专利名称：一种基于拟南荠菜的辐射旁效应早期过程验证实验方法
技术领域：
本发明涉及生物学及辐射检测领域，具体为一种基于拟南荠菜的辐射旁效应早期 过程验证实验方法。
背景技术：
在传统意义上，辐射效应的原理是电离辐射的能量沉积在辐射靶(如DNA、蛋白 等)中，诱发辐射损伤，进而产生后续生物效应。但是近年来研究发现，辐射效应不局限于 直接受到辐射的细胞，未受辐射的旁区细胞(Bystander)细胞也表现出与受照射细胞相似 的生物效应，即辐射诱导的旁效应(Radiation inducedbystander effect，RIBE)。自1992年辐射旁效应发现以来的16年间，辐射旁效应主要采用离体细胞研究 体系。研究体系主要分为两种，一是共培养体系，它是指未受照射细胞与受照射细胞共 同培养(有直接的物理接触)来研究未受辐照细胞的生物学效应。该培养方法的特点 是受照射细胞和研究旁效应的细胞间能直接进行诸如间隙连接的信号交流(GJMC，Gap JunctionMediated cell-cell Communication)，因而可用于研究细胞间隙连接通讯介导 的辐射旁效应。共培养法可以通过部分辐射体外培养长满的单层、多层、三维组织细胞群体 或者个体部分区域实现。另外一种体系是培养基转移法则是指用受辐射细胞的培养基(条 件培养基，ICCM，Irradiated CellConditioned Medium)处理未受辐射的细胞(受体细胞) 来研究受体细胞在条件培养基作用下的生物学反应。这类方法的特点是受照射细胞与研究 辐射旁效应细胞间没有直接接触，因而用于研究细胞受照射后通过培养基释放的可溶性因 子在诱导旁效应过程中的作用。培养基转移法可以通过分散培养的单个细胞、内外环分别 培养的细胞或者人为转移培养基的方法实现。离体细胞体系虽然具有很多优点，但是它不具备多细胞的三维形态和通讯联系， 不能反映真实的活体生命状态，在机理研究和辐射效应评估上有很大的局限性。自2005年 以来，活体水平的长程辐射旁效应逐渐成为该领域的研究热点。2006年，Kovalchuk小组 用X射线辐照小鼠的一部分组织，发现在距离受辐照区域Icm以外的组织也被诱导发生了 高于对照的DNA损伤。2007年，Kovalchuk小组使用X射线辐照小鼠的脑组织，在距离脑 16cm的未辐照的脾上检测到DNA甲基化水平的改变。同时，本专利发明人所在的研究小组 也首次在植物活体水平上证实了辐射诱导长程旁效应的存在，2007年，本研究小组成员杨 根等利用模式植物拟南芥作为研究对象，通过应用单粒子微束定点定位照射种胚的茎尖分 生组织(SAM)检测发现其远端未受辐射的根尖分生组织(RAM)的发育分化受到了显著的抑 制。随后又利用低能离子束注入装置辐照了拟南芥种子的外层细胞检测发现未受直接辐照 的茎尖和根尖分生组织的发育分化受到了显著抑制。辐射旁效应的早期过程是旁效应机理研究中的一个重要部分，涉及到辐射旁效应 损伤信号的产生、维持、传输、响应的时空效应关系，是辐射旁效应的基础。在细胞培养体系 中，研究人员通过培养基转移和辐射后共培养实验研究辐射旁效应的早期过程；本研究小 组成员韩伟等通过培养基转移实验研究了辐射损伤因子的释放特征以及可能的释放方式。在活体水平的研究虽然更能反映辐射旁效应的生物学本质，然而目前尚未见到活体长程辐 射旁效应早期过程的相关研究报道。辐射旁效应早期过程研究的关键是受辐照细胞和要检 测的未辐照细胞在研究体系中人为的“分离”和“组合”。这种“分离”和“组合”在细胞培养 体系中是很容易实现的，培养基转移和辐射后共培养实验就分别体现了这种技术特点。但 是在活体水平，特别是对于目前作为研究主体的动物模型，就很难实现辐照部分和未辐照 部分的“分离”和“组合”，例如不可能把小鼠辐照后的头部或者肺部去掉而保持身体存活。
