专利名称：一种牛新孢子虫病的检测方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物疫病检测领域，具体涉及原虫寄生虫病的检测方法，特别是涉及一种牛新孢子虫病的检测方法及应用领域。
背景技术：
牛新孢子虫病(Neosporosis)是由犬新孢子虫(Neospora caninum)寄生在宿主 体内引起的一种原虫病。该病可垂直传播，是导致奶牛流产的主要病因之一，给畜牧业造成 了很大的经济损失。该病世界范围内分布广泛。从2001年以来，先后在北京、山西、青海、 河北、新疆等地区的奶牛(牦牛)血清中检出了犬新孢子虫抗体的存在。迄今为止，还没有 防治此病的有效药物和疫苗，因此，良好的检测技术是有效控制本病的良好方法。目前较为常用的检测方法有间接荧光抗体试验(IFAT)、免疫组织化学检测法 (IHC)、亲和素-生物素-过氧化物酶染色法(ABC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳胶凝集 试验(NAT)和免疫印迹法(IB)等，传统方法在牛新孢子虫病的防治中发挥了重要作用，但 存在着一些实验操作复杂，检测周期长，不能检出潜伏感染和早期感染的患病动物等弊端。 随着分子生物学技术的迅速发展，荧光PCR检测技术的应用极大的提高了检测效率和检测 灵敏度。但由于样品中存在大量复杂的未知成分，以及样品处理过程中，一些物质的残留会 影响PCR扩增，使反应测得的灵敏度降低甚至造成假阴性结果，对于荧光PCR检测，无法正 确确定目的基因的拷贝数。通过添加内标共扩增模板的方法对检测结果进行质量控制已得 到广泛的认可。经检索，国内外也未见采用搭桥法PCR扩增构建了内标共扩增模板和荧光探针， 构建了检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校准假阴性结果，提高准确率的检 测牛新孢子虫病的荧光定量PCR方法的报道。因此，探索和研究检测灵敏度高，特异性好， 操作方便且能够指示并校正假阴性结果的方法，对于及时准确有效的检测牛新孢子虫病， 保护畜牧业健康发展、促进我国农产品出口和保护我国在国际贸易中的良好形象等方面均 具有重要意义。
发明内容
针对目前未见有关检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校正假阴性 结果，提高准确率的检测牛新孢子虫病的方法。本发明提供了一种对牛新孢子虫病灵敏、高 效、快速、准确检测的方法。本发明的目的在于提供了一种检测灵敏度高、特异性好、试验周期短，且能够指示 并校正假阴性结果，确保PCR检测准确性的牛新孢子虫病检测方法。本发明通过引物和探针设计，用搭桥法PCR扩增，获得了 N. caninum荧光定量PCR 扩增内标模板，并对内标模板的添加量和反应条件进行了优化，建立了含有内标物的荧光 定量PCR检测体系，从而实现对牛新孢子虫病的灵敏、高效、快速、准确检测。本发明具体提供了一种牛新孢子虫病确证和准确定量的快速检测方法。
本发明的技术方案通过采用在PCR反应体系中加入指示假阴性的扩增内标 (internal amplification control, IAC)，通过碱基重排、引物设计和搭桥法PCR扩增，构 建了一条IAC片段，经条件优化，成功的构建了含有内标的荧光定量PCR反应体系，可以显 示抑制成分的存在或指示假阴性的发生，实现对试验过程实施监测，确保检测质量，从而建 立了一种牛新孢子虫病的检测方法。本发明进一步提供了一种牛新孢子虫病检测方法，具体步骤如下1.引物和探针的设计与合成根据N. caninum Nc-5基因序列设计扩增出138bp的特异性引物Np2和Nr2两条， NTpro荧光探针一条，模板构建引物Npl和Nrl两条，其中Npl、Nrl位于Np2、Nr2外侧，扩 增出长度为338bp的片段。