专利名称：：鉴别转抗除草剂棉花llcotton25转化体的pcr方法
技术领域：
：本发明属于转基因植物检测领域，特别是涉及鉴别转抗除草剂棉花LLC0TT0N25转化体的PCR方法
背景技术：
：我国是转基因作物的主要种植国家之一，2009年种植面积位于全球第六位。我国商业化种植的转基因作物主要为转基因抗虫棉花何抗木瓜环斑病毒的转基因番木瓜等。其中，转Bt基因抗虫棉是我国种植面积最大的转基因作物，2009年种植面积达370万公顷，占我国棉花种植总面积的近70%(James，Clive.2009.GlobalStatusofCommercializedBiotech/GMCrops:2009.ISAAABrie预o.41.ISAAA:Ithaca，NY.)。我国种植的转基因棉花主要为抗虫转基因棉花。此外我国还允许国外抗除草剂棉花LLC0TT0N25、抗虫转基因棉花531等5个转基因棉花进口用作加工原料(http:〃www.stee.agri.gov.cn/biosafety/spxx/t20091022_819214.htm)。抗除草剂棉花LLC0TT0N25是由拜耳作物科学公司研发的通过农杆菌介导的转bar基因的抗除草剂棉花品种，2003年在美国被批准商业化应用，随后陆续在澳大利亚、巴西、力口拿大等国被批准应用(http:〃www.agbios.com/dbase.phpaction=Submit&evidcode=LLCotton25)。我国于2006年批准抗除草剂棉花LLC0TT0N25进口用于加工原料(农基安证字(2006)第360号)。因此建立抗除草剂棉花LLC0TT0N25的快速、特异性的检测方法对其监管和安全性评价显得十分必要。目前，PCR技术是转基因作物检测中应用最为广泛的技术。在应用这种技术进行转基因作物定性检测时，根据其扩增的靶标区域和特异性将其分为四类一、筛选检测，以转基因通用的外源启动子和终止子为靶标区域；二、基因特异性检测，以特异的外源目的基因为靶标区域；三、构建特异性检测，以转基因元件之间的特异构建为靶标区域；四、转化体特异性检测，以转化体特异性片段(外源插入片段与受体基因组连接区域)为靶标区域。这四类检测方法对转基因作物的检测特异性是逐渐增加的，转化体特异性检测是目前对转基因品系检测特异性最高的检测方法，也是目前转基因检测中最常用的身份检测方法，这种检测方法能够区分同一转化载体产生的不同转化植株品系。经检索公开文献和专利发现，目前尚没有抗除草剂棉花LLC0TT0N25的转化体特异性片段序列的报道。
发明内容针对上述领域中的空白，本发明提供了抗除草剂棉花LLC0TT0N25的5'端和3'端转化体特异性序列以及鉴别抗除草剂棉花LLC0TT0N25的转化体特异性PCR方法，该PCR方法能利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出抗除草剂棉花LLC0TT0N25，以及以抗除草剂棉花LLC0TT0N25为亲本的棉花品系。鉴别转抗除草剂棉花LLC0TT0N25转化体的PCR方法，其特征在于PCR体系中的正向引物是根据SeqIDNo.l所示核苷酸序列l-1723bp位置设计，反向引物是根据SeqIDNo.1所示核苷酸序列1724-2006bp位置设计。所述正向引物为LL25-5F:5'-ACCATCTAGCTCACTCTTGG-3'，所述反向引物为LL25-5R:5'-CAACCTGTCTGTTTGCTGAC-3'，扩增的片段为长度为411bp。鉴别转抗除草剂棉花LLC0TT0N25转化体的PCR方法，其特征在于PCR体系中的正向引物是根据SeqIDNo.2所示核苷酸序列l-476bp位置设计，反向引物是根据SeqlDNo.2所示核苷酸序列477-1010bp位置设计。所述正向引物为LL25-3F:5'-AATCCTGTTGCCGGTCTTGC-3'，所述反向引物为LL25-3R:5'-CAATCACTTGGAGTGATGAAG-3'，扩增片段长度为430bp。本发明通过Genomewalking方法获得转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25的转化体特异性序列，一条为外源重组载体5'端插入区域的特异性旁侧序列，另一条外源重组载体的3'端插入区域的特异性旁侧序列，根据这两条旁侧序列任意一条设计引物对，能够专门用检测LLC0TT0N25及以其为亲本的棉花品种。本发明还进一步设计了两对特异性引物，可以用于LLC0TT0N25及以其为亲本的棉花品种鉴别的最优化方案。本发明提供的的转化体特异性序列以及依赖其建立的转化体特异性PCR方法可作为一种鉴定转抗除草剂棉花LLC0TT0N25，以及以这个品种为亲本的转基因棉品系的有效手段，由于转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25是我国允许进口用作加工原料的转基因棉花品系之一，因此本发明为特异性鉴定转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25提供了便利，该方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。图1转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25转化体特异性序列的GenomeWalking扩增M:DNAMarkerDL2000;1-4:5'端DL1-DL4的Walking产物；5-8:3'端DL1-DL4的Walking产物图2转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25的5'端转化体特异性PCR检测结果M:DNAMarkerDL2000;1:转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25，2-9:8个市场棉花样品；10:空白对照图3转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25的3'端转化体特异性PCR检测结果M:DNAMarkerDL2000;1:转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25，2-9:8个市场棉花样品；10:空白对照具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。