发明内容
本发明的目的是提一种基于拟南荠菜的辐射旁效应早期过程验证实验方法，以植 物作为对象，利用植物细胞的全能性，以解决辐射旁效应的研究中活体水平难以检测其辐 射旁效应信号转导和机制的问题。为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为一种基于拟南荠菜的辐射旁效应早期过程验证实验方法，其特征在于采用模式 植物拟南荠菜的转基因系为材料，所述转基因系为AtRAD54Promoter-GUS转基因系，对拟 南荠菜进行电离辐射后，进行剪切和嫁接处理，提取嫁接至受辐射的拟南荠菜根尖的新的 拟南荠菜幼苗的AtRAD54基因，以所述AtRAD54基因表达水平作为检测终点，包括以下步 骤(1)实验材料培养将拟南芥菜幼苗消毒后点播在MS培养基上，在光照条件下竖 直培养，拟南芥菜幼苗的根部沿培养基表面向下竖直生长；(2)辐射处理采用物理辐射手段，对拟南芥菜幼苗的根尖部位进行局部电离辐 射；(3)剪切处理用手术刀片切掉拟南芥菜幼苗的根尖部位受辐照的部分，剩余的 植株转移到新的MS培养基上继续生长；(4)嫁接处理将剪切处理后的拟南芥菜幼苗受辐照的根尖部位转移到新的MS培 养基上，根尖向下竖直放置；选择新的拟南芥菜幼苗，剪掉相同长度的根尖后，将根向下竖 直放直，并和受辐照的南芥菜幼苗根尖部分整齐对接，新的拟南芥菜幼苗剩余的根能向下 缓慢生长，两部分根在交界面紧密接触；(5)地上部分植株辐射效应的检测在剪切和嫁接处理完成24小时后，提取未受 辐照的，并且嫁接至受辐射的拟南芥菜幼苗根尖的新的拟南芥菜幼苗的地上组织器官的 AtRAD54基因，并同源重组修复相关基因AtRAD54基因启动子驱动的⑶S报告基因作为表 达，通过⑶S报告基因判断所述AtRAD54基因表达是否明显上调，作为辐射生物效应的判定 标准。2、根据权利要求1所述的一种基于拟南荠菜的辐射旁效应早期过程验证实验方 法，其特征在于所述MS培养基中含有3%的糖。3、根据权利要求1所述的一种基于拟南荠菜的辐射旁效应早期过程验证实验方 法，其特征在于所述步骤(2)中，可采用化学诱变剂、环境胁迫和生物胁迫代替物理辐射 手段。4、根据权利要求1所述的一种基于拟南荠菜的辐射旁效应早期过程验证实验方 法，其特征在于所述步骤(2)采用低穿透能力的alpha粒子对拟南芥菜幼苗的根尖部位进行局部电离辐射。与动物不同，植物细胞具有全能性，割离一些器官和组织对其他部位的影响很小， 如切除叶子、部分根，甚至重要的分生组织都不会导致剩余部分的死亡和过多的生长发育 改变，而且离体的组织器官也很容易培养存活。另外，“嫁接”也是植物的另一个特性，其它 个体的组织器官能通过“嫁接”在另一个体上正常的生长发育。因此，在植物活体水平很容 易实现不同组织器官的“分离”和“组合”，对于研究活体水平远程辐射旁效应的早期过程和 损伤信号的传输途径方面，植物是一个很好的模型。本发明是基于AtRAD54基因表达水平是植物环境压力反应(物理化学诱变、环 境有害物等)的一个有效遗传学检测终点，借鉴离体细胞辐射旁效应培养基转移研究 方法的思想，利用高等植物细胞全能性的特点，在植物个体水平实现了受辐照组织(器 官)与未受辐照组织(器官)的“分离”与“连接”，巧妙的解决了个体水平长程辐射 效应损伤信号转导时空关系和机制研究的难题。