专利名称：：钙离子信号调节亲环素配体基因caml作为猪肉质性状的遗传标记及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于猪的分子标记制备
技术领域：
，具体涉及一个猪CAML基因的克隆和作为猪分子标记辅助选择的领域，即利用位于该基因第1内含子插入/缺失突变的分子标记来预测猪生长、胴体和肉质生产性状。
背景技术：
：传统上，家畜改良计划是基于一些可观测的表型进行选择的，而这些表型代表的是所有基因和环境的综合效应。近些年采用传统的育种方法做了持续不断的努力，尽管也取得了一些进步，但是在产仔数，肉质性状等许多性状的改良上并未取得实质性的进步。造成这些困难的原因有很多，例如遗传力低，产活仔数的遗传力仅为0.09，而且，某些性状如产仔数是限性的，在性成熟之前无法测量，因此需要至少一年时间，得到可以利用的数据需要较长的时间周期。应用分子遗传学的方法例如SNP和微卫星等标记，可以克服这些生理上的限制。分子标记辅助选择等分子技术的发展是基于遗传标记信息，在出生后对某些性状进行直接选择提供了可能。相比表型信息，这种信息具有两种优势。第一是可以早期获得数据，有利于缩短遗传间隔，第二是可能提高选择的准确性，在两种性别中，通过对某个基因突变的直接选择，也提高了选择反应的准确性。能够应用于分子标记辅助选择的基因或标记必须对目标性状具有较大的遗传贡献率，即主效基因或标记，因此寻找这些主效基因和与之紧密连锁的分子标记成为分子标记辅助选择的前提和基础，也是当前和今后一段时间猪分子生物学领域的研究重点和急需解决的问题。目前已有多个位于功能基因内部的与生产性状紧密连锁的分子标记被发现。例如，与产仔数显著相关的候选基因ESR，PRLR，RBP4，与生长性状显著相关的MC4R，与肉质性状显著相关的PRKAG3，与抗病能力显著相关的FUT1，SLA,NRAMP，以及与被毛颜色显著相关的KIT，MC1R。这些基因标记信息与传统的表型信息一起，通过标记辅助选择的方法，被积极的应用在生猪的商业生产中，给生猪产品的提高与促进带来了很大的帮助。目前已有多个位于功能基因内部的与生产性状紧密连锁的分子标记被发现并申请专利。Gerbens等证实了位于猪6号染色体上肌肉组织特异候选基因心脏脂肪酸结合蛋白与猪中肌内脂肪含量和其它生产性状的关系，该基因已被申请专利，其专利申请号为WO97/35878;另夕卜，Rothschild等发现了1印tin受体基因内与瘦肉率有关的分子标记，其专利中请号为U.S.Pat.Nos.5972621。CAML(calcium-modulatingcyclophilinligand)基因编码一个亲环素B结合蛋白，称为钙离子信号调节亲环素配体(Bram,R.J，etal.，1995)。Clipstone,N.A.，andCrabtree,G.R.(1992)在JurkatTcells中的实验中证明了CAML的过表达能造成calcineurin依赖的NFAT的激活。HollowayM.Petal(1998)认为CAML过表达诱导消耗细胞内钙离子库存储，增加细胞质中钙离子浓度。而钙流入增加会使细胞质中浓度达到增强磷酸化酶calcineurin活性的阈值时，使NFAT去磷酸化后进入核内，作用于基因调控区。哺乳动物中，Calcineurin信号通路在调节骨骼肌纤维类型的转化中起关键作用(Olsonandffilliams,2000；Parsonsetal.，2003)。NFAT家族是calcineurin的主要作用目标，影响快慢肌MyHC的表达水平(McCullaghetal.,2004)Calcineurin选择性地慢肌或者氧化型肌纤维的启动子具有上调作用，而抑制Calcineurin活性会导致慢肌向快肌转化(Chin,Ε.Retal.1998)。根据所含的酶系及其活性特点，将肌纤维分为四种慢速氧化型肌纤维((I型)；快速氧化型((2a型)；快速酵解型(2b型)和中间型肌纤维(2x型)。2a型、2b型、2x型又统称为II型肌纤维。已有的研究结果表明，I，IIa型纤维比例的增加和数量的增多有益于肉质偏好发展，而IIb型纤维增加会使肉质变劣。因此，CAML基因可能通过CaN/NFAT生物学通路对肌纤维类型转化的调控，进而影响肉质的变化。目前已有人，小鼠，大鼠，牛，猩猩，犬的基因组结构、表达和功能研究报道，人CAML基因定位于5q23(Bram,R.J等，Thegeneforcalcium-modulatingcyclophilinIigand(CAMLG)islocatedonhumanchromosome5q23andasyntenicregionofmousechromosome13.Genomics31(2),257-260(1996))，包括两个不同的转录本，cDNA序列全长为2203bp(GeneBank登录号NM_001745)，有4个外显子。但目前国内外对猪CAML基因的cDNA全长克隆、基因组结构分析以及多态性研究还是空白。
