专利名称：：一种含贝母的中成药中川贝母的分子生物学鉴定方法
技术领域：
：本发明属于中药鉴定
技术领域：
，具体地说是一种基于基因组RAPD分析的、用于各种含贝母的中成药中川贝母的分子生物学鉴定方法。
背景技术：
：贝母为百合科Liliaceae贝母属FritillariaL.多种植物的干燥鳞茎，是常用中药之一，2010年版《中华人民共和国药典》收载贝母分为五大类川贝母、湖北贝母、平贝母、伊贝母、浙贝母，其中川贝母为百合科植物卷叶贝母F.CirrhosaD.Don、暗紫贝母F.unibracteataHsiaoetK.C.Hsia、甘肃贝母F.przewalskiiMaxim,exBatal、梭砂贝母F.delavayiFranch、太白贝母F.taipaiensisP.Y.Li禾口瓦布贝母F.wabuensisS.Y.TangetS.C.Yueh的干燥鳞茎。由于川贝母疗效良好及资源稀少等原因，始终是贝母类药材中最为昂贵的品种，因此药材市场上以及各种含贝母的中成药中也屡见用其他贝母冒充川贝母的现象。常规的性状、显微以及理化鉴定方法不能将它们区别开，而分子生物学技术的快速发展使得各种贝母的准确鉴定成为了可能。目前对于川贝母的DNA分子鉴定，有采用聚合酶链反应_限制性酶切图谱鉴定方法PCR-RFLP(中国发明专利CN03131798.7)和特异引物PCR方法(PlantaMed2003；69184-186)，前者可将川贝母与其他贝母药材区别开，后者能鉴别卷叶贝母。但是，这些方法对供试材料的要求较高，只能鉴定新鲜鳞茎和叶子，而不能对各种含贝母的中成药，如片齐U、散剂、丸剂等制剂中原料药材进行准确鉴定。因此寻找鉴定中成药中川贝母的方法具有重要的意义。
发明内容本发明公开了一种基于基因组RAPD分析的含贝母中成药中贵重原料药川贝母的鉴定方法，它克服了常规鉴定方法如性状、显微、理化鉴定的不足。本发明含贝母中成药中川贝母的鉴定方法包括建立川贝母的随机扩增多态DNA标准图谱和待鉴定中成药随机扩增多态DNA图谱，将两者进行比对，在待鉴定中成药随机扩增多态DNA图谱中找到与标准图谱对应的条带，则判定待鉴定中成药中贝母成分为川贝母，反之则不是川贝母。上述方法中，建立随机扩增多态DNA图谱的方法包括a、标准品或中成药经处理粉碎成细粉后，预处理除色素，用CTAB法提取各基因组DNA。b、将所提取基因组DNA进行聚合酶链式反应，得到随机扩增多态DNA产物。C、用琼脂糖凝胶对随机扩增多态DNA产物进行电泳，电泳后在紫外光下照相，这一步骤也是本领域常规的方法，采用标准品的则得到随机扩增多态DNA标准图谱，采用待鉴定中成药的则得到待鉴定中成药的随机扩增多态DNA图谱。电泳较好的方法是用1.5%的琼脂糖凝胶分别对随机扩增多态DNA产物进行电泳分离，GelRad直接加在凝胶中，上样量IOyLJnZyL6Χ凝胶加样缓冲液，IOOV下恒压电泳lh。电泳结束后用GelDoc2000在紫外光下照相。本发明中，基因组DNA预处理优选的方法是经组成为200μmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH8.0;50μmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0和250μmol/L氯化钠的TNE液和2%的β-巯基乙醇冰浴30min。本发明中，优选的提取基因组DNA的CTAB提取液为4%十六烷基三甲基溴化铵；lOOmmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH8.0;20mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0;1.4mol/L氯化钠；9%聚乙烯吡咯烷酮；0.1%β-巯基乙醇和0.牛血清白蛋白。优选的水浴温度为90°C，水浴时间2h。提取过程中加入1/3体积醋酸钾冰浴去蛋白，沉淀DNA时加入1/2体积的5mol/L氯化钠使多糖尽可能留在溶液中。本发明中，优选的聚合酶链式反应条件如下10X聚合酶链式反应缓冲液2.5μL；浓度为IU/μL的TaqDNA聚合酶1.5μL；浓度为25謹ol/L的氯化镁2μL；浓度为10μmol/L的随机扩增多态引物0.75μL；浓度为IOmmol/L的dNTPs0.75μL；模板DNA1.5μL；灭菌超纯水16μL0本发明中，优选的聚合酶链式反应扩增程序如下95°C预变性4min；94°C变性45s，40°C退火60s，72°C延伸90s，扩增40个循环；最后于72°C延伸IOmin补齐反应。