将探针NTpro序列进行重排，利用碱基突变原理，设计引物Ncl 和Nc2，通过搭桥法PCR扩增，构建了内标探针NCpro。2.目标DNA模板的制备牛抗凝全血或牛流产胎儿组织病料按照常规报道的全血基因组DNA提取试剂盒 或组织样品中基因组DNA提取试剂盒进行操作，以犬新孢子虫全基因组DNA为模板，NpU Nrl为扩增引物，反应条件为94°C变性5min ;94°C 30s, 62°C 20s, 72°C 30s, 35个循环；最 后在72°C延伸lOmin。扩增产物经凝胶纯化回收，连接到pMD18_T载体上，转化DH5 α感受 态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定后，获得目标模板pMDIS-NT，本发明简称NT。3.搭桥法PCR扩增和内标探针的设计以质粒NT为模板，分别采用引物Npl、Ncl和Nc2、Nrl为配对引物进行PCR扩增， 扩增条件为94°C 5min ；94°C 30s, 62°C 20s, 72°C 30s，35 个循环；72°C IOmin0 扩增产物分 别命名为Nplcl、Nc2rl ；将Nplcl、Nc2rl纯化回收后等量混合物作为模板，用引物Npl和 Nrl进行PCR扩增，反应条件为94°C变性5min ；94°C 30s，62°C 20s，72°C 30s，35个循环；最 后在72°C延伸lOmin。将扩增后的产物纯化回收并连接到pMD18_T载体上，转化DH5 α感 受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定正确后，获得内标模板PMD18-NC，本发明简称 NC04.单重荧光PCR扩增体系的建立以NT和NC为模板，分别以Np2、Nr2、NTpro和Np2、Nr2、NCpro为引物和探针进行扩 增，然后以浓度分别为IO9 10°拷贝/ μ L的NT与NC混合物为模板，以Npl、Nrl、NTpro和 NCpro为引物和探针进行荧光PCR共扩增，经比较，最终共扩增体系中内标模板添加浓度为 每个反应 IO2 拷贝，Mg2+2. 5mmol/L，dNTP 各 0. 3mmol/L，引物各 0. 5mmol/L，探针各 0. 2mmol/ L，扩增条件为 50°C，2min，l 个循环；95°C，5min，1 个循环；95°C 15s，57°C 45s，45 个循环。本发明中，参照基因库中编号为X84238. 1的N. caninum Nc-5基因序列设计引物 和荧光探针，该N. caninum Nc-5基因序列长1205bp，本领域普通技术人员可以通过公众的 渠道获知。本发明中，以N. caninum Nc_5基因为模板，用引物Npl和Nrl扩增出长度为338bp 的片段，该片段克隆至PMD-18T载体，得到目标模板pMDIS-NT，简称NT。本发明中，以NT为模板，用引物Np2和Nr2扩增出长度为138bp的荧光PCR扩增 片段。本发明中，以NT为模板，用引物Npl、Ncl和Nc2、Nrl分别扩增出长度为194bp和168bp片段，命名为Nplcl和Nc2rl。本发明中，以Nplcl、Nc2rl等量混合物为模板，用引物Npl和Nrl进行PCR扩增出 长度为338bp的片段，该片段克隆至PMD-18T载体，得到内标模板pMD18_NC，简称NC。同时，本发明充分考虑到，当NC和NT两模板同时扩增时，会竞争酶、引物和探针， 对扩增产生影响，对共扩增体系的反应条件和检测低限进行了优化研究。取浓度分别为 IO9 10°拷贝/ μ L的NT与NC混合物，以Np2、Nr2、NTpro和NCpro为引物和探针进行荧 光PCR共扩增，经优化，共扩增体系中内标模板添加浓度为每个反应IO2拷贝，Mg2+2. 5mmol/ L，dNTP 各 0. 3mmol/L，引物各 0. 5mmol/L，探针各 0. 