专利名称：烈性噬藻体PaV-LD基因组及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及噬藻体基因组学和基因工程领域。更具体涉及一种烈性噬藻体PaV-LD 基因组，同时涉及一种烈性噬藻体PaV-LD全基因的制备方法，还涉及一种烈性噬藻体 PaV-LD全基因在蓝藻水华控制中的应用，特别涉及烈性噬藻体PaV-LD溶解蓝藻功能基因 及其编码的溶藻蛋白的功能用途。
背景技术：
蓝藻又称为蓝细菌，是海洋、湖泊中最常见的微生物，一毫升海水中蓝藻细胞的数 量超过100万个。这种单细胞生物没有叶绿体，仅有十分简单的光合作用结构装置，却能像 高等植物一样进行光合作用。事实上，蓝藻承担了全球四分之一的光合作用。令人们担忧 的是，随着水体环境的富营养化，蓝绿藻形成水华频繁爆发，其危害日益严重。感染蓝藻的病毒(也称噬藻体，phycophage)，其遗传物质DNA或RNA在入侵藻细 胞后，会修饰自身和藻的DNA，并且控制藻体内的各种代谢途径。多数噬藻体能裂解宿主藻， 为溶藻性的噬藻体。噬藻体感染蓝藻后，在蓝藻体内大量繁殖子代噬藻体，然后将蓝藻裂 解，从而释放子代，并且继续感染其它蓝藻。它侵染蓝藻细胞时，对其它非宿主水生动植物 不会产生毒害。噬藻体裂解蓝藻作为一种生物控藻技术，有巨大的潜在发展应用前景。由于现有 的治理有害藻华物理、化学和生物方法在藻类控制技术上存在缺陷或不足，不仅耗费大量 的资金和设备，而且往往在使用过程中对其它水生生物造成严重危害。而利用噬藻体控制 有害蓝藻水华可以弥补以上方法的不足。首先，噬藻体具有很高的生长速率，短时间可以大 量获得扩增，这满足天然环境的大规模需要。其次，它所需要的培养费用较低，设备简单，操 作方便。尤其是它能特异性感染引起有害水华的目标藻类，不侵染其它生物类群(Nagasaki et al.，Applied andEnvironmental Microbiology, 1999,65(3) :898_902 ；杨小茹等，应 用与环境生物学报，2005，11 (5) 651-656 ；Deng et al. , Freshwater Biology, 2008, 53 1240-1252)。同时，子代噬藻体随着宿主藻的减少而逐渐消亡(Nobel andFuhrman, Applied and Environmental Microbiology, 1997,6377-83 ；Wommackand Colwell, Microbiology Reviews, 2000,64 :69_110)，有助于维护生态平衡。因此，噬藻体作为微生物因子防治 蓝藻水华具有明显的社会和经济效益(Yoshida et al.，Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72 :1239_1247 ；2008，74 :3269_3273 ；张奇亚和桂建芳等，中国科学院 院刊，2009，24 (4) ；414-420)。但由于噬藻体引起宿主快速消亡的机理尚不明晰，因此亟待 从噬藻体基因组序列解析入手，阐明噬藻体的基因组织结构及其功能，进而从基因水平了 解烈性噬藻体裂解藻的过程，筛选并研发有商业价值的裂解藻相关基因产品，就成为当前 水生病毒学研究的热点之一。迄今，能检索到的有关噬藻体全基因组序列不超过10项，且无一项噬藻体基因组 序列专利。因此，在对新鉴定的、能裂解水华蓝藻浮丝藻的噬藻体PaV-LD全基因组进行序 列测定、绘制了其基因组织结构图、并对其裂解蓝藻功能基因开展研究的基础上，我们就