具体是以模式植物拟南芥菜转基因系 (AtRAD54Promoter-GUS)为材料，同源重组修复相关基因AtRAD54的表达水平作为远程遗 传效应检测终点，使用低穿透能力的alpha粒子辐照拟南芥菜的根尖部位，然后人为将受 辐照的根尖部分和未辐照的地上部分(地上部分和根部可以为不同基因型或者突变体植 株)“分离”和“连接”，根据AtRAD54表达水平(⑶S活性)的改变研究植物个体水平远程 辐射效应的信号转导时空关系和机制。结果显示该体系具有动物模型无法比拟的优点，为 今后植物个体水平远程辐射旁效应早期过程和机制的研究提供了强有力的工具。本发明是以模式植物拟南芥菜转基因系(AtRAD54pr0m0ter-GUS)为材料，同源重 组修复相关基因AtRAD54表达水平为检测终点研究活体水平辐射远程信号转导时空特性 和机制的新体系。其原理是借鉴离体细胞旁效应研究中培养基转移体系的思想，基于植物 细胞的全能性，利用植物各组织(器官)“分离”后可以正常存活，以及嫁接后可以恢复正常 个体生理状态的特点，对拟南芥菜根进行辐照处理后和未辐照的地上部分进行各种“分离” 和“嫁接”操作，通过检测地上部分AtRAD54基因表达水平的变化，研究远程辐射损伤信号 的时空特性和机制。本发明的创新之处在于利用植物细胞全能的特性导致的可以切割和嫁接的特性， 克服了动物实验中无法实现的受辐照组织(器官)和非辐照组织(器官)的“分离”与“连 接”的局限，发明了一种可以在个体水平研究远程辐射信号早期过程的新的方法体系，取得 了以下有益成果1、通过剪切试验证实辐照后8小时远程辐射信号能够从受辐照的部分(根部)传 到未受辐照的远程组织(地上部分)，并引起地上部分RAD54表达水平的上调。辐照后8小 时剪掉被辐照幼苗根部，24小时检测地上部分AtRAD54基因表达水平，结果如图2所示，处 理组(辐照后8小时剪掉根部)与阴性对照组(无任何处理)差异明显(0. 638 Vs 0. 235 P < 0. 05)，与阳性对照组(辐照后无剪切根部操作)无明显差异(0. 638 Vs 0. 705，P > 0. 05)，证实辐照后8小时以内产生的信号能够诱导远程旁效应的产生。2、通过嫁接实验证实远程辐射信号的产生是延迟的。分别在辐照后0小时和2小 时时将受辐照的根部切下，并为其嫁接上一个新鲜的小苗的地上部分，均在根部受辐照的 8小时后拿下嫁接上的根部(在图3中分别以0-8h和2-8h表示)，24小时后检测地上部 分AtRAD54基因表达水平。结果如图3所示，两个处理组(0_8h和2_8h)之间无显著差异，(0. 77 VS 0. 76，P > 0. 05)，与阳性对照(辐照后无嫁接根部操作)无显著差异(P值分别 为0. 58和0.46，均为P> 0.05)，而与阴性对照(无任何处理)差异极显著(P值分别为 0. 00003和0. 00002，均为P < 0. 01)，说明这种远程损伤信号在辐照后是延迟产生的，至少 辐射后2小时以内诱导产生的信号对这种远程旁效应的产生是无关紧要的。
图1为本发明剪切和嫁接过程示意图，其中图la为剪切过程示意图，图lb为嫁 接过程示意图。图2为受辐射后8小时剪切处理后的地上部分AtRAD54基因表达水平示意图。图3为受辐射后0和2小时嫁接处理后地上部分AtRAD54基因表达水平示意图