发明内容本发明的目的在于克隆猪CAML基因，寻找该基因的遗传变异与猪生长、胴体和肉质生产性状间的关系，为猪的标记辅助选择提供遗传标记。本发明提供了猪CAML基因的cDNA序列，其序列分别如SEQIDNO1所示。所获得的CAML基因cDNA序列长度为1683bp，序列中包含891bp的开发阅读框，74bp5’非翻译区和718bp的3’非翻译区。申请人:获得了一种作为猪标记辅助选择应用的与猪生产性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO11所示。在序列表SEQIDNO11所示序列的第283-592位碱基处有310个碱基缺失。检测上述分子标记的正、反向引物的DNA序列如序列表SEQIDNO9和10所示。申请人:提供了一种猪标记辅助选择应用的与猪生产性状相关的分子标记的制备方法，按照以下步骤用人CAML基因cDNA序列为信息探针，在猪的表达序列标签(EST)数据库中作同源序列筛选，获得同源性80%以上的EST;然后对EST进行拼接；根据拼接的序列设计设计三条正反向扩增引物获得猪的cDNA序列，所述的三条正反向扩增引物序列如SEQIDNO3,4；SEQIDNO:5，6禾口SEQIDNO:7，8所示；所述的cDNA序列如序列表SEQIDNO1所示；根据与人CAML基因的cDNA序列的比对结果大致得出猪CAML基因的编码区序列，其编码氨基酸对应的cDNA序列如SEQIDNO:2所示；提取猪血液中的DNA；利用设计的如SEQIDNO:9，10所示引物扩增猪CAML基因的整个编码区序列，PCR产物回收，克隆，测序，将获得的序列进行品种间的多序列比对，寻找分子标记，然后按照序列表SEQIDN09和10所示引物，扩增得到如序列表SEQIDNO11所示的序列。本发明制备的分子标记可在猪皮率，背最长肌pH值，股二头肌色值和肌内水分性状关联分析中的应用。本发明的引物可在猪皮率，背最长肌PH值，股二头肌色值和肌内水分性状关联分析中的应用。本发明提供了2头梅山猪(中国地方猪血缘)和2头大白猪(外来猪血缘)包括猪CAML基因第1内含子及第二外显子的部分基因组核苷酸序列，通过这2个猪种的上述序列进行ClusterW比对提供了位于该扩增片段内部的变异，其突变位点如图1所示。制备该基因片段的步骤如下选择2头大白猪和2头梅山猪为试验材料，从血液中提取DNA，根据猪CAML基因组DNA序列设计引物，其引物的序列如序列表SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示，进行PCR扩增，PCR产物纯化、克隆测序、序列比较分析。更详细的技术方案参见《具体实施方式》的内容。序列表SEQIDNO1是本发明克隆的猪CAML基因的cDNA序列(SEQIDNO1)；序列表SEQIDNO2是猪CAML基因的编码的蛋白质序列(SEQIDNO2)；序列表SEQIDNO3是扩增猪CAML基因cDNA的正向引物序列(SEQIDNO3)；序列表SEQIDNO4是扩增猪CAML基因cDNA的反向引物序列(SEQIDNO4)；序列表SEQIDNO5是扩增猪CAML基因cDNA的正向引物序列(SEQIDNO5)；序列表SEQIDNO6是扩增猪CAML基因cDNA的反向引物序列(SEQIDNO6)；序列表SEQIDNO7是扩增猪CAML基因cDNA的正向引物序列5(SEQIDNO7)；序列表SEQIDNO:8是扩增猪CAML基因cDNA的反向引物序列6(SEQIDNO8)；序列表SEQIDNO9是实施猪CAML基因包括第一内含子及第二外显子序列扩增的正向特异引物序列(SEQIDNO9)；序列表SEQIDNO10是实施猪CAML基因包括第一内含子及第二外显子序列扩增的反向特异引物序列(SEQIDNO10)；序列表SEQIDNO.11是为猪CAML基因第1内含子中，在该序列的第283-592位碱基处有310个碱基插入或缺失突变(SEQIDNO:11，即本发明制备和用于关联分析的遗传标记的DNA序列)，序列长度为751bp。图1不同猪种CAML基因序列比对结果和突变位点。(图中DB1，DB2分别为实验选取的两头“大白猪”(外来猪血缘)，Ml，M2为实验中选取的两头“梅山猪”即中国地方猪血缘)。图2猪CAML基因第一内含子插入/缺失多态的琼脂糖凝胶电泳图谱和分型结果。图中泳道2-11代表序列表SEQIDNO:9和SEQIDNO10所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为751bp，441bp；泳道2，3，4为II基因型，泳道5，8，10，11为ID基因型，泳道6，7和9为DD基因型。根据本发明的方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，可以达到较好的选择效果。具体实施例方式实施例1猪CAML基因cDNA序列的制备猪CAML基因cDNA全长序列的制备需要首先合成cDNA第一链(该试剂盒购自美国Ferment公司)，利用成年“大白，，“梅山猪”的背最长肌组织总RNA合成cDNA第一链。