2mmol/L，TaqDNA 聚合酶为 1. 5u，扩增条 件为 50°C，2min，l 个循环；95°C，5min，1 个循环；95°C 15s，57°C 45s，45 个循环。进一步，本发明牛新孢子虫病检测方法的特异性、可重复性检测进行了确证，并建 立了标准曲线。用本发明提供的扩增体系分别扩增了牛疱疹病毒1型、牛白血病病毒、口蹄疫病 毒、刚地弓形虫、牛环形泰勒虫和牛双芽巴贝斯虫DNA或cDNA，被测样品均没有阳性扩增曲 线，表明该方法具有较好的特异性。用本发明提供的扩增体系，以IO2拷贝/反应的NC模板分别与IO7UO5和IO3拷贝 /反应的NT进行多次重复性扩增检测，对不同试验获得的Ct值标准差和变异系数进行分 析，不同试验获得的Ct值变异系数为0. 5% 1. 3%，表明该方法具有较好的重复性。进一步，本发明通过对IO9 10°拷贝/反应浓度的NT与体系中添加浓度为IO2拷 贝的NC共扩增，建立了牛新孢子虫病荧光PCR共扩增检测标准曲线。通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果。1.检测灵敏度高该方法可检测到10个拷贝的重组质粒，灵敏度比常规PCR高 1000 倍。2.检测时间短传统的虫体分离法对N. caninum的检测时间至少要在7d以上，该 发明检测时间包括样品前处理到获得检测结果在2. 5h之内，比常规的PCR检测方法至少缩 短 30min。3.特异性好通过对牛疱疹病毒1型、牛白血病病毒、口蹄疫病毒、刚地弓形虫、牛 环形泰勒虫和牛双芽巴贝斯虫DNA或cDNA样品检测，只有N. caninum检测为阳性。4.重复性好通过对IO7UO5和IO3拷贝/反应3个梯度稀释的NC-5标准质粒进 行三次重复性检测，不同试验获得的Ct值变异系数为0. 5 1. 3%，均在5%之内。5.稳定性高通过对样品的重复性检测，均得到一致性结果。6.污染少与普通PCR检测相比，整个反应在同一个封闭的管内进行，减少了电泳 步骤造成的污染。7.可进行实时监测和定量检测通过仪器对每个扩增中产生荧光信号的接收，实 现对整个反应过程的实时监测和结果的定量检测。8.可指示假阴性结果的发生因该反应体系中的内标模板随着反应的进行而扩 增，如果被测样品和内标模板均没有扩增曲线，说明该检测结果为假阴性结果。9.流程简单操作性强，易于掌握，只要具备分子生物学基础知识，无需良特别的 训练便能很好完成。10.成本低使用的试剂为分子生物学常用试剂，价格便宜，易于采购，用量少。
11.内标模板设计合理通过碱基重排和搭桥法PCR扩增，构建的内标模板两端序列与目的基因序列完全一致，只在探针结合部位序列发生了改变，使之只能与内标探针结 合，内标片段的碱基序列与目的基因的性质也基本完全相同，与同一对引物结合，因此内标 片段与目的基因有同样的扩增效率，确保了共扩增的进行。12.内标模板的添加量合理添加内标模板为100个拷贝的重组质粒，该浓度即能 达到对反应过程的监测，又不影响荧光定量对目标模板荧光PCR的扩增检测。13.实用价值高实现对试验过程实施监测，有效的解决了传统检测方法中存在 的假阴性结果，可以对实验室进行质量监控，确保检测结果的准确性。14.应用效果好用该发明方法对临床收集的50份抗凝全血和8份流产胎儿组织 用该体系进行检测，均得到预期结果。15.借鉴意义大该方法的建立，为相关寄生虫检验检疫技术的研究提供了较好 的借鉴意义，并为规范检测试剂向标准化水平的发展具有指导借鉴意义。16.应用前景广阔该方法能够广泛应用于检验检疫、畜牧兽医和养殖单位，为疫 病的有效防控具有重要意义。
