专利名称：大豆疫霉的检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种大豆疫霉的检测试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。
背景技术：
大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌(Phytophothora sojae)引起的，是分布广泛、危 害极严重的土传性病害。是我国对外公布的Al类进境植物检疫对象。该病1948年首次发 现于美国的印第安那州，1955年公开报道后，在世界大豆主产国巴西、阿根廷、加拿大等15 个国家先后发现该病。仅在1989至1991年的3年中，大豆疫病在美国中北部的12个州即 造成279万吨的产量损失，经济价值高达5. 6亿美元。1989年北京农业大学沈崇尧等首次在我国东北地区发现了大豆疫霉病菌，目前已 在北京、山东、吉林、内蒙古等地发现了疫霉根腐病。黑龙江省植保站1997、1998两年对黑 龙江省大豆疫病发生情况进行普查，结果表明仅黑龙江省发病面积已超过30万公顷，占全 省大豆播种面积的15%。该病已由初发生阶段向盛发生阶段转化，是一个急需解决的问题。近年来，我国从美国等有大豆疫霉分布的国家进口商品大豆日趋增多，每年从境 外进口大豆的数量几乎超过了国产大豆的总量，其中经常夹带一定量的土壤。由于大豆疫 霉是典型的土传真菌病害，卵孢子能在土壤中长期生存，因此进境大豆夹带的土壤中极有 可能携带大豆疫霉病菌。国内外大豆的频繁贸易增加了大豆疫病传播扩散的风险，这种严 峻的形势要求应尽快建立一套快速灵敏的检测方法。虽然有直接从土壤分离和检测大豆疫霉的报道，但实际上，由于种植大豆的土壤 中也往往含有大量的腐霉等腐生真菌，能选择性地抑制多种腐霉菌的恶疫灵(hymexazo) 也强烈抑制大豆疫霉，因而从土壤中直接分离和检测大豆疫霉极为困难，成功率较小；种子 也可能是大豆疫霉传播的途径之一，但从干燥甚至稍微阴干的带病大豆种子中分离不到病 原，或需经2个月的湿冷处理才能使病种子中的卵孢子萌发，不适合检疫检验；酶联免疫荧 光(ELISA)虽已广泛地应用于疫霉病害的检测和诊断，但所用抗体缺乏种的特异性，甚至 能和某些腐霉和霜霉菌发生交叉反应，检测到的病原也有可能是死的，也不适合检疫检验； 采用土壤浸泡后用大豆幼苗、子叶或叶碟(Ieafdisc)诱集(baiting)的方法可有效地检测 到土壤中活的大豆疫霉，也是目前海关检疫部门的主要检测手段，但这种生物学检测方法 约需15-20天，而且灵敏度低，每克土壤需含有50个以上的卵孢子，因此难以适合外检和内 检的需求。PCR技术具有快速和灵敏的优点，在病原物的鉴定和检测中的地位越来越重 要。近年来，一些疫霉菌的PCR检测方法被开发出来。这些方法中设计的引物的来源主 要都是转录间隔区(ITS) (Cooke et al. , 1995a, b ；Bonants et al. , 1997 ；Tooley et al. , 1997 ；Trout etal. , 1997 ；Liew et al. ,1998 ；Tooley et al. ,1998 ；Schubert et al.，1999 ；Bonants et al.，2000 ；Judelson&Tooley，2000 ；Winton&Hansen，2001 ；Grote et al.,2002 ；Ippolito et al. ,2002)或者 elicitin 基因(Coelho et al.，1997 ； Lacourt&Duncan, 1997 ；Kong et al.，2003b)。这些区域或者基因在基因组中都是高拷贝的，所以很容易被检测到。但是越来越多的研究发现，部分疫霉种的ITS序列差异很小，以 此为靶标设计的引物难以将不同种区分开来。Wang等(2006)根据ITS序列设计大豆疫霉 特异性引物时发现，大豆疫霉与P. melonis的ITS序列的相似性高达97%，大豆疫霉的特异 性引物3’末端仅仅与P. melonis的相应序列相差1个碱基，需要将退火温度提高到66°C以 上才能将这两种疫霉区分开来，但是过高的退火温度会降低PCR反应的灵敏度。而且提高 退火温度并不能彻底解决此问题，当P. melonis的浓度较高时仍然会造成假阳性的现象。 此外，由于ITS的拷贝数非常高，导致应用该靶标位点进行病原菌的定量检测不够准确。因 此筛选新的分子靶标，是改进大豆疫霉检测技术的重要途径。除了 ITS序列和elicitin基因之外，有研究者将线粒体基因Coxl、Cox2(Martin et al.，2004)和可能编码储存蛋白的Lpv基因(Kong et al.，2003a)分别作为P. ramorum 和P. cinnamomi检测的靶标。