本发明中，优选的聚合酶链式反应的引物为下列引物之一TCACGTCCAC(上海生工生物工程公司合成，编号S88)、CAGCTCACGA(编号S92)、GGGAATTCGG(编号S126)、GGGCCACTCA(编号S201)、AGGGAACGAG(编号S17)、GAAACGGGTG(编号S27)、GGGTAACGCC(编号S29)、GTGAGGCGTC(编号S62)。更优选的聚合酶链式反应的引物为下列引物之一S88TCACGTCCAC、S92CAGCTCACGA、S126GGGAATTCGG、S201GGGCCACTCA。其中S88在约550bp处产生川贝特异性条带，S92的特异性条带出现在约250bp处，在约200bp处有S126扩增的特异性条带，S201在约500bp分子量处有川贝特异条带。还优选的聚合酶链式反应的引物为下列引物之一S17AGGGAACGAG、S27GAAACGGGTG、S29GGGTAACGCC、S62GTGAGGCGTC,这几个引物能将川贝类内六种川贝母鉴别开。其中S62能清晰地鉴别6个不同基源川贝，S卩暗紫贝母、甘肃贝母、卷叶贝母、梭砂贝母、太白贝母、瓦布贝母，每个种都有特异性条带；S17、S27、S29中太白贝母和瓦布贝母的主条带相近，其它四种川贝母均有特异性条带。本发明的效果体现在下述方面1)本发明采用RAPD分子标记构建含贝母的中成药中川贝母成分的指纹图谱，使中成药中川贝母成分的准确鉴定成为可能，对于保证药材基源的准确性和稳定性具有重要的作用，与常规鉴定方法相比有取样少、不受植物生长环境条件和加工影响等优点。2)本发明对PCR扩增反应体系和扩增程序进行了优化，使结果更为稳定和可靠。3)本发明所选择随机扩增多态引物，除了可以鉴定贝母中成药中川贝类与其它类贝母，还可以用于川贝母的六个基源鉴别。4)本发明能用来鉴别不同剂型的贝母中成药中川贝母成分，如散剂、片剂、胶囊等。5)利用本发明所提供的指纹图谱很容易实现中成药成分鉴定的自动化。6)本发明除了可用于川贝中成药鉴定以外，还可以借鉴用于其它中成药中贵重原料药的鉴定。图1为引物S88对蛇胆贝母散的RAPD扩增产物电泳2为引物S62对蛇胆贝母散的RAPD扩增产物电泳图具体实施例方式实施例1本实施例用收集到的川贝母六个基源的十二个干燥鳞茎和其它四类贝母各一个干燥鳞茎与蛇胆按蛇胆川贝散组成比例(61)配制各蛇胆贝母散做为供试材料(见表1)，提取基因组DNA，进行指定引物的RAPD分子标记分析，用琼脂糖凝胶电泳条带建立标准指纹图谱，用于中成药川贝成分的鉴定。具体操作步骤如下1)、各蛇胆贝母散粉碎成极细粉后，再经TNE液[200μπιΟ1/1三羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液，PH8.0；50μmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0和250μmol/L氯化钠]预处理，用改进的CTAB法提取基因组DNA。操作如下(1)称取0.Ig粉末于一2mL离心管中，加入TNE液1500μL和β-巯基乙醇30μL，冰浴30min后4°CIOOOOrpm离心IOmin；(2)弃上清，加4XCTAB[4%十六烷基三甲基溴化铵；lOOmmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH8.0;20mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0;1.4mol/L氯化钠；9%聚乙烯吡咯烷酮]β-巯基乙醇和1.5yL牛血清白蛋白，混勻，90°C水浴2h；(3)加入I/3体积醋酸钾后冰浴3Omin,4°C12000rpm离心Ιδπη；(4)取上清于另一2mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(241),IlOOOrpm离心IOmin；(5)取上清于另一2mL离心管中，加入1/10体积的10%CTAB[10%十六烷基三甲基溴化铵，0.7mol/L氯化钠]，轻轻混勻，室温放置lOmin，再加等体积的氯仿-异戊醇(241)，混合均勻，IlOOOrpm离心IOmin,重复抽提2次；(6)吸取上清液，加入1/2倍体积的5mol/L氯化钠和0.7倍体积的异丙醇(_20°C预冷)，于_20°C冷冻2h；(7)40C12000rpm离心15min，倒出上清液，将离心管倒置于吸水纸上吸干液体，向管内加入70%乙醇约200μL清洗2次，每次清洗后4°C12000rpm离心3min，轻轻倒掉残留的乙醇。(8)干燥后，加入50μL灭菌超纯水，放入4°C冰箱中备用。2)、将所提取基因组DNA进行聚合酶链式反应，得到随机扩增多态DNA产物。