实施例1转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25转化体特异性序列的克隆1实验材料1.1植物材料转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25(拜耳作物科学公司)，本实验室有保存，可向公众发放用于实验研究。1.2酶与试剂分子生物学试剂，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker等购自大连宝生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。1.3实验仪器PCR扩增仪Mastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸电泳仪DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)DNA测序仪(A卯liedBiosystem377型全自动荧光序列分析仪)DNA电泳分析系统KodakEDAS290(Kodakco.)其它仪器包括离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。2实验方法和过程2.1棉花基因组DNA提取与检测2.1.1棉花基因组DNA提取取子叶期的幼嫩棉花叶片做为DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout试剂盒(天泽基因公司)的操作手册，进行棉花材料总DNA的提取。2.1.2DNA检测取5iU提取的DNA溶液，以O.8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。2.2Genomewalking分离转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25的转化体特异性序列Genomewalking也是一种扩增已知序列旁侧未知区域序列的方法，主要步骤为基因组DNA酶切、与接头连接、两次巢式PCR扩增等。本实施例采用Genomewalking的方法获得了转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25的转化体特异性序列。具体步骤参照GenomeWalkerTMUniversalKit(Takara大连公司)试剂盒说明，本实施例进行了部分改进，主要操作步骤如下。2.2.1基因组DNA酶切分别用DraI、StuI、Pvu11、EcoRV酶切转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25基因组DNA，标记为DL1DL4。酶切体系为:基因组DNA(O.1yg/yL)，25yL;10X酶切Buffer,lOyL;内切酶(10U/iiL)，8iiL;ddH20，57iiL;总体积100yL。37"温浴2h，取出离心管，低速离心510s，继续温浴1618h。各取5L进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否完全。2.2.2纯化酶切产物按回收试剂盒说明书纯化酶切产物。2.2.3连接反应5连接反应体系纯化的酶切产物，4iiL;接头(25iiM)，1.9iiL;10X连接Buffer,1.6iiL;T4DNA连接酶(6U/iiL)，0.5iiL;ddH20，8iiL;总体积16iiL。混合反应液，16t:温浴过夜，然后7(TC变性5min。每管加入72yLddH20，混匀，-2(TC保存备用。2.2.4PCR反应GenomeWalking共需要两轮PCR反应，其PCR的反应体系见表1。表1反应体系(iiL)第一轮第二轮ddH2017.37536.2510XBuffer(Mg2+Plus)2.55dNTP(2.5mMeach)24APl(10uM)12GSPPrimer1(10uM)12ExT叫(5U/uL)0.1250.25Template(20ng/uU10.5(第一轮反应产物)Totalvolume25502.2.5和分析PCR在0.8%胶上进行用Gel两轮PCR扩增的程序见表2。表2GenomeWalking扩增程序反应步骤设置循环数第一轮194。C,25s;72°C，3min7294。C,25s;67°C,3min32367。C,7min1第二轮194。C,25s;72°C，3min5294。C,25s;67°C，3min20367°C,7min1序列测定扩增产物的琼脂糖电泳，采QIAquickExtractionkit回收扩增片段，连接到pGEM-Teasy(Promega，Madison，Wis.)，采用ABIPRISM1300GeneticAnalyzer进行序列测定。采用软件vectorNTI10.0(Invitrogen)6对测定的序列进行拼接和分析。在NCBI数据库(http:〃w丽.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN检索相似的基因组序列。3实验结果3.1转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25转化体特异性序列测定分别经过1次GenomeWalking获得转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25的5'端和3'端转化体特异性序列。5'端GenomeWalking以引物5W1-P1和5W1-P2(表3)分别进行第一轮和第二轮PCR扩增，结果获得2006bp的扩增产物(图1，泳道4)。