图1所示为N. caninum PCR扩增结果，其中，1为引物Npl/Nrl对N. caninumPCR扩 增产物共 338bp，M 为 DL 2000Marker。图2所示为重组质粒PCR扩增结果，其中，1，2为引物Npl/Nrl对重组质粒PCR扩 增产物共 338bp，M 为 DL2000Marker。图3所示为重组质粒酶切鉴定结果，其中，1为重组质粒酶切产生的片段，M为 DL2000Markero图4所示为Nplcl和Nc2rlPCR扩增结果，其中，1为引物Npl/Ncl对NT的扩增结 果共194bp，2为引物Nc2/Nrl对NT的扩增结果共168bp，M为DL 2000Marker。图5所示为引物、探针相对模板位置。图6所示为NT、NC模板荧光PCR扩增部分序列示意图，其中下划线的为探针序列。图 7 所示为 NTpro (Fig. A)和 NCpro (Fig. B)real-time PCR 扩增曲线，其中，1 为 以NT为模板的荧光PCR扩增曲线；2为以NC为模板的荧光PCR扩增曲线；结果表明，探针 针对各自模板具有较好的特异性。图8所示为IO2拷贝/反应的NC与系列梯度稀释的NT共扩增曲线，其中，1_10为 IO9-IO0拷贝/反应的NT (Fig. Α)和对应的NC (Fig. B)扩增曲线。图9所示为共扩增标准曲线。图10所示为共扩增体系的重复性试验，其中，1-3分别为107，IO5, IO3拷贝/反应 的NT(Fig.A)和对应的NC(Fig.B)扩增曲线。
具体实施例方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的犬新孢子虫基因组DNA、临床样品和相关对照样品，其中犬新孢子 虫全基因组DNA由中国农业大学提供；牛抗凝全血和流产胎儿组织病料等样品采自新疆不同牛场；牛疱疹病毒1型、牛白血病病毒、口蹄疫病毒、刚地弓形虫、牛环形泰勒虫和牛双芽 巴贝斯虫等核酸样品本领域普通技术人员可以通过公众途径获得。本发明中选用的主要试剂全血基因组DNA提取试剂盒(DPI 102)、DNAzol基因组DNA快速提取试剂 (DP3002)、质粒制备试剂盒(DPlOOl)为百泰克公司产品；pMD18_T载体(DlOlA)、DH5 α感 受态细胞、凝胶纯化回收试剂盒(DV805A)、Taq DNA聚合酶(5U/yL)、DL 2000DNA分子量标 准等均为宝生物工程(大连)有限公司产品，引物、探针均由宝生物工程(大连)有限公司 合成。
本发明中选用的主要仪器微量加样器(Eppendorf)，高速冷冻离心(HITACHI CF16RX)，荧光PCR仪 (ABI7300), PCR 仪(Biometra)，电泳仪(Bio-RAD M0DEL200),数字图像分析仪(Alpha innotech corporation IS-2200)，Lambda35 紫外分光光度计(PerkinElmer)等。本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实 施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。本发明中参照基因库中编号为X84238. 1的N. canmum Nc-5基因序列设计引物和 荧光探针，本领域普通技术人员可以通过公众的渠道获知。实施例一牛新孢子虫病的检测1.引物和探针的设计与合成根据N. caninumNc-5基因序列设计扩增出138bp的特异性引物Np2和Nr2两条， NTpro荧光探针一条，模板构建引物Npl和Nrl两条，其中Npl、Nrl位于Np2、Nr2外侧，扩 增出长度为338bp的片段。将探针NTpro序列进行重排，利用碱基突变原理，设计引物Ncl 和Nc2，通过搭桥法PCR扩增，构建了内标探针NCpro。2.目标DNA模板的制备牛抗凝全血和牛流产胎儿组织分别按照百泰克公司的全血基因组DNA提取试剂 盒和DNAzol提取，按实际说明书操作。以犬新孢子虫全基因组DNA为模板，用Npl、Nrl为扩增引物，反应条件为94°C变 性5min ；94°C 30S,62°C 20S,72°C 30S，35个循环；最后在72°C延伸lOmin。