大豆疫霉和P. melonis的线粒体基因的相似性也比较高，要 设计区分二者的引物比较困难。而Lpv基因在除了隐地疫霉之外的其他疫霉中的研究比 较少，不像ITS序列那样几乎所有的疫霉种都可以从GenBank中获取其序列。Schena和 Cooke (2006)的研究为疫霉菌的检测开启了一扇新的大门。Schena等(2006)成功地利用 Yptl 基因作为革巴标对 P. ramorum、P. kernoviae、P. citricola 禾口 P. quercina 这四种疫霉进 行检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是解决现有技术中大豆疫霉的生物学检测方法所需 周期长(15-20天)、特异性差(50-100卵孢子/克土)的问题，为此，本发明提供了大豆疫 霉的检测引物、试剂盒及方法，对大豆疫霉进行PCR检测，实用性强，准确性和灵敏性高。本发明提供的技术方案是一种用于检测大豆疫霉的引物，其为大豆疫霉的特异 性引物，即PsYpt3F/PsYpt2R 其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所述，下游引物核苷 酸序列如SEQ ID No. 2所述。一种检测大豆疫霉的试剂盒，其特征在于包含上述的PsYpt3F/PsYpt2R引物。上述的试剂盒，还包含4种dNTP，Tris. Cl溶液、KCl溶液、MgCl2溶液、dNTPs、BSA、 Taq DNA聚合酶。本发明还公开了一种利用上述的引物检测大豆疫霉的方法，其检测过程是提取 待测样品DNA作为模板，进行PCR扩增，其中，PCR扩增程序为94°C变性5分钟，94°C变性1 分钟；60°C退火30秒；72°C延伸1分钟；35个循环，最后72°C延伸10分钟；然后检测扩增 产物取扩增产物，在的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下 检测结果，如果存在分子量约为220bp的DNA条带，则证明所检病原为大豆疫霉。为提高检测的灵敏度，本发明还提供了另一种用于检测大豆疫霉的引物，其包括 两对引物，第一对引物即:PsYpt3F/PsYpt2R，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所 述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所述，第二对引物为疫霉属通用引物，S卩YptlF/ YptlR，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所述。本发明还提供另一种检测大豆疫霉的试剂盒，其包含上述的第一对引物和和第二 对引物。
本发明还提供另一种检测大豆疫霉的方法，其具体过程是提取待测样品的DNA， 利用上述的两对引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNAdI 物为所述的第二对引物，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一 对引物，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，如果存在分子量约为220bp的DNA条 带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。同时本发明还公开了一种用于检测大豆疫霉的PCR反应体系，以总体积ImL计，其包括模板 DNA 若干、0. 05mmol Tris. C1、0. 125mmol KC1、0. 005mmol MgCl2, 0. OlmmoldNTPs.O. 25mmol 所述的 PsYpt3F/PsYpt2R 引物、0. ImgBSAUOO 单位 Taq DNA 聚合
酶，余量为灭菌去离子水。本发明还公开了另一种用于检测大豆疫霉的套式PCR反应体系，其包括第一轮 PCR反应体系和第二轮PCR反应体系，其中，第一轮PCR反应体系以总体积25ul计，其包 括5 μ L DNA模板，10 μ L权利要求4所述试剂盒溶液，10 μ L灭菌去离子水，引物为所述的 疫霉属通用引物ptlF/YptlR ；第二轮PCR反应体系以总体积25ul计，其包括5 μ L DNA 模板，10 μ L上述的试剂盒溶液，10 μ L灭菌去离子水，引物为所述的特异性引物PsYpt3F/ PsYpt2R，其中，第二轮PCR反应体系中的模板DNA为所述第一轮PCR反应产物。本发明分析了大豆疫霉和其他疫霉菌在Yptl基因序列上的差异，设计了新的特 异性引物，在此基础上建立了检测大豆疫霉的PCR体系，本发明具有如下优点(1)实用性好用卵孢子富集的方法检测含卵孢子土壤具重要的实际应用价值。 