3“烈性噬藻体PaV-LD全基因组序列及其应用”提出专利申请。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种烈性噬藻体PaV-LD基因组核苷酸，该基因组特 征在于具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，基因组DNA由95299个碱基对组成，其中 G+C含量为41. 45 %，可编码含35至1584个氨基酸的多肽或蛋白质，共推导142个开放阅 读框(ORFs)，如图1A、图1B、图1C、图1D、图IE所示。该基因组全长序列及组织结构分析， 有助于了解噬藻体PaV-LD增殖及重要调控功能有关的基因结构和功能，建立PaV-LD的感 染途径并找到其与宿主相互作用的分子机理，为利用噬藻体作为微生物制剂生物防控蓝藻 水华奠定可靠的理论依据。本发明的另一个目的是在于提供了一种烈性噬藻体PaV-LD基因组的制备方法， 该方法有效地扩增并纯化噬藻体PaV-LD，从而提取完整和高纯度的噬藻体PaV-LD基因组 DNA。本发明的再一个目的是在于提供了一种烈性噬藻体PaV-LD基因组在蓝藻水华控 制中的应用。以此基因组序列和此序列所包含基因表达的多肽或蛋白质为目标开展生物制 剂研究，从而为综合防治蓝藻水华产生积极作用。在本发明的一个实例中公开了一种能降解蓝藻藻胆蛋白体光捕复合物的蛋白生 产方法，该蛋白由PaV-LD基因组第13384至13548个核苷酸序列编码的NblA基因表达获 得，其在病毒浸染蓝藻细胞过程中与宿主光合系统的捕光性能以及病毒自身的增殖密切相 关。该方法是利用pET32a原核表达系统，NblA基因表达蛋白量高效且为可溶性，有利于工 业化大量生产和提纯。在病毒感染宿主细胞的过程中，该基因序列所编码的蛋白能特异降 解宿主类囊体膜上的捕光复合体藻胆蛋白体，从而达到控制蓝藻生长繁殖。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种烈性噬藻体PaV-LD全基因组的制备方法，其步骤是1.噬藻体的培养一种烈性噬藻体PaV-LD(由本实验室分离并保存的噬藻体)接种感染指数生长期 的浮丝藻，经3-4天感染裂解后，获取噬藻体PaV-LD裂解的藻液。2.噬藻体纯化噬藻体PaV-LD裂解的藻液离心去细胞碎片，加核酸酶(DNase和RNase)至其终浓 度为ι μ g/ml，室温(20-25°C以下相同)放置55-65分钟；每IOOml悬液加入9. 3g聚乙二 醇8000与5. 8g氯化钠，摇勻至溶解，置4°C，过夜；26000转/分超速离心1. 5h ；噬藻体悬 浮于3-5mlPBS缓冲液，4°C过夜；噬藻体悬液置于蔗糖密度梯度(20%-60% )上，在4°C，以 19000转/分离心40min ；取出噬藻体条带，用灭菌蒸馏水洗涤，以26000转/分离心1. 5h， 弃上清，留噬藻体沉淀；用2mlTE缓冲液(lOmmol/L Tris-Cl，lmmol/L EDTA，pH7. 4)将沉淀 悬浮，制备成噬藻体PaV-LD悬液，分装成每管0. 5ml，置于-20°C保存备用。3.基因组DNA提取取上述0.5ml噬藻体PaV-LD悬液，加入蛋白酶K(终浓度为Img/μ L)，37°C温育 Ih ；加等体积的Tris饱和酚，混勻，10000转/分(Sigmal_15K，12024-H型角转头)，5min 离心，上层清液转入另一新离心管；加等体积Tris饱和酚-氯仿(1 1)，混勻，10000转/分离心5min，上层清液转入另一新离心管；加等体积氯仿-异戊醇(24 1)，混勻，10000 转/分离心5min，上层清夜转入另一新离心管；加0. 4体积乙酸铵和二体积的异丙醇，充分 混勻，室温放置lOmin，10000转/分离心5min ；弃上清，用预冷的75% (体积比)乙醇洗 涤沉淀两次，室温下晾干；将晾干好的噬藻体PaV-LD基因组DNA溶于30 μ L TE (10mmol/L Tris-Cl, lmmol/L EDTA, ρΗ7· 4)缓冲液中，_20°C保存备用。4. PaV-LD全基因组序列的测定在由深圳华大基因科技有限公司完成噬藻体PaV-LD基因组大片段测序，获取含5 个重叠序列群和四个序列缺口的噬藻体PaV-LD基因组序列支架；在每个重叠序列群两端 设计向外延伸引物，采用PaV-LD基因组为模板DNA以及上下游引物进行PCR扩增序列缺 口 ；将PCR扩增的目的序列片段连接PMD18-T载体(TaKaRa公司产品)，转化DH5 α感受态 细胞(TaKaRa公司产品)；挑取序列缺口的目的片段阳性克隆菌进行测序；拼接后获得一种 分离的烈性噬藻体PaV-LD全基因组，其序列为SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列。