扩增产物经凝 胶纯化回收，连接到PMD18-T载体上，转化DH5a感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测 序鉴定后，命名为pMD 18-NT，简称NT。3.搭桥法PCR扩增和内标探针的设计以质粒NT为模板，分别采用引物Npl、Ncl和Nc2、Nrl为配对引物进行PCR扩增， 扩增条件为94°C 5min ；94°C 30S，62°C 20s, 72°C 30s，35 个循环；72°C IOmin0 扩增产物分 别命名为Nplcl、Nc2rl。将Nplcl、Nc2rl等量混合后作为模板，用引物Npl和Nrl进行PCR扩增，反应条件 为94°C变性 5min ；94°C 30S，62°C 20S，72°C 30S，35 个循环；最后在 72°C延伸 lOmin。。将 扩增后的产物纯化回收并连接到PMD18-T载体上，转化DH5 α感受态细胞，提取质粒，经酶 切、PCR及测序鉴定正确后，命名为PMD18-NC，简称NC。4.单重荧光PCR扩增体系的建立以NT和NC为模板，分别以Np2、Nr2、NTpro和Np2、Nr2、NCpro为引物和探针进行扩增，dNTP(2. 5mM)用量分别为1 μ L、1. 5 μ L、2 μ L、2. 5 μ L、3 μ L，引物(10 μ Μ)用量分别为 为 0. 25μ L、0. 5μ L、1 μ L、l. 5μ L、2y L，探针(10 μ Μ)用量分别为 0. 25 μ L、0. 5 μ L、1 μ L、 1. 5μ L,2y L, Mg2+(2 5mM)用量分别为 0. 5 μ L、1 μ L、1. 5 μ L、2 μ L、2. 5 μ L，TaqDNA 聚合酶 (5U/ μ L)用量分别为 0. 125μ L、0. 25μ L、0. 5μ L、1 μ L，DNA 模板 1 μ L，Tm 为 56 61°C，循 环参数为40、45和50，优化一项时其他参数不变。进一步，本发明取109 10°拷贝/ μ L浓度的NT与NC混合物，以Np 1、Nr 1、NTpro和 NCpro为引物和探针进行荧光PCR共扩增，经优化，共扩增体系中内标模板NC添加浓度为每 个反应 IO2 拷贝，Mg2+2. 5mmol/L，dNTP 各 0. 3mmol/L，引物各 0. 5mmol/L，探针各 0. 2mmol/L, 扩增条件为 50°C，2min，l 个循环；95°C，5min，1 个循环；95°C 15s，57°C 45s，45 个循环。本发明中的引物代号、序列、位置见表1。其中，参照基因库中编号为X84238. 1的 N. caninum Nc_5基因序列设计引物和荧光探针，该N. caninum Nc_5基因序列长1205bp，本 领域普通技术人员可以通过公众的渠道获知。表1 引物代号、序列、位置及核苷酸数
LocationNucleotide
codeSequence
(X84238.1)Number,bp
"Npl GGGTGTGCGTCCAATCCTGTAAC 445-46718
Nrl CTCGCCAGTCAACCTACGTCTTC 782-75918
T
Np2 GTGGTTTGTGGTTAGTC ATTCG 592-61316
Nr2 GCATAATCTCCCCCGTCATCAG 729-70820
Ncl ATGTGAGCTGGATACGACGGT45
GGAACGAATGACTAACCACAA AC
Nc2 TCCACCGTCGTATCCAGCTCA45
CATGGTGTGGACAGTGTGTCAA T
NTpro FAM-CACGTTGAAATCAGCCTG 615-63828
CGTCAG -ECLIPSE NCpro HEX-TCCACCGTCGTATCCAGC28