其中，聚合酶链式反应条件如下10X聚合酶链式反应缓冲液2.5μL；浓度为IU/μL的TaqDNA聚合酶1.5μL；浓度为25mmol/L的氯化镁2μL；浓度为10μmol/L的随机扩增多态引物0.75μL；浓度为10mmol/L的dNTPs0.75μL；模板DNA1.5μL；灭菌超纯水16μL。聚合酶链式反应扩增程序为95°C预变性4min；94°C变性45s，40°C退火60s，72°C延伸90s，扩增40个循环；最后于72°C延伸IOmin补齐反应。聚合酶链式反应所述的引物为S88TCACGTCCAC。3)、用1.5%的琼脂糖凝胶分别对随机扩增多态DNA产物进行电泳分离，GelRad直接加在凝胶中，上样量IOyL,力口2yL6XLoadingBuffer，IOOV下恒压电泳Ih；4)、电泳结束后用GelDoc2000在紫外光下照相，得到中成药中川贝母成分的随机扩增多态DNA标准图谱。表1中成药原料产地<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>图1为引物S88(TCACGTCCAC)对十六个蛇胆贝母散的RAPD标记分析电泳图，其中1为空白对照；2、3为蛇胆瓦布贝母散(所用瓦布贝母依次为W2、Wl)；4、5为蛇胆太白贝母散(所用太白贝母依次为T2、Tl)；6、7为蛇胆梭砂贝母散(所用梭砂贝母依次为S2、S1)；8、9为蛇胆卷叶贝母散(所用卷叶贝母依次为J2、Jl)；10、11为蛇胆甘肃贝母散(所用甘肃贝母依次为G2、Gl)；12、13为蛇胆暗紫贝母散(所用暗紫贝母依次为A2、A1)；14为蛇胆浙贝母散；15为蛇胆伊贝母散；16为蛇胆平贝母散；17为蛇胆湖北贝母散；M为200bpDNALaddero可以看出该引物能鉴别蛇胆川贝散与其它蛇胆贝母散(箭头所示为蛇胆川贝散特异条带)。实施例2本实施例供试材料和操作步骤同实施例1，其中随机扩增多态引物为S62GTGAGGCGTC，建立标准指纹图谱用于中成药川贝不同基源的鉴定。图2为引物S62(GTGAGGCGTC)对十六个蛇胆贝母散的RAPD标记分析电泳图，标记与图1相同。可以看出该引物能鉴别蛇胆川贝散中各川贝母的基源(箭头所示为各蛇胆川贝散的特异条带)。权利要求一种含贝母中成药中川贝母的鉴定方法，其特征是包括建立中成药中川贝母的随机扩增多态DNA标准图谱和待鉴定中成药随机扩增多态DNA图谱，将两者进行比对，在待鉴定中成药随机扩增多态DNA图谱中找到与标准图谱对应的条带，则判定待鉴定中成药中贝母成分为川贝母，反之则不是川贝母。2.权利要求1的鉴定方法，建立随机扩增多态DNA图谱的方法包括a、标准品或中成药经处理粉碎成细粉后，预处理除色素，用CTAB法提取各基因组DNA；b、将所提取基因组DNA进行聚合酶链式扩增反应，得到随机扩增多态DNA产物；c、用琼脂糖凝胶对随机扩增多态DNA产物进行电泳，电泳结束后在紫外光下照相，得到随机扩增多态DNA标准图谱或待鉴定中成药随机扩增多态DNA图谱。3.权利要求2的鉴定方法，其中聚合酶链式反应条件如下10X聚合酶链式反应缓冲液2.5iiL；浓度为1U/iiL的TaqDNA聚合酶1.5yL；浓度为25mmol/L的氯化镁2yL；浓度为10umol/L的随机扩增多态引物0.75iiL；浓度为lOmmol/L的dNTPs0.75uL；模板DNA1.5uL；灭菌超纯水16uL。4.权利要求2的鉴定方法，其中聚合酶链式反应扩增程序如下95°C预变性4min；94°C变性45s，40°C退火60s，72°C延伸90s，扩增40个循环；最后于72°C延伸lOmin补齐反应。5.权利要求2的鉴定方法，其中聚合酶链式反应引物的碱基序列选自TCACGTCCAC、CAGCTCACGA、GGGAATTCGG、GGGCCACTCA、AGGGAACGAG、GAAACGGGTG、GGGTAACGCC或GTGAGGCGTC。6.权利要求5的鉴定方法，其中聚合酶链式反应引物的碱基序列选自TCACGTCCAC、CAGCTCACGA、GGGAATTCGG或GGGCCACTCA。7.权利要求5的鉴定方法，其中聚合酶链式反应引物的碱基序列选自AGGGAACGAG、GAAACGGGTG、GGGTAACGCC或GTGAGGCGTC。全文摘要本发明属于中药鉴定
技术领域：
，具体公开了一种含贝母的中成药中川贝母的分子生物学鉴定方法，其特征是本发明基于基因组RAPD分析，建立川贝母的随机扩增多态DNA标准图谱和待鉴定中成药随机扩增多态DNA图谱，将两者进行比对，在待鉴定中成药随机扩增多态DNA图谱中找到与标准图谱对应的条带，则判定待鉴定中成药中贝母成分为川贝母，反之则不是川贝母。本发明克服了常规鉴定方法如性状、显微、理化鉴定的不足。文档编号C12Q1/68GK101831494SQ20101015594公开日2010年9月15日申请日期2010年4月27日优先权日2010年4月27日发明者徐传林,李会军,李萍申请人:中国药科大学