大豆疫霉随贸易往来最可能的传播途径是随大豆中的尘土传播，在贸易口岸中，检疫部门 也正是通过检测口岸大豆尘土中是否存在卵孢子作为重要指标。但事实上，在贸易口岸中 截获的“土壤”中，不可能含很多的卵孢子，因此海关目前所用的大豆叶碟法很难有效地进 行检测。此外目前的方法由于需要将病原菌卵孢子萌发、诱捕、分离鉴定等过程，需要约 15-20天的时间，根本无法满足海关检疫的需要。为了使我们的检测方法更具有实际应用价 值，我们在检测方法上作了如下改进，随机取30-50g带菌土样。把土壤碾碎以后，先用200 目筛网除去较大的颗粒，再过400目筛网，最后用500、800目筛网加水冲洗，由于卵孢子不 能透过800目筛网，这样通过700目筛网达到了使卵孢子富集的效果，富集以后的土壤经过 核酸抽取后直接进行PCR扩增，可在1天之内达到对大豆疫霉的检测。因此本方法大大提 高了检测效率。(2)准确性高由于传统大豆疫霉检测技术只是根据形态特征来确定检疫对象， 无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相近种，检测准确性只有60-80% ；而本发明根据 大豆疫霉的Yptl基因序列，同时包含保守与变异序列，利用Bioedit软件对这些DNA序列 进行比较，选定的大豆疫霉特有的一段保守序列做特异引物。能根据变异序列设计特异性 引物进行扩增比较，为病原菌的鉴定和检测提供了很好的靶位点。经过与大豆疫霉近似种 以及其他不同植物病原菌的比较，该引物的准确率为100%。(3)灵敏度高传统大豆疫霉检测技术首先要进行卵孢子的萌发，释放游动孢子 后再进行诱捕，由于大豆疫霉菌卵孢子萌发率只有10-30%，因此只有土壤中卵孢子量超过 每克土 50-100个时才有可能检出。本发明提供的大豆疫霉的特异引物检测方法及其高效 准确的检测试剂盒，由于可以有效的富集卵孢子，而且PCR扩增的高灵敏度，使得本研究的 方法可以有效地从每克含有1个卵孢子的土壤中检测出卵孢子。
图1为特异引物PsYpt3F/PsYpt2R扩增大豆疫霉的电泳图，其中，泳道3-24为22个P. sojae菌株扩增结果，泳道2为阴性对照。图2为大豆感病组织的检测结果，其中，泳道1为2000bp DNA marker ；泳道2为 阳性对照；泳道3为阴性对照；泳道4-5为接种大豆中大豆疫霉的扩增结果；泳道6为提取 健康大豆组织DNA的扩增结果；泳道7为提取健康大豆植株DNA，用引物ITS1/ITS4扩增的 结果(空白对照)。图3a为引物PsYpt3F/PsYpt2R扩增不同浓度游动孢子的灵敏度结果，其中，泳道1 为2000bp DNA marker ；泳道2为阴性对照；泳道3_6为25 μ 1的反应体系中分别含有1000 个、100个、10个、1个游动孢子DNA的扩增结果。图3b为以引物YphlF/Yph2R和PsYpt3F/PsYpt2R组合进行套式PCR反应的灵敏 度结果，其中，泳道1为2000bp DNA marker ；泳道2为阴性对照；泳道3_6为25 μ 1的反应 体系中分别含有1000个、100个、10个、1个游动孢子DNA的扩增结果。图4a为引物PsYpt3F/PsYpt2R扩增不同浓度卵孢子的灵敏度结果，其中，泳道1 为2000bp DNA marker ；泳道2为阴性对照；泳道3_5为25 μ 1的反应体系中分别含有100 个、10个、1个卵孢子DNA的扩增结果。图4b不以引物YphlF/Yph2R和PsYpt3F/PsYpt2R组合进行套式PCR反应的灵敏 度结果，其中，泳道1为2000bp DNA marker ；泳道2为阴性对照；泳道3_5为25 μ 1的反应 体系中分别含有100个、10个、1个卵孢子DNA的扩增结果。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限 制，仅仅作示例说明。实施例1 设计、合成引物并建立大豆疫霉检测试剂盒的PCR反应体系一、引物设计与合成设计大豆疫霉的特异性引物PsYpt3F/PsYpt2R PsYpt3F(20bp) :5，-TACCAATAATCAGAAGCGTA-3，(SEQ ID NO. 1)；PsYpt2R(18bp) :5，-CCTTGTCTGCCCTCTCGA-3，(SEQ ID NO. 2)。同时，还设计了疫霉属的Yptl通用引物YphlF/YphlR(具体见核苷酸序列表SEQ IDN0. 3和SEQ ID NO. 4)作为套式PCR的一轮反应引物YphlF(20bp) :5，-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3，(SEQ ID NO. 3)；YphlR(20bp) :5，-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3，(SEQ ID NO. 4)。所有引物委托Invitrogen公司合成。二、建立PCR反应体系1、建立常规PCR反应体系ImL 常规 PCR 反应体系中包括模板若干、0. 05mmol Tris. C1、0. 125mmol KCl, 0. 005mmol MgCl2、0. OlmmoldNTPs、大豆疫霉的特异引物 PsYpt3F/PsYpt2R 0. 25mmol、 0. ImgBSAUOO单位Taq DNA聚合酶，余量为超纯水。
