夜。取上述连接产物5 μ 1，加入到100 μ 1 DH5a感受态细菌中，置冰浴上45min后，42°C热休克2min，再置于冰浴上2min，加入无抗生素的LB培养液400 μ 1，37°C摇床振摇Ih后，取100 μ 1菌液，向其中加入40 μ 1 120mg/ml 5，-溴-4 氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)及4μ 120mg/ml异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，混勻后涂布含氨苄青霉素(100 μ g/ml)的LB平板，37°C培养12_16h，挑取白色菌落，培养后提取质粒进行酶切鉴定。10、提取质粒小量取单菌落于5ml含氨苄青霉素(100g/ml)的LB培养基中，37 ！振荡培养过夜， 取1. 5ml菌液加入Eppendorf管中，5000rpm离心1分钟，弃上清，沉淀悬浮于150 μ 1溶液 I (50mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA, PH8. 0)，冰浴 5 分钟；加新鲜配制20 μ 1溶液II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，混勻，冰浴10分钟；加入150 μ 1预冷的溶液 III (3. Omol/L KCl, ρΗ4· 8)，混勻，冰浴10分钟· 12000rpm5分钟，转移上清至新的离心管， 加等体积酚/氯仿抽提；转移上层相至新的离心管，再用等体积氯仿抽提一次。取上清，加入2倍体积无水乙醇，混勻，_20°C沉淀30分钟，12000离心5分钟。70%乙醇洗涤沉淀一次， 干燥后加入 50 μ 1 含 RNA 酶(20 μ 1/ml)的 TE(10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA，pH8.0)， 37°C水浴30分钟，_20°C保存备用。11、将PCR扩增的片段以平端连接的方式克隆到pGEM-3zf载体的Sma I酶切位点中，采用ABI PRISMTM 377XL DNA kquencer进行测序。为了保证病毒基因组中的点突变是高产毒株所特有的，而不是PCR过程中发生的变异，我们对每一个基因节段至少测定3个克隆，并且各克隆序列符合率> 99%，从而确定高产毒株的基因序列。12、利用Vector NTI软件进行核酸和蛋白质序列的对比，利用DNASTAR软件进行蛋白质翻译分析。制备好毒株后，将10株流感病毒MDCK分离株血凝滴定，再进行10-3，10-4稀释接种细胞，两代后血凝滴度仍保持> 1 160有四株，四代后血凝滴度仍保持> 1 160有两株，五代以上仍保持高产特性的有一株，命名为A/CNIC/246/00 (Hmi)。
图1为高产Hmi毒株细胞传代记录图。由上图可知，HlNl病毒株在传代5代以后滴度> 1 640，高产性状稳定下来。再对上述高产毒株做血凝抑制实验，试验结论如下
^^^^Antiseram virusesA/SH/7/99 (HlNl)A/BJ/1/86 (HlNl)Pl1:12801:160PlO1:12801:160P151:12801:160由上表可知高产毒株A/CNIC/246/2000(Hmi)Pl，P10, Ρ15代之间针对两种标准血清的血凝抑制效价没有差别，初步证实高产毒株的抗原性保持不变。高产毒株针对当前流行毒株A/SH/7/99 (HlNl)的血凝抑制效价比A/BJ/1/86 (Hmi)的血凝抑制效价要高。实施例2通过以下步骤用MDCK细胞获得流感病毒高产Η2Ν2毒株1、高产Η2Ν2毒株的筛选将5株备选毒株Η2Ν2(经MDCK细胞分离，病毒滴度彡1 160的原始毒株)行10_3，10_4稀释。取200 μ L病毒稀释液接种成片生长的MDCK细胞Q5cm2培养瓶)，细胞记数约3-4X 106，接种前细胞用Hank’ s液洗两遍。维持液中含有TPCK胰酶，并于感染后的 24，48小时分别加入，使TPCK胰酶的终浓度达到1 μ g/ml。置于35°C CO2培养箱培养，于感染后96小时收获病毒，测定病毒血凝滴度。