专利名称：Canine-SLAM/Vero细胞系及构建方法
技术领域：
本发明提供了一种Canine-SLAM/Vero细胞系，本发明还提供了上述细胞系的构 建方法，用于犬瘟热病毒野毒株的分离及其病原学的研究，属于生物工程技术领域。
背景技术：
犬瘟热病毒(Canine distemper virus,⑶V)属于副粘病毒科麻疹病毒属的一种 有囊膜的单股负链RNA病毒。近年来，伴随着生态环境的变化及动物和病毒的进化，CDV的 自然感染宿主已由传统的犬科、鼬科及浣熊科扩展到了食肉目所有8个科及偶蹄目猪科、 灵长目猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物，并且CDV自然感染的宿主范围还有不断扩大的 趋势。虽然犬瘟热病毒的宿主范围在不断扩大，但从患病动物中成功分离到犬瘟热野毒 株一直比较困难，尤其是在犬瘟热发病的非急性期分离是极其不易的，严重制约着对犬瘟 热病的深入研究。传统分离犬瘟热病毒的方法比较多，但都有其明显局限性。例如，将早期 感染犬瘟热动物的病毒阳性组织研磨液上清与SPF犬的淋巴细胞、或SPF雪貂腹腔巨噬细 胞、或丝裂原刺激的犬淋巴细胞、或犬肺泡巨噬细胞共培养分离到⑶V野毒株，但获取这些 细胞比较困难，并且有的要求SPF动物增加了实验的成本和操作要求；也有极少采用病料 接种鸡胚绒毛尿囊膜成功分离到犬瘟热野毒株，但该种方法至少要在新鸡胚上盲传数周才 会出现明显的CPE，并且盲传会导致病毒毒力下降，且利用该途径分离犬瘟热病毒的成本也 比较高；目前低成本分离病毒的途径是利用组织培养分离法。在早期，Vero和MDCK被广泛 用于分离CDV，但该方法至少要在细胞上盲传一个月才会出现CPE，且不是所有的毒株都会 产生CPE，研究发现适应MDCK或Vero细胞系的⑶V毒株的遗传特征会发生变化；经EB病 毒刺激的来自狨猴B淋巴细胞的B95a系(B95-8)对CDV易感，但狨猴是一种濒临灭绝的动 物，且该细胞可向外分泌EB病毒，从实验安全和成本上讲该细胞系也不是分离犬瘟热病毒 的最佳选择。鉴于目前国内还多用传统的方法分离培养犬瘟热病毒，分离成功的几率小，且 时间较长，成本高。所以尽快建立起方便、快速分离犬瘟热病毒的方法显得尤为重要。SLAM是免疫球蛋白超家族CD2的成员，存在于所有激活的T细胞、B细胞和树突状 细胞。目前SLAM已被证实是犬瘟热病毒的主要受体，其与犬瘟热病毒的组织嗜性和感染宿 主有密切联系，研究表明SLAM的V结构域与CDV的膜蛋白H蛋白结合，随之引起融合蛋白 (F蛋白)结构变化，从而使病毒囊膜与细胞膜融合，使病毒进入细胞。
发明内容
本发明公开了一种Canine-SLAM/Vero细胞系，是一种稳定表达犬瘟热病毒受体 的细胞系，能快速且敏感地分离出CDV野毒株，并且在接种病料后36-48h内就能出现CPE， 用于犬瘟热病毒野毒株的分离、滴定及其病原学等多方面的研究。本发明还提供了上述细胞系的构建方法，缩短了分毒时间，提高了病毒产量，稳定 表达犬瘟热病毒的犬SLAM受体。
本发明的Canine-SLAM/Vero细胞系，其特征在于Vero细胞中转染含犬SLAM的真核表达载体，细胞表面稳定表达有犬瘟热病毒受 体 SLAM。本发明上述细胞系的构建方法，技术解决方案如下无菌颈静脉采集犬瘟热阳性犬抗凝血，应用犬淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细 胞，提取总RNA，通过PCR方法获得犬SLAM基因；构建pCAGGS-Neo/SLAM质粒；将构建的 pCAGGS-Neo/SLAM表达盒转染到Vero细胞中，采用G418筛选稳定表达SLAM的细胞系—— Canine-SLAM/Vero ；利用间接免疫荧光法鉴定和检测SLAM在细胞膜表面的表达情况；最后 利用Canine-SLAM/Vero分离不同动物源犬瘟热野毒株，并进行敏感性比较研究。具体制备方法包括以下步骤1.犬外周血淋巴细胞的分离无菌颈静脉采集犬瘟热阳性犬抗凝血，应用犬淋巴细胞分离液按说明书操作分离 外周血淋巴细胞；2.犬SLAM基因cDNA编码的RT-PCR扩增按照经典总RNA提取试剂盒说明书操作提取犬外周血淋巴细胞的总mRNA，应用 Random Primer (6 mer)pd(N)6、Oligo d(T) 15 反转录引物合成 cDNA 后，用引物对 SLAM-F/ SLAM-R扩增犬SLAM基因；上游引物SLAM-F :5，-GCCTCGAGACAGGTGAGAGCTTGATGAAT-3，(Xho I)下游引物SLAM-R :5，-GCAGATCTCAGCTCTCTGGGAACGTCAC-3，(Bgl II)；3.