3'端GenomeWalking以引物3W1-P1和3W1_P2(表3)，分别进行第一轮和第二轮PCR扩增，结果获得1010bp的扩增产物(图l，泳道6)。表3Ge謹eWalking弓l物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3.2转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25转化体特异性序列分析将获得的序列提交NCBI数据库比对分析，5'端转化体特异性序列的l-1723bp为棉花基因组序列，1724-2006bp为转化载体序列，序列见SEQIDNOl。3'端转化体特异性序列的l-476bp为转化载体序列，477-1010bp为棉花基因组序列，序列见SEQIDN02。实施例2本发明的转化体特异性PCR方法应用于鉴别转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N251实验材料1.l植物材料转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25(拜耳作物科学公司)，本实验室有保存，可向公众发放用于实验研究。8个棉花材料，购自市场。1.2酶与试剂分子生物学试剂，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、Marker等购自大连宝生物生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。1.3实验仪器PCR扩增仪Mastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸电泳仪DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)DNA电泳分析系统KodakEDAS290(Kodakco.)其它仪器包括离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。2实验方法和过程2.1棉花基因组DNA提取与检测见实施例1中2.1棉花基因组DNA提取与检测。2.2鉴别转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25的转化体特异性PCR方法依据5'端转化体特异性序列，设计引物LL25-5F/LL25-5R组合(序列见表4)，预期扩增片段为411bp;依据3'端转化体特异性序列，设计引物LL25-3F/LL25-3R组合(序列见表4)，预期扩增片段为430bp。检测购自市场的8个棉花样品，见图2和图3。实验结果表明，转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25这两对引物均能获得预期大小的扩增片段，而检测的8个市场样品均未获得预期大小的扩增片段。分别克隆这两个扩增片段，按实施例1中"2.2.5序列测定和分析"进行序列分析。序列分析结果表明，5'端扩增片段序列与SEQIDN01的1596-2006位完全一致，3'端扩增片段序列与SEQIDN02的120-549位完全一致。检测结果表明本发明提供的PCR方法能很好地鉴别出棉花样品中是否含有转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25。PCR反应体系为0.25iiLrTaq(5U/iiL)，5iiL10XPCRBuffer(Mg2+Plus)，4iiLdNTP(各2.5mM)，引物各2yL(10yM)，模板各2yL(20ng/yL)，加灭菌蒸馏水补足体积至50iiL。扩增程序为94。C预变性4min;94。C变性30sec，55。C退火30sec，72。C延伸30sec，35个循环；72。C10min。表4鉴别转基因抗除草剂棉花LLC0TT0N25的转化体特异性PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求鉴别转抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体的PCR方法，其特征在于PCR体系中的正向引物是根据SeqIDNo.1所示核苷酸序列1-1723bp位置设计，反向引物是根据SeqIDNo.1所示核苷酸序列1724-2006bp位置设计。2.根据权利要求1所述的PCR方法，所述正向引物为LL25-5F:5'-ACCATCTAGCTCACTCTTGG-3'，所述反向引物为LL25-5R:5'-CAACCTGTCTGTTTGCTGAC-3'，扩增的片段为长度为411bp。3.鉴别转抗除草剂棉花LLC0TT0N25转化体的PCR方法，其特征在于PCR体系中的正向引物是根据SeqIDNo.2所示核苷酸序列l-476bp位置设计，反向引物是根据SeqIDNo.2所示核苷酸序列477-1010bp位置设计。4.根据权利要求3所述的PCR方法，所述正向引物为LL25-3F:5'-AATCCTGTTGCCGGTCTTGC-3'，所述反向引物为LL25-3R:5'-CAATCACTTGGAGTGATGAAG-3'，扩增片段长度为430bp。全文摘要本发明“鉴别转抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体的PCR方法”，属于转基因植物检测领域。本发明通过Genomewalking方法获得转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25的转化体特异性序列，一条为外源重组载体5’端插入区域的特异性旁侧序列，另一条外源重组载体的3’端插入区域的特异性旁侧序列，根据这两条旁侧序列任意一条设计引物对，能够专门用PCR检测转基因棉花品种LLCOTTON25及以其为亲本的棉花品种。文档编号C12Q1/68GK101792813SQ20101014391公开日2010年8月4日申请日期2010年4月7日优先权日2010年4月7日发明者孙爻,张永军,彭于发,谢家建申请人:中国农业科学院植物保护研究所