置35°C CO2培养箱1. 5小时，待病毒完全吸附后，弃感染液，用Hank’ s液洗一遍。每瓶细胞加入含终浓度2 μ g/mlTPCK胰酶的细胞维持液:3ml，置35°C CO2培养箱培养。并于感染后对，48，72小时再分别加入终浓度2 μ g/mlTPCK 胰酶，促进病毒增殖。细胞感染后48小时，镜下观察细胞病变(CPE)。当CPE呈冊时，收获病毒。病毒滴度测定，采用红细胞凝集实验，计算血凝单位。2、H2N2毒株的毒力检测PFU检测将H2N2毒株进行倍比稀释，接种于小方瓶，每小方瓶加入500 μ L病毒稀释液，33°C孵育1小时后，用HANKS液冲洗，然后加入第一层覆盖液，33°C孵育72小时后加入第二层覆盖液，24小时后计数空斑。3、H2N2病毒基因组RNA的提取取10(^1^病毒液，加入1.51111^口口611(10什管中，然后加入50(^1^ Lysis Buffer RLT、β -巯基乙醇、600 μ L 70%乙醇，混勻，吸出600微升混合液转入带吸附柱的离心管中，12000rmp离心15秒，弃离心液。将上部剩余的其它液体再此上柱离心。12000rmp离心 15秒，弃离心液。向柱内力口入700yL Washing Buffer冊1，12000rmp离心15秒，弃离心液。将柱子移到新的收集管上，加入500 μ L Washing Buffer RPE，12000rmp离心15秒，弃离心液。再于柱子上加入500 μ L Washing Buffer RPE，13000_14000rmp离心2分钟。将柱子移到一无toase污染的Eppendorf管上，加入40 μ LDEPC处理的水，室温放置1_3分钟， 12000rmp离心1分钟，收集离心液，即为纯化提取的病毒RNA。4、RT-PCR扩增流感病毒各基因节段使用GIBCO BRL公司的病毒反转录试剂盒THERMOSCRIPT RT-PCRSystem对模板 RNA进行反转录。取一只无Rnase，无Dnase的Eppendorf管，依次加入RNA 模板5yL引物 F QOpM) 1 μ LddH204μ L混勻后，在90°C水浴中加热3分钟，置于冰浴3分钟使之迅速冷却。然后加入cDNA Buffer 4μ LDEPC-water 1 μ L0. IM DTT1 μ LRnase OUT1 μ LdNTPs2μ LRT1 μ L60°C作用1小时，85°C 5分钟，然后置冰上。加foiaseH 1 μ L 37°C作用30分。即为反转录好的cDNA。此步反应由通用引物完成全部8个基因节段的反转录。使用STRATAGENE 公司 Pfu DNA Polymerase 进行 PCR 扩增PCR反应体系0161]10XPCR Buffer5 μ L0162]dNTPs1 μ L0163]Primer F(20pM)1 μ L0164]Primer R(20pM)1 μ L0165]Pfu 酶(5U/ μ L)1 μ L0166]cDNA2μ L0167]ddH2040 μ L0168]Total50 μ L0169]PCR反应条件0170]94°C预变性5分钟0171]94 °C 30 秒0172]55 °C 30 秒0173]72 °C 420秒；共30个循环0174]72°C延伸5分钟0175]5、PCR产物的纯化0176]采用PCR产物纯化试剂盒，具体步骤如下把纯化柱放置在2mL收集管上，将PCR
产物混同5倍体积的PB Buffer，上柱，13000rmp离心45秒，弃离心液。向纯化柱中加 750 μ L的PE Buffer, 13000rmp离心45秒，弃离心液。以同样的速度再离心1分钟充分去除洗液。将柱子放在一支干净的Eppendorf管上，加40 μ L双蒸水静置充分溶解洗脱DNA。 13000rmp离心1分钟收集离心液，_20°C保存。6、用氯化钙法感受态宿主菌的制备取DH5ci单菌落，接种无抗菌素LB培养液，37°C振摇培养过夜，次日按1 100转入新的LB中继续培养2小时左右，至菌液0D600nm值为0. 4-0. 6时停止培养。