TCACAT -ECLIPSE实施例二 目标模板的获得牛抗凝全血和牛流产胎儿组织分别按照百泰克公司的全血基因组DNA提取试剂 盒和DNAzol提取，按实际说明书操作。选取25yLPCR 反应体系2· 5 μ LlO XBuffer，1. 5 μ L MgCl2 (25mM)， 2 μ LdNTP (2. 5mM)，上、下游引物(10 μ M)各1 μ L，1 μ L犬新孢子虫基因组DNA，0. 25 μ LTaqDNA聚合酶(5U/ μ L)，加ddH20补至25 μ L。PCR反应程序为94°C预变性5min ；94°C变性 30s，62°C退火 20s，72°C延伸 30s，共 35 个循环；72°C延伸 IOmin0
扩增产物用10g/L琼脂糖电泳，并凝胶纯化回收，连接到pMDIS-T载体上，转化 DH5 α感受态细胞，提取质粒进行PCR、酶切及测序鉴定。1.重组质粒的PCR扩增鉴定筛选电泳时较阴性移动慢的重组质粒10倍稀释后， 取 1 μ L 为模板，加入 2. 5 μ L IOXPCR 缓冲液，1. 5 μ L MgCl2 (25mM)，2 μ LdNTP (2. 5mM)混合 物，0. 25 μ L Taq DNA聚合酶(5u/μ L)，上、下游引物(ΙΟμΜ)各1 μ L，补水至25 μ L体积进 行PCR扩增，扩增条件同上，10g/L琼脂糖凝胶电泳检测。2.重组质粒的酶切鉴定在0. 2mL管中加入IOXK Buffer 1 μ L, BamH I和 HindIII酶(15u/y L)各0.3 μ L，质粒DNA 4 μ L，灭菌水补至10 μ L，离心混合均勻，置37°C 水浴消化2h，65°C水浴IOmin灭活内切酶，加入2 μ L6X上样buffer，10g/L琼脂糖凝胶电 泳检测。3.重组质粒的测序将PCR扩增、酶切鉴定均为阳性的质粒克隆，过夜培养，提阳 性质粒测序。琼脂糖凝胶电泳表明，以N. caninum全基因DNA为模板，Npl，Nrl为引物，扩增出 大小相符的338bp片段，重组质粒经引物Npl、NrlPCR扩增和酶切鉴定均得到338bp片段， 测序鉴定均正确。经鉴定正确的重组质粒即为目标模板，命名为PMD18-NT，简称NT。结果 参见附图1、2、3。实施例三内标模板的构建以质粒NT为模板，分别采用引物Npl、Ncl和Nc2、Nrl为配对引物进行PCR扩增， 扩增条件为94°C 5min ；94°C 30S，62°C 20s, 72°C 30s，35 个循环；72°C IOmin0 扩增产物分 别命名为Nplcl、Nc2rl。以质粒NT为模板，分别采用引物Npl、Ncl和Nc2、Nrl为配对引物进行PCR扩增， 25μ L 反应体系，其中 2. 5μ L 10XPCR 缓冲液，1.5yL MgCl2 (25mM), 2 μ LdNTP (2. 5mM)混 合物，0.25 μ L Taq DNA聚合酶(5u/μ L)，上、下游引物(10 μ Μ)各1 μ L，模板1 μ L。扩增 条件为:94°C 5min ；94°C 30S，62°C 20s, 72°C 30s，35 个循环；72°C IOmin0 分别扩增出大小 为194bp和168bp的片段，并命名为Nplcl和Nc2rl，参见附图4。将Nplcl、Nc2rl等量混合后作为模板，用引物Npl和Nrl进行PCR扩增，反应体 系和扩增条件同实施例一、二。将扩增后的产物纯化回收并克隆至PMD18-T载体，同实施例 一、二转化DH5a感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定正确后，命名为pMD18-NC， 简称NC。Ncl和Nc2拼接部分即为内标探针序列。各引物、探针相对模板位置及内标模板构建图参见附图5。NT、NC荧光PCR扩增部 分序列如下，可参见附图6。