2、建立套式PCR反应体系为了提高检测灵敏度，进一步建立了套式PCR反应体系。以疫霉菌Yptl基因通用引物YphlF/YphlR作为第一轮反应引物与特异引物PsYpt3F/PsYpt2R分别组合进行套式 PCR。ImL第一轮PCR反应的混合液，包括模板若干、0.05mmol Tris. C1、0. 125mmol KCl、0. 005mmol MgCl2、0. OlmmoldNTPs、疫霉属的通用引物 YphlF/YphlR 0. 25mmol、 0. ImgBSAUOO 单位 Taq DNA 聚合酶。ImL第二轮PCR反应的混合液，包括模板若干、0.05mmol Tris. C1、0. 125mmol KC1、0. 005mmol MgCl 2、0. OlmmoldNTPs、大豆疫霉的特异引物 PsYpt3F/PsYpt2R 0. 25mmol、0. lmgBSA、100单位Taq DNA聚合酶，其中，第二轮PCR反应的模板为第一轮反应 的扩增产物。实施例2 检测土壤样品中大豆疫霉从海关进境大豆带菌土样中检测大豆疫霉，检测过程如下1、富集土壤中卵孢子取待检土壤样品20-100克，研碎，先采用200目筛网去除较大土粒，然后经过400、 500,800目筛网过滤，同时用3-10升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用Iml无菌 水悬浮。由于卵孢子不能透过800目筛网，这样处理可以达到使卵孢子富集的效果。2、从微量卵孢子中提取DNA 将用无菌水悬浮的卵孢子转移到1. 5mL的离心管中，在12000r. mirT1转速下离心 5分钟，倒出液体；加入50 μ L CTAB buffer，研磨，再加入 500 μ L CTAB buffer，水浴 30 分钟；加入等体积氯仿抽提，在12000r. mirT1转速下离心10分钟，吸取上清；加入1/10体积的3M NaAc, 2倍体积的无水冰乙醇，室温沉淀30分钟，12000r. mirT1 转速下离心10分钟，倒干液体；加ImL 70% (V/V)乙醇洗涤，12000r. mirT1转速下离心10分钟，倒干液体，晾干至 无酒精味；加10 μ L无菌双蒸水溶解，用于以下的PCR扩增。3、大豆疫霉的PCR检测(1)采用实施例1中的常规PCR反应体系检测取1 μ L DNA溶液，加入9 μ L常规PCR反应体系溶液和15 μ L灭菌去离子水，总体 积为25 μ L0 PCR扩增程序为94°C变性5分钟，94°C变性1分钟；60°C退火30秒；72°C延伸 1分钟；35个循环，最后72°C延伸10分钟。扩增产物的电泳检测取10μ L PCR扩增产物，在的琼脂糖凝胶上进行电泳， 电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果。如果存在分子量约为220bp的DNA条带， 则证明所检病原为大豆疫霉。检测结果见图4a，图4a中，3_5泳道为25 μ 1的反应体系中 分别含有100个、10个、1个卵孢子DNA的扩增结果。(2)采用实施例1中的套式PCR反应体系检测第一轮PCR反应取1 μ L DNA溶液，加入9 μ L第一轮PCR反应混和溶液和15 μ L 灭菌去离子水，总体积为25 μ L0 PCR扩增程序为94°C变性5分钟，94°C变性1分钟；60°C退火30秒；72°C延伸1分钟；35个循环，最后72°C延伸10分钟。第二轮PCR反应取1 μ L第一轮PCR反应的扩增产物，加入9 μ L第二轮PCR反应 混和溶液和15 μ L灭菌去离子水，总体积为25 μ L0 PCR扩增程序为94°C变性5分钟，94°C 变性1分钟；60°C退火30秒；72°C延伸1分钟；35个循环，最后72°C延伸10分钟。扩增产物的电泳检测取10 μ L第二轮PCR扩增产物，在1 %的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果。如果存在分子量约为220bp的DNA 条带，则证明所检病原为大豆疫霉。检测结果见图4b，图4b中，3-5泳道为25 μ 1的反应体 系中分别含有100个、10个、1个卵孢子DNA的扩增结果。