以人CAML基因的cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80%以上的表达序列标签(EST)，拼接猪EST-重叠群。以该重叠群序列进行结构预测，发现该重叠群覆盖了全部0RF，以及5’非翻译区和3’非翻译区，以该重叠群推测的氨基酸序列与其他物种作相似性比较时，发现猪的该蛋白序列与人，小鼠，大鼠，牛，猩猩，犬的相似性分别为91%，85%,82%,92%,91%,93%,这说明了分离CAML基因cDNA的准确性。我们以EST-重叠群为模板设计引物，引物序列如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>采用上述设计的三对引物，扩增了重叠群的序列，拼接后进行生物信息学预测，与上述重叠群的结果一致，且覆盖了全部ORF和5’，3’非翻译区。PCR反应体系为25μ1，其中模板双链cDNA为lOOng，dNTPs浓度为10mmol/L，每条引物浓度为10mmol/L，2U的TaqDNA聚合酶，加去离子水至总体积25μ1。PCR反应程序94°C预变性4min；然后94°C变性50s、57°C退火50s、72°C延伸lmin，共35个循环；最后72°C延伸lOmin。PCR产物经纯化(按照上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书操作)、克隆后，进行序列测定，序列测定由上北京奥科生物技术公司完成，将测序所得到的序列与EST-重叠群进行序列拼接获得猪CAML基因的全长cDNA序列(见SEQIDNO:1)。实施例2基因片段的获得及多态性检测方法的建立选择2头“大白猪”和2头“梅山猪”，根据人CAML基因的基因组结构和通过实施例1获得的猪CAML基因的cDNA序列为试验材料，设计了以下引物，引物序列如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>用该引物在2头“大白猪”和2头“梅山猪”基因组DNA中进行PCR扩增。PCR反应体系为25μ1，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为10mmol/L，每条引物浓度为IOmmol/L，IU的TaqDNA聚合酶，加去离子水至总体积25μ1。PCR反应程序94°C预变性4min；然后94°C变性50s、58°C退火50s、72°C延伸lmin，共35个循环；最后72°C延伸lOmin。不同猪种的PCR产物经纯化(按照上海生工生物工程技术有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书操作)、克隆后，进行序列测定，序列测定由上海生工生物工程技术有限公司完成。上述扩增片段共存在较大的片段缺失。据此，设计了以下引物，引物序列如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>PCR反应体系为25μ1，其中DNA为50ng，dNTPs浓度为10mmol/L，每条引物浓度为lOmmol/L，IU的TaqDNA聚合酶，加去离子水至总体积25μ1。PCR反应程序94°C预变性4min；然后94°C变性50s、58°C退火50s、72°C延伸lmin，共35个循环；最后72°C延伸IOmin0取5μ1PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，观察并记录分型结果。结果如图2所示，发现只有两个等位基因，较长的插入片段长度为751bp，我们定义为I(插入，insert,)等位基因，片段长度为441bp的是D(缺失，delete)等位基因，从而形成3种不同的基因型II、ID禾口DD0实施例3分子标记在不同猪群中的多态性分布在3个商品猪群(大白，长白和杜洛克_为外来血缘猪种)和6个中国地方猪种(梅山、淮南、八眉、通城、合作和二花脸)猪群中检测猪CAML基因第二内含子插入/缺失多态性，检测结果如表1所示。在所检测的几个猪群中D等位基因占绝对优势，其中在杜洛克、梅山、鄂西以及郧西猪中没有发现I等位基因。表1猪CAML基因微卫星多态在不同猪群中基因型与基因型频率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例4分子标记在生产性状中的应用为了确定猪CAML基因多态性与猪表型差异是否相关，选择华中农业大学农业部猪遗传育种重点实验室组建的302头大白X梅山F2代资源群体为试验材料，采用实施例2所建立的微卫星分型方法进行多态性检测，并分析猪CAML基因微卫星不同基因型与猪生产性状的相关关系。