实施例四单重荧光PCR扩增体系的建立以NT和NC为模板，分别以Npl、NrU NTpro和Npl、NrU NCpro为引物和探针进 行扩增，25 μ L反应体系，其中Mg2+L 5mmol/L，dNTP各0. 2mmol/L，引物各0. 4 μ mol/L，探针 0. 2 μ mol/L, Taq 酶 1. 25u，模板 1 μ 1，扩增条件为 50°C，2min, 1 个循环；95°C，5min, 1 个循 环；95°C 15s，57°C 45s，45个循环。结果表明，探针针对各自模板具有较好的特异性，扩增 曲线参见附图7。
实施例五共扩增检测低限的测定当NC和NT两模板同时扩增时，会竞争酶、引物和探针，对扩增产生影响，应该重新 研究共扩增体系的反应条件和检测低限。取IO9 10°拷贝/ μ L浓度的NT与NC混合物，以Np 1、Nr 1、NTpro和NCpro为弓| 物和探针进行荧光PCR扩增。由于NC与NT在同一反应中进行扩增，检测引物也相同，二 者会对底物、引物、酶等进行竞争，因此，选择适宜浓度的NC片段添加到荧光定量PCR检测 体系至关要。经优化，本发明的共扩增体系中选择内标模板添加浓度为每个反应IO2拷贝， Mg2+2. 5mmol/L, dNTP 各 0. 3mmol/L，引物各 0. 5mmol/L，探针各 0. 2mmol/L，其余条件同实施 例三，扩增曲线参见附图8。实施例六标准曲线的建立取IO9 10°拷贝/μ L浓度的NT与NC混合物，以Npl、Nrl、NTpro和NCpro为引物 和探针进行荧光定量PCR共扩增，经优化，共扩增体系最终选择内标模板添加浓度为每个 反应 IO2 拷贝，其中 Mg2+2. 5mmol/L，dNTP 各 0. 3mmol/L，引物各 0. 5mmol/L，探针各 0. 2mmol/ L，扩增条件为 50°C，2min，l 个循环；95°C，5min，1 个循环；95°C 15s，57°C 45s，45 个循环。 以NT的扩增曲线制定标准曲线，参见附图9。从获得的标准曲线可以看出，在所测的浓度范 围内，标准品的浓度与对应的Ct值呈现明显的线性相关关系，其回归曲线的斜率为-3. 08， 截距为42. 05，相关系数R2为0. 997，该系数大于0. 95，且各稀释度的扩增点均合理分布于 标准曲线旁，表明该研究获得的标准曲线良好。实施例七方法的特异性检测以实施例六中的反应体系和扩增条件分别扩增了牛疱疹病毒1型、牛白血病病 毒、口蹄疫病毒、刚地弓形虫、牛环形泰勒虫和牛双芽巴贝斯虫等DNA或cDNA样品，被测样 品均为阴性，说明本发明提供的方法具有较好的特异性。实施例八重复性检测以实施例六中的反应体系和扩增条件分别对IO7UO5和IO3拷贝/反应的NT进行 多次重复性扩增检测，不同试验获得的Ct值变异系数为0. 5% 1. 3%，均在10%以内，表 明本发明方法具有很好的重复性和稳定性，扩增曲线参见附图10。实施例九方法的灵敏度比较以10倍梯度稀释的Nc-5标准质粒(10° IO9拷贝/ μ L)作为模板用Npl和Nrl 为引物进行普通PCR扩增，反应体系和扩增条件同实施一、二，反应产物凝胶电泳检测，扩 增出长度为338bp的特异性片段，以呈阳性反应的最高稀释度作为检测灵敏度。同时用实 施例四建立的不含内标的荧光PCR法检测。结果显示该含内标的荧光PCR方法检测灵敏度 比普通PCR灵敏度高1000倍，与不含内标的荧光PCR灵敏度相当。实施例十对临床样品的检测对采自牛新孢子虫病流行区的50份全血(其中3份已经鉴定为阳性)和8份流 产胎儿样品(其中1份已经鉴定为阳性)用所建立的方法进行检测。有2份全血(包含1 份阳性)的样品和内标模板均没有扩增曲线，表明所提核酸有问题。重新提取核酸进行扩 增，内标模板和阳性样品均扩增出曲线。
权利要求