重组表达载体pCAGGS-Neo/SLAM的构建和在Vero细胞上的表达；4. Canine-SLAM/Vero细胞阳性克隆的筛选和培养；在脂质体介导pCAGGS-Neo/SLAM转染Vero细胞后，用含800 u g/mL G418的2% DMEM培养液进行筛选，按常规在细胞长满时消化、传代，连续培养6周后，间接免疫荧光 检测SLAM的表达情况，将得到稳定表达犬瘟热病毒的犬SLAM受体的Vero细胞系—— Canine-SLAM/Vero,冻存于液氮罐中备用。本发明的细胞系培养过程中①培养细胞时需要在培养液中添加微量的G418 (建议用量600-800 u g/mL)，来稳 定受体SLAM的表达；②细胞系冻存前必须添加G418 ；③用于分离犬瘟热病毒研究时，最好使用复苏后的前30代细胞。应用Canine-SLAM/Vero细胞对犬瘟热病毒进行分离情况利用构建的Canine-SLAM/Vero细胞单层吸附接犬源和猴源野生型⑶V与疫苗 株⑶V，Vero细胞作为对照，实验发现这两株野生型⑶V都能在Canine-SLAM/Vero细胞上 生长，且在接毒24-36h产生明显细胞病变，而不能在Vero细胞上产生病变；疫苗株可在 Canine-SLAM/Vero细胞和Vero细胞产生病变，但发现在前者中出现的病变快。本发明与传统病毒分离方法相比其积极效果在于构建了表达犬瘟热病毒的犬 SLAM受体的Vero细胞系(Canine-SLAM/Vero)，接种犬瘟热病料后，可在24_36h出现明显 细胞病变，Canine-SLAM/Vero (前30代之内)不但可用于犬瘟热病毒的分离和病毒的滴定， 而且还显著缩短分离病毒的时间和提高了病毒的产量，有力地推动了对犬瘟热病毒表现型和遗传型等分子特征的研究。此外，本细胞系可安全地进行国内外实验室间的交流和运输。
图1 目的片段SLAM的克隆图；图2 表达载体pCAGGS-Neo/SLAM的PCR鉴定图；图3 :Canine-SLAM/Vero细胞的间接免疫荧光检测SLAM的表达情况照片；图4 正常Vero细胞的间接免疫荧光检测SLAM的表达结果为阴性；图5 细胞照片；A、B、C分别是犬源、猴源野生型⑶V和疫苗株⑶V在Canine-SLAM/ Vero细胞上病变情况；D、E、F分别是犬源、猴源野生型⑶V和疫苗株⑶V在Vero细胞上病 变情况。
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背 离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改 动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。实施例1Canine-SLAM/Vero 细胞系的建立1.犬外周血淋巴细胞的分离无菌颈静脉采集犬瘟热阳性犬抗凝血7ml，应用犬淋巴细胞分离液按说明书操作 分离外周血淋巴细胞后，2500rpm/min离心lOmin。用Hank，s液重悬后置_20°C备用。2.犬SLAM基因cDNA编码的RT-PCR扩增按照经典总RNA提取试剂盒说明书操作提取犬外周淋巴细胞的总mRNA，应用 Random Primer (6 mer) pd (N) 6、Oligo d (T) 15 反转录引物合成 cDNA 后，用参考 GenBank : AF390108. 1设计的引物对上游引物SLAM-F 5，-GCCTCGAGACAGGTGAGAGCTTGATGAAT-3，(Xho I)下游引物SLAM-R :5，-GCAGATCTCAGCTCTCTGGGAACGTCAC-3，(Bgl II)扩增犬SLAM基因(见图1)。将PCR产物回收后，将其克隆入PMD18-T载体；挑取 阳性重组克隆送北京华大中天生物有限公司测序；3.重组表达载体pCAGGS-Neo/SLAM的构建及在Vero细胞上表达经鉴定正确的扩增基因片段经Xho I和Bgl II双酶切后，克隆入经同样酶切操 作的真核表达载体pCAGGS-Neo中，构建表达犬SLAM基因的质粒pCAGGS-Neo/SLAM，并进行 PCR鉴定(见图2)。应用无内毒素质粒中提试剂盒按照说明书提取重组质粒pCAGGS-Neo/SLAM，测定 其浓度和纯度。当浓度达到0. 8ii g/y L以上、0D26(1/0D28(1达到1. 8-2. 0时既可用于转染。 用含8%犊牛血清的DMEM将Vero细胞培养于50mL培养瓶中，当细胞生长至80%单层左 右，按1 2的比例铺于24孔板，在37°C、5%C02的培养箱培养12h。