具体实施例方式本发明包括以下步骤(1)实验材料培养AtRAD54Pr0m0ter-GUS转基因系的拟南芥菜小苗消毒后点播 在MS培养基(3%糖)上，在合适的光照强度和周期下竖直培养，小苗的根部沿培养基表面 向下竖直生长。(2)辐射处理电离辐射对拟南芥菜幼苗根尖部进行局部辐照。(3)剪切和嫁接处理，如图1所示A)剪切处理在特定的时间点用手术刀片切掉根受辐照的部分，剩余的植株转移 到新的MS培养基上继续生长。B)嫁接处理在辐照处理后特定的时间点，有手术刀片把受辐照的根部切下，转 移到新的MS培养基上，根尖向下竖直放置。新的拟南芥菜小苗剪掉相同长度的根后，同样 根向下竖直放直，并和受辐照的根尖部分整齐对接。新的幼苗剩余根的能向下缓慢生长，导 致这两部分根在交界面紧密接触。(4)地上部分植株辐射效应的检测同源重组修复相关基因AtRAD54基因启动子 驱动的⑶S报告基因作为表达，通过⑶S报告基因判断所述AtRAD54基因表达是否明显上 调，以剪切和嫁接处理完成24小时后未辐照的地上组织(器官)中AtRAD54基因表达是否 明显上调作为辐射生物效应的判定标准。
权利要求
一种基于拟南荠菜的辐射旁效应早期过程验证实验方法，其特征在于采用模式植物拟南荠菜的转基因系为材料，所述转基因系为AtRAD54Promoter-GUS转基因系，对拟南荠菜进行电离辐射后，进行剪切和嫁接处理，提取嫁接至受辐射的拟南荠菜根尖的新的拟南荠菜幼苗的AtRAD54基因，以所述AtRAD54基因表达水平作为检测终点，包括以下步骤(1)实验材料培养将拟南芥菜幼苗消毒后点播在MS培养基上，在光照条件下竖直培养，拟南芥菜幼苗的根部沿培养基表面向下竖直生长；(2)辐射处理采用物理辐射手段，对拟南芥菜幼苗的根尖部位进行局部电离辐射；(3)剪切处理用手术刀片切掉拟南芥菜幼苗的根尖部位受辐照的部分，剩余的植株转移到新的MS培养基上继续生长；(4)嫁接处理将剪切处理后的拟南芥菜幼苗受辐照的根尖部位转移到新的MS培养基上，根尖向下竖直放置；选择新的拟南芥菜幼苗，剪掉相同长度的根尖后，将根向下竖直放直，并和受辐照的南芥菜幼苗根尖部分整齐对接，新的拟南芥菜幼苗剩余的根能向下缓慢生长，两部分根在交界面紧密接触；(5)地上部分植株辐射效应的检测在剪切和嫁接处理完成24小时后，提取未受辐照的，并且嫁接至受辐射的拟南芥菜幼苗根尖的新的拟南芥菜幼苗的地上组织器官的AtRAD54基因，并同源重组修复相关基因AtRAD54基因启动子驱动的GUS报告基因作为表达，通过GUS报告基因判断所述AtRAD54基因表达是否明显上调，作为辐射生物效应的判定标准。
2.根据权利要求1所述的一种基于拟南荠菜的辐射旁效应早期过程验证实验方法，其 特征在于所述MS培养基中含有3%的糖。
3.根据权利要求1所述的一种基于拟南荠菜的辐射旁效应早期过程验证实验方法，其 特征在于所述步骤(2)中，可采用化学诱变剂、环境胁迫和生物胁迫代替物理辐射手段。
4.根据权利要求1所述的一种基于拟南荠菜的辐射旁效应早期过程验证实验方法，其 特征在于所述步骤(2)采用低穿透能力的alpha粒子对拟南芥菜幼苗的根尖部位进行局 部电离辐射。
全文摘要
本发明公开了一种基于拟南荠菜的辐射旁效应早期过程验证实验方法，采用模式植物拟南荠菜为材料，对拟南荠菜进行电离辐射后，进行剪切和嫁接处理，提取嫁接至受辐射的拟南荠菜根尖的新的拟南荠菜幼苗的AtRAD54基因，以AtRAD54基因表达水平作为检测终点。本发明的创新之处在于利用植物细胞全能的特性导致的可以切割和嫁接的特性，克服了动物实验中无法实现的受辐照组织(器官)和非辐照组织(器官)的“分离”与“连接”的局限，发明了一种可以在个体水平研究远程辐射信号早期过程的新的方法体系。
文档编号C12Q1/68GK101805791SQ201010132810
公开日2010年8月18日 申请日期2010年3月22日 优先权日2010年3月22日
发明者卞坡, 吴跃进, 李方华, 王婷 申请人:中国科学院等离子体物理研究所