于冰上预冷10分钟，4°C、5000rpm离心10分钟，弃上清；以IOml冰预冷的0. lmol/L CaCl2重悬细胞，放置于冰浴中20分钟；4°C、5000rpm离心10分钟，弃上清；按每50ml培养物加入2ml 冰预冷的0. lmol/L CaCl2的比例重悬细胞沉淀，再加入15%体积灭菌甘油，混勻，分装于 Eppendorf管中，贮于_70°C低温冰箱中备用。7、质粒DNA限制性内切酶消化取一灭菌Eppendorf管，依次加入限制性内切酶缓冲液、乙酰化BSA、质粒DNA、限制性内切酶，并以灭菌的去离子水补充至所需体积。以20 μ 1总反应体系为例IOX限制性内切酶缓冲液 Ιμ IOX 乙酰化 BSA(lmg/ml) 1 μ 1质粒DNA0. 2μ 1限制性内切酶2U灭菌去离子水补充至10 μ 1混勻，于离心机上快速离心5秒，将反应管至于37°C水浴保温1-4小时。8、DNA片段回收采用Gibco-BRL DNA凝胶回收试剂盒对酶切产生的线形化载体DNA进行回收，方法如下将待回收的DNA片段经电泳分离后，在长波紫外光下从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段，转移到1.5mlEppendorf管中，于天平上称量，然后用1个吸头捣碎，动作轻柔；加入 60 μ 1 Ll Buffer，在50°C水浴中加热15min，每;3min摇动1次，使琼脂糖完全融化。将液体转入吸附柱中，放在套管上，13000rpm离Imin ；倒掉套管中的液体，向吸附柱中加入500 μ 1 Ll Buffer，，室温下放置lmin，1300rpm离心Imin ；弃去套管中的液体，向吸附柱中加入 700 μ 1 L2 Buffer，室温下放置5min，13000rpm离心Imin ；弃去管中的液体，再以1300rpm 离Imin ；将吸附柱放于1. 5mlEppendorf管中，加入30 μ 1去离子水(或TE溶液，IOmmol/ LTris-HCL, lmmol/L EDTA，ph8. 0)，室温下放置 lmin，13000rpm 离心 2min，所得液体中即含有回收的DNA片段，置于-20°C保存。9、连接反应体系的制备与转化按下列体系进行连接反应5XT4DNA Ligase Buffer 2μ 1PGEM-3ZF 载体(50ng/ μ 1) 1 μ 1PCR产物(经纯化)2 μ 1T4DNA Ligase0. 5 μ 1去离子水5μ1混合均勻后，于4°C连接过夜。取上述连接产物5 μ 1，加入到100 μ 1 DH5a感受态细菌中，置冰浴上45min后，42°C热休克2min，再置于冰浴上2min，加入无抗生素的LB培养液400 μ 1，37°C摇床振摇Ih后，取100 μ 1菌液，向其中加入40 μ 1 120mg/ml 5，-溴-4 氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)及4 μ 1 20mg/ml异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，混勻后涂布含氨苄青霉素(100 μ g/ml)的LB平板，37°C培养12_16h，挑取白色菌落，培养后提取质粒进行酶切鉴定。10、提取质粒小量取单菌落于5ml含氨苄青霉素(100g/ml)的LB培养基中，37°C振荡培养过夜， 取1. 5ml菌液加入Eppendorf管中，5000rpm离心1分钟，弃上清，沉淀悬浮于150μ 1溶液 I (50mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA, PH8. 0)，冰浴 5 分钟；加新鲜配制20 μ 1溶液II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，混勻，冰浴10分钟；加入150 μ 1预冷的溶液 III (3. Omol/L KCl, ρΗ4· 8)，混勻，冰浴10分钟· 12000rpm5分钟，转移上清至新的离心管， 加等体积酚/氯仿抽提；转移上层相至新的离心管，再用等体积氯仿抽提一次。取上清，加入2倍体积无水乙醇，混勻，_20°C沉淀30分钟，12000离心5分钟。