采用SAS统计软件(SASInstitutelnc,Version8.0)GLM程序进行单标记方差分析，同时采用REG程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为Yijkl=μ+Gi+Fj+Sk+A+b^Xi^+ei^Yij为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用1，0和-1分别代表II、ID和DD基因型，显性效应用1，_1和1分别代表II、ID和DD基因型)；Sk、Y1,Fj为固定效应，分别为性另I」、年度、家系效应，biJkl为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰体重为协变量，肉质性状以屠宰日龄为协变量，生长不考虑协变量；eukl为残差效应。在所检测的259头大白猪X梅山猪F2代个体中，II基因型油18个，ID基因型有119个，DD基因型有165个。不同基因型与生产性状间的统计分析结果总结于表2和3。从表2发现，猪CAML基因不同基因型在皮率上极显著差异(P<0.01)，其他胴体性状上不存在显著性的相关关系。从表3可以得出，猪CAML基因不同基因型在背最长肌pH值性状上存在显著差异(P<0.05)，其他肉质性状不存在显著性的相关关系。该位点在背最长肌PH值，肌内水分主要以显性效应为主，在股二头肌色值以加性效应为主。表2猪CAML基因插入/缺失多态与胴体性状的关联分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注以上数值为最小二乘均值士标准误；含有相同字母表示差异不显著，小写字母表示差异显著，大写字母表示差异极显著；加性效应负值表示D等位基因降低性状表型值广表示ρ<0.05，**表示ρ<0.01(下表同)。表3猪CAML基因插入/缺失多态性与肉质性状的关联分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注以上数值为最小二乘均值士标准误；含有相同字母表示差异不显著，小写字母表示差异显著，大写字母表示差异极显著；加性效应负值表示D等位基因降低性状表型值；*表示P<0.05，**表示P<0.01。权利要求一种作为猪标记辅助选择应用的与猪肉质性状相关的遗传标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO11所示。2.如权利要求1所述的遗传标记，其特征在于，序列表SEQIDN0:11所示序列的第283-592位碱基处有310个碱基缺失。3.检测权利要求1所述遗传标记的正、反向引物的DNA序列如序列表SEQIDNO9和10所示。4.一种猪标记辅助选择应用的与猪肉质性状相关的遗传标记的制备方法，按照以下步骤用人CAML基因cDNA序列为信息探针，在猪的表达序列标签(EST)数据库中作同源序列筛选，获得同源性80%以上的EST；然后对EST进行拼接；根据拼接的序列设计设计三条正反向扩增引物获得猪的cDNA序列，所述的三条正反向扩增引物序列如SEQIDNO:3，4；SEQIDNO:5，6禾口SEQIDNO:7，8所示；所述的cDNA序列如序列表SEQIDNO1所示；根据与人CAML基因的cDNA序列的比对结果大致得出猪CAML基因的编码区序列，其编码氨基酸对应的cDNA序列如SEQIDNO2所示；提取猪血液中的DNA；利用设计的如SEQIDNO:9，10所示引物扩增猪CAML基因的整个编码区序列，PCR产物回收，克隆，测序，将获得的序列进行品种间的多序列比对，寻找分子标记，然后按照序列表SEQIDNO:9和10所示引物，扩增得到如序列表SEQIDNO11所示的序列。5.权利要求1或2所述的遗传标记在猪皮率，背最长肌pH值，股二头肌色值和肌内水分性状关联分析中的应用。6.权利要求3所述的引物在猪皮率，背最长肌pH值，股二头肌色值和肌内水分性状关联分析中的应用。全文摘要本发明属于猪的遗传标记制备
技术领域：
，具体涉及一种与猪生长、胴体和肉质生产相关性状的分子标记及其应用，所述的分子标记是从猪CAML基因的克隆得到的全长为751bp的DNA片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO11所示，在SEQIDNO11所示序列的283-593bp处有一段310bp的插入/缺失突变。其制备方法为从猪背膘组织中提取总RNA，反转录为cDNA，根据NCBI中的拼接序列设计引物扩增基因CAML全长cDNA；从猪血液中提取基因组DNA，设计引物，PCR扩增，PCR产物克隆、测序，序列比较分析，遗传变异检测，标记与性状间相关性分析等。本发明公开了猪CAML基因的cDNA序列和对于第1内含子310bp插入/缺失分型的检测技术，为猪的标记辅助选择提供了新的遗传标记。文档编号C12N15/11GK101812522SQ201010145930公开日2010年8月25日申请日期2010年4月7日优先权日2010年4月7日发明者刘远,李良良,熊远著,王建华,雷明刚申请人:华中农业大学