将纯化的重组质粒 pCAGGS-Neo/SLAM 用转染试剂 Lipofectamine 2000Reagent (Invitrogen 公司)按照操作 说明书等量转染Vero细胞，同时设置重复转染孔及正常细胞培养孔，置37°C、5% C02的培 养箱培养24h后，用间接免疫荧光鉴定SLAM蛋白是否表达(见图3、图4)，同时提取细胞基因组，用RT-PCR检测SLAM基因表达情况。4. pCAGGS-Neo/SLAM细胞阳性克隆的筛选和培养在脂质体介导pCAGGS-Neo/SLAM转染Vero细胞24_48h内，对转染孔和对照孔进 行1孔变2孔的传代，用含800 u g/mLG418的2 % DMEM培养液进行筛选，按常规在细胞长满 时消化、传代，连续培养6周后，用间接免疫荧光检测SLAM的表达情况，将得到稳定表达犬 瘟热病毒的犬SLAM受体的Vero细胞系——Canine-SLAM/Vero,冻存于液氮罐中备用。实用例1用Canine-SLAM/Vero细胞分离犬瘟热病毒情况利用构建的Canine-SLAM/Vero细胞单层吸附分离犬源(见图5A)和猴源野生型 CDV (见图5B)与疫苗株CDV (见图5C)，Vero细胞作为对照(见图5D、E、F)，发现这两株野 生型⑶V都能在Canine-SLAM/Vero细胞上生长，且在接毒24_36h产生明显细胞病变，而不 能在Vero细胞上产生病变；疫苗株可在Canine-SLAM/Vero细胞和Vero细胞产生病变，但 发现在前者中出现的病变快。实验发现用Canine-SLAM/Vero细胞培养的病毒滴度比普通Vero细胞至少高10 倍。总而言之，用Canine-SLAM/Vero细胞分离犬瘟热野毒株具有时间短产毒量高等优点。
权利要求
一种Canine-SLAM/Vero细胞系，其特征在于Vero细胞中转染含犬SLAM的真核表达载体，细胞表面稳定表达有犬瘟热病毒受体SLAM。
2.权利要求1所述细胞系的构建方法，技术解决方案如下采集犬瘟热阳性犬抗凝血， 应用犬淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，通过PCR方法获得犬SLAM基因； 构建pCAGGS-Neo/SLAM质粒；将构建的pCAGGS-Neo/SLAM表达盒转染到Vero细胞中，采用 G418筛选稳定表达SLAM的细胞系；利用间接免疫荧光法鉴定和检测SLAM在细胞膜表面的 表达情况，得到细胞系。
3.权利要求2所述细胞系的构建方法，包括以下步骤1)犬外周血淋巴细胞的分离无菌颈静脉采集犬瘟热阳性犬抗凝血，应用犬淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞；2)犬SLAM基因cDNA编码的RT-PCR扩增提取犬外周血淋巴细胞的总mRNA，应用Random Primer (6mer)pd(N)6,Oligo d(T)15反 转录引物合成cDNA后，用引物对SLAM-F/SLAM-R扩增犬SLAM基因；上游引物 SLAM-F 5’ -GCCTCGAGACAGGTGAGAGCTTGATGAAT-3，(Xho I)下游引物 SLAM-R :5，-GCAGATCTCAGCTCTCTGGGAACGTCAC-3，(Bgl II)；3)重组表达载体pCAGGS-Neo/SLAM的构建和在Vero细胞上的表达；4)Canine-SLAM/Vero细胞阳性克隆的筛选和培养在脂质体介导pCAGGS-Neo/SLAM转染Vero细胞后，用含800 μ g/mL G418的2%DMEM培 养液进行筛选，按常规在细胞长满时消化、传代，连续培养6周后，间接免疫荧光检测SLAM 的表达情况，将得到细胞系。
全文摘要
本发明提供了一种Canine-SLAM/Vero细胞系及构建方法，采集犬瘟热阳性犬抗凝血，应用犬淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，通过PCR方法获得犬SLAM基因；构建pCAGGS-Neo/SLAM质粒；将构建的pCAGGS-Neo/SLAM表达盒转染到Vero细胞中，采用G418筛选稳定表达SLAM的细胞系；利用间接免疫荧光法鉴定和检测SLAM在细胞膜表面的表达情况，得到细胞系。本发明不但可用于犬瘟热病毒的分离和病毒的滴定，而且还显著缩短分离病毒的时间和提高了病毒的产量，有力地推动了对犬瘟热病毒表现型和遗传型等分子特征的研究。
文档编号C12R1/91GK101851607SQ201010155790
公开日2010年10月6日 申请日期2010年4月21日 优先权日2010年4月21日
发明者侯小强, 冯娜, 刘玉秀, 夏咸柱, 杨松涛, 王承宇, 王铁成, 高玉伟, 黄耕 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所