70%乙醇洗涤沉淀一次， 干燥后加入 50 μ 1 含 RNA 酶(20 μ 1/ml)的 TE(10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA，pH8.0)， 37°C水浴30分钟，_20°C保存备用。11、将PCR扩增的片段以平端连接的方式克隆到pGEM-3zf载体的Sma I酶切位点中，采用ABI PRISMTM 377XL DNA kquencer进行测序。为了保证病毒基因组中的点突变是高产毒株所特有的，而不是PCR过程中发生的变异，我们对每一个基因节段至少测定3个克隆，并且各克隆序列符合率> 99%，从而确定高产毒株的基因序列。12、利用Vector NTI软件进行核酸和蛋白质序列的对比，利用DNASTAR软件进行蛋白质翻译分析。所测高产H2N2毒株细胞传代记录与图1大体一致。实施例3
通过以下步骤用MDCK细胞获得流感病毒高产H3N2毒株与实施例1的不同之处在于，在第一步骤中筛选50株原始毒株H3N2行10_4稀释， 取1000 μ L稀释液接种在成片生长的MDCK细胞上，放置在(X)2培养箱中2个小时，等到病毒完全吸附后取出，在72小时之间加入浓度为4 μ g/ml TPCK胰酶显微镜下观察细胞病变 (CPE)，当细胞病变(CPE)呈“冊”时，收获病毒；其它步骤相同。所测高产H3N2毒株细胞传代记录与图1大体一致。
权利要求
1. 一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于包括以下步骤 步骤一对流感病毒毒株进行筛选，选取5 50株原始毒株行KT3-IO-4稀释，取 200 μ L-1000 μ L稀释液接种在成片生长的MDCK细胞上，放置在(X)2培养箱中1 2个小时， 等到病毒完全吸附后取出，在M 72小时之间加入浓度为1 μ g/ml-4 μ g/ml TPCK胰酶显微镜下观察细胞病变(CPE)，当细胞病变(CPE)呈“冊”时，收获病毒；步骤二 用50%组织细胞感染量(TCID50)方法或微型生物群落监测方法(PFU法)来检测和计算病毒株的毒力；步骤三提取流感病毒基因组RNA ；步骤四=RT-PCR扩增流感病毒各基因节段；步骤五对PCR产物进行纯化；步骤六用氯化钙法制备感受态宿主菌；步骤七制备质粒DNA限制性内切酶体系，此体系包括IOX限制性内切酶缓冲液 IOX 乙酰化 BSA(lmg/ml) 质粒DNA 限制性内切酶灭菌去离子水1 μ 1-2 μ 1 1 μ 1-2 μ 1 0. 2μ g-1. 0μ g2U-4U10 μ 1-20 μ 1 ；步骤八DNA片段回收；步骤九制备以下体系进行连接反应，5XT4DNA Ligase Buffer PGEM-3ZF 载体(50ng/ μ 1) PCR产物(经纯化) T4DNA Ligase 去离子水2 μ 1-4 μ 1 1 μ 1-2 μ 1 2 μ 1-5 μ 1 0. 5 μ 1-1 μ 1 5 μ 1-8 μ 1步骤十提取质粒小量；步骤i^一 将PCR扩增的片段克隆到pGEM-3zf载体的Sma I酶切位点中，采用ABI PRISMTM 377XL DNA kquencer进行测序，从而确定高产毒株的基因序列；步骤十二 利用Vector NTI软件进行核酸和蛋白质序列的对比，利用DNASTAR软件进行蛋白质翻译分析。
2.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于所述步骤一中优选10株原始毒株行10_3-10-4稀释，取500 μ L稀释液接种在成片生长的MDCK细胞上，放置在CO2培养箱中1个小时，等到病毒完全吸附后取出，在48小时之间加入浓度为2 μ g/ml TPCK胰酶显微镜下观察细胞病变(CPE)，当细胞病变(CPE)呈“冊”时，收获病毒。
3.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于所述步骤二中优选用50%组织细胞感染量(TCID50)方法来检测和计算病毒株的毒力。