一种牛新孢子虫病检测方法，其特征在于，所述的检测方法具体步骤如下(1)根据犬新孢子虫N.caninum Nc-5基因序列设计扩增出138bp的特异性引物Np2、Nr2和NTpro荧光探针，构建模板引物Np1和Nr1，其中Np1、Nr1位于Np2、Nr2外侧，扩增出长度为338bp的片段；将探针NTpro序列进行重排，设计引物Nc1和Nc2，通过搭桥法PCR扩增，构建了内标探针NCpro；(2)以犬新孢子虫全基因组DNA为模板，用Np1、Nr1为扩增引物，反应条件为94℃变性5min；94℃ 30s，62℃ 20s，72℃ 30s，35个循环；最后在72℃延伸10min；扩增产物经凝胶纯化回收，连接到pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定后，构建质粒NT；(3)以质粒NT为模板，分别采用引物Np1、Nc1和Nc2、Nr1为配对引物进行PCR扩增，扩增条件为94℃ 5min；94℃ 30s，62℃ 20s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min，获得扩增产物Np1c1、Nc2r1；将扩增产物Np1c1、Nc2r1纯化回收，等量混合后作为模板，用引物Np1和Nr1进行PCR扩增，反应条件为94℃变性5min；94℃ 30S，62℃ 20s，72℃ 30s，35个循环；最后在72℃延伸10min；将扩增后的产物纯化回收并连接到pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定，构建质粒NC；(4)以质粒NT和NC为模板，以Np2、Nr2、NTpro和NCpro为引物和探针进行扩增，dNTP用量为0.3mmol/L，上下游引物用量各0.5mmol/L，两种探针用量0.2mmol/L，Mg2+用量为0.2mmol/L，TaqDNA聚合酶用量为1.5u，被检样品DNA模板1μL，NC模板100拷贝，Tm为60℃，循环参数为45个循环。
2.按照权利要求1牛新孢子虫病检测方法，其特征在于，所述的通过引物设计和搭桥 法PCR扩增，构建了内标探针NCpro，并获得了荧光PCR内标共扩增模板。
3.按照权利要求1牛新孢子虫病检测方法，其特征在于，所述的共扩增检测体系中， Mg2+2. 5mmol/L, dNTP 各 0. 3mmol/L，引物各 0. 5mmol/L, NC 模板 100 拷贝，探针各 0. 2mmol/ L, TaqDNA 聚合酶 1. 5u。
4.按照权利要求1牛新孢子虫病检测方法，其特征在于，所述的共扩增检测体系的扩 增条件为 50°C，2min，l 个循环；95°C，5min，1 个循环；95°C 15s，57°C 45s，45 个循环。
全文摘要
本发明公开一种牛新孢子虫病检测方法，通过采用在PCR反应体系中加入指示假阴性的扩增内标，通过碱基重排、引物设计和搭桥法PCR扩增，构建了一条内标模板，并构建了含有内标的荧光定量PCR反应体系，确定了共扩增体系的反应条件，Mg2+2.5mmol/L，dNTP各0.3mmol/L，引物各0.5mmol/L，探针各0.2mmol/L，扩增条件为50℃，2min，1个循环；95℃，5min，1个循环；95℃15s，57℃45s，45个循环。本发明检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校正假阴性结果的发生，广泛应用于及时准确有效的检测牛新孢子虫病领域。
文档编号C12Q1/68GK101831495SQ20101016043
公开日2010年9月15日 申请日期2010年4月30日 优先权日2010年4月30日
发明者于学辉, 刘菲, 员丽娟, 季新成, 段晓东, 牛国辉, 窦辉, 黄玲 申请人:新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心