实例3 从污染水中检测大豆疫霉的游动孢子取大豆疫霉污染的灌溉水500mL，在6000g的离心力下离心20min，倒去上清液，沉 淀的游动孢子用IOOuL水悬浮，转入1. 5mL离心管，加入0. 05g石英砂，涡旋震荡lOsec，取 IuL游动孢子破碎液为模板，按照实施例2的方法进行基因扩增，可以扩增出大豆疫霉特有 的片断，结果见图3a和图3b。其中，图3a为引物PsYpt3F/PsYpt2R扩增不同浓度游动孢 子的灵敏度；图3b为引物YphlF/Yph2R和PsYpt3F/PsYpt2R组合进行套式PCR反应扩增不 同浓度游动孢子的灵敏度；泳道1为2000bp DNA marker ；泳道2为阴性对照；泳道3_6为 25 μ 1的反应体系中分别含有1000个、100个、10个、1个游动孢子DNA的扩增结果。实例4 从发病大豆组织中鉴定大豆疫霉将有水浸状病斑的大豆叶片或根茎部位用70%酒精消毒后，采用CTAB法或者碱 裂解法提取DNA，吸取IuLDNA溶液，按实施例2常规PCR扩增方法，进行PCR扩增，电泳检测 扩增产物，如果为大豆疫霉侵染引起的疫病，则可见一条清晰的分子量为220bp的特异性 条带，结果见图2，其中，泳道2、4、5为大豆疫霉侵染样品。实例5 从发病大豆组织中鉴定大豆疫霉用特异引物PsYpt3F/PsYpt2R对26个疫霉种、30个其它种的菌株共计164株进行 了常规PCR扩增，特异性引物PsYpt3F/PsYpt2R只能从供试的22个P. sojae菌株中特异地 扩增出一条220bp的条带，结果见图1，其中，泳道3-24为22个P. sojae菌株样品，泳道2 为阴性对照。表明该引物具有种的特异性，可以将P. sojae和其它近似种及其它相关种区 分开。
权利要求
一种用于检测大豆疫霉的引物，其特征在于其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述。
2. 一种检测大豆疫霉的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包含4种dNTP，Tris.Cl溶液、KCl溶 液、MgCl2溶液、BSA、Taq DNA聚合酶。
4. 一种利用权利要求1所述的引物检测大豆疫霉的方法，其特征在于提取待测样品 DNA作为模板，进行PCR扩增；PCR扩增程序为94°C变性5分钟，94°C变性1分钟；60°C退火 30秒；72°C延伸1分钟；35个循环，最后72°C延伸10分钟；然后取扩增产物进行检测，如果 存在分子量约为220bp的DNA条带，则证明所检病原为大豆疫霉。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于对PCR反应扩增产物的检测为凝胶电泳 检测。
6. 一种用于检测大豆疫霉的引物，其特征在于包括两对引物，第一对引物其上游引 物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，第二对引物 其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所述。
7. —种检测大豆疫霉的试剂盒，其特征在于包含权利要求6所述的引物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于还包含4种dNTP，Tris.Cl溶液、KCl溶 液、MgCl2溶液、BSA、Taq DNA聚合酶。
9. 一种利用权利要求6所述的引物检测大豆疫霉的方法，其特征在于提取待测样品 的DNA，进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第 二对引物，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，取第 二轮PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为220bp的DNA条带，则证明所检样品 中含有大豆疫霉。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于对PCR反应扩增产物的检测为凝胶电泳 检测。
全文摘要
本发明涉及一种大豆疫霉的检测试剂盒及其检测方法，解决现有技术中大豆疫霉的生物学检测方法所需周期长(15-20天)、特异性差(50-100卵孢子/克土)的问题，属于农作物防病治病及植物检疫范畴。利用本发明引物、试剂盒及方法对大豆疫霉进行PCR检测，实用性强，准确性和灵敏性高。
文档编号C12Q1/68GK101805795SQ201010145420
公开日2010年8月18日 申请日期2010年4月13日 优先权日2010年4月13日
发明者王源超, 王颖, 董莎萌, 郑小波 申请人:南京农业大学