4.根据权利要求3所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于所述50%组织细胞感染量(TCID50)方法是将病毒株行倍比稀释，接种M孔板，每稀释度设置平行4个复孔，每孔加入200 μ L稀释液，350C CO2培养箱孵育1小时后用Hank’ s液洗一遍，然后加入含终浓度2μ g/mlTPCK胰酶的维持液3ml后置35°C CO2培养箱培养，并于感染后M，48，72小时再分别加入终浓度2 μ g/mlTPCK胰酶，促进病毒增殖，在感染后的72 小时收获病毒。
5.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于所述步骤三中提取流感病毒基因组RNA方法为取IOOyL病毒液，加入 1. 5mLEppendorf 管中，然后加入 500μ L Lysis Buffer RLT、β -巯基乙醇、600 μ L 70% 乙醇，混勻，吸出600 μ L混合液进行离心，收集离心液，即为纯化提取的病毒RNA。
6.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于所述步骤四中RT-PCR扩增流感病毒各基因节段，选用病毒反转录试剂盒RT-PCR System对模板RNA进行反转录或Pfu DNA Polymerase进行PCR扩增。
7.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于所述步骤五中对PCR产物进行纯化的方法是通过PCR产物纯化试剂盒，把纯化柱放置在 2mL收集管上，将PCR产物混同5倍体积的PB Buffer,进行离心收集，然后加40 μ L双蒸水静置充分溶解洗脱DNA。
8.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于所述步骤六中用氯化钙法制备感受态宿主菌的方法为取DH5ci单菌落，接种无抗菌素 LB培养液，振摇培养，当至菌液0D600nm值为0. 4-0. 6时停止培养，于冰上预冷10分钟，离心后加入灭菌甘油，混勻，分装于Eppendorf管中，贮于低温冰箱中。
9.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于所述步骤八中DNA片段回收的方法为采用Gibco-BRL DNA凝胶回收试剂盒对酶切产生的线形化载体DNA进行回收。
10.根据权利要求1所述的一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，其特征在于所述步骤十中提取质粒小量的方法为取单菌落于5ml含氨苄青霉素(100g/ml) 的LB培养基中，37 °C振荡培养过夜，离心后将沉淀悬浮于150μ 1溶液I (50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl, lOmmol/LEDTA, PH8. 0)，冰浴 5 分钟；加新鲜配制 20 μ 1 溶液 II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，混勻，冰浴 10 分钟；加入 150 μ 1 预冷的溶液 III (3. Omol/L KCl，ρΗ4. 8)，混勻，冰浴10分钟，再次离心，用70%乙醇洗涤沉淀一次，干燥后加入50 μ 1含 RNA 酶(20 μ 1/ml)的 TE (10mmol/LTris-HCl，lmmol/L EDTA, ρΗ8· 0)，37°C水浴 30 分钟。
全文摘要
本发明提供一种用MDCK细胞获得流感病毒高产毒株的方法，通过以下步骤进行制备对流感病毒毒株的筛选；对流感病毒株的毒力检验；流感病毒基因组RNA的提取；RT-PCR扩增流感病毒各基因节段；PCR产物的纯化；用氯化钙法制备感受态宿主菌；制备质粒DNA限制性内切酶；DNA片段回收；用体系惊醒连接与转化；提取质粒小量；进行序列测定和与病毒原始序列对比；用此方法生产的流感病毒毒株制备周期短(一周左右时间)，具有高产特性。
文档编号C12N7/00GK102191225SQ20101012595
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月17日 优先权日2010年3月17日
发明者李福胜 申请人:李福胜