一种烈性噬藻体PaV-LD全基因在蓝藻水华控制中的应用，基本步骤是在含量为IO6个/毫升藻细胞培养液中，接种IO6IU/毫升噬藻体PaV-LD，光照度 为30001ux，25°C，光暗比为14 10的条件下连续培养，每天定时计数藻细胞量，一段时间 (4-5天)后，被感染的蓝藻细胞被裂解死亡，图3所示烈性噬藻体PaV-LD对蓝藻细胞致死 效果。一种表达降解蓝藻藻胆蛋白体光捕复合物NblA基因的方法，基本步骤是1.引物设计针对表达载体pET32a(InVitrogen公司产品)的酶切位点设计两条引物，其一为 5，端带KpnI酶切位点的上游表达引物PaVF =T GTT GGTACCCTT ATA ACAGCG GAA3，;其二为 3，端带XhoI酶切位点的下游表达引物PaVR :5，AGT TCTCGA GTT TGG GTT GTT TTC C。2.表达载体pET-NblA的构建根据上述引物进行PCR扩增，获得的PCR产物经的(质量体积比)琼脂糖胶电 泳，用DNA凝胶回收试剂盒(MBI Fermentas公司产品)回收，连接到PMD18-T载体，并转化 DH5a感受态细胞，筛选获得含NblA全长的质粒pT-NblA。表达载体pET32a (Invitrogen 公司产品)和NblA基因片段分别经KpnI和XhoI双酶切后按1 5的比例连接，产物转化 E. coliBL21(DE3)感受态细胞(Invitrogen公司产品)感受态细胞，选出阳性克隆并测序验 证。3.表达载体pET-NblA的诱导表达将测序鉴定读框正确的阳性克隆接种于5ml含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培 养基中，37°C振荡培养，经IPTG(苯甲基磺酰氟)诱导后，进行SDS-PAGE电泳检测，获得如 图2所示的NblA基因表达产物(加上分子标签表达后，分子量约为23. 9kDa)。该产物为烈 性噬藻体PaV-LD基因组第13384至13548个核苷酸序列编码含54个氨基酸的多肽。NblA 基因在病毒浸染蓝藻细胞过程中与宿主光合系统的捕光性能以及病毒自身的增殖密切相 关。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果1.首次从浮丝藻中分离到烈性噬藻体PaV-LD，并提供了噬藻体PaV-LD基因组全 序列。制备噬藻体PaV-LD基因组核酸可程序化操作，批量生产。
2.建立噬藻体标记基因特异、敏感的诊断方法，及对不同水体中烈性噬藻体 PaV-LD与其宿主水华蓝藻浮丝藻的含量分析检测技术，可规范操作。3.烈性噬藻体PaV-LD溶藻功能基因产物的大量表达，将提供一种新型、环保控藻 方法和途径。4.实验效果及数据(1)烈性噬藻体PaV-LD对蓝藻裂解效果测定，见表1。表1烈性噬藻体PaV-LD对蓝藻裂解效果测定
组别感染前感染后(5天)日裂解量 (个/毫升)藻细胞量 (个/毫升)藻液颜色藻细胞量 (个/毫升)藻液颜色PaV-LD感染组IO6蓝绿IO3黄且清亮透明IO5未加PaV-LD对照IO6蓝绿IO8蓝绿0以上感染试验结果表明，烈性噬藻体PaV-LD接种宿主蓝藻后能明显引起藻细胞 的裂解死亡，且藻细胞量平均每天下降高达IO5个/毫升，藻液颜色明显由正常的蓝绿色变 为黄且清亮透明，见图3，因此一种烈性噬藻体PaV-LD对有害目标蓝藻水华的具有抑制作用。(2)烈性噬藻体PaV-LD对捕光复合体藻胆蛋白体生物降解活性测定，见下表2。表2烈性噬藻体PaV-LD对捕光复合体藻胆蛋白体生物降解活性测定
组别降解效率(％)0小时12小时24小时36小时48小时感染组08425685正常组00000 以上试验结果表明，接种了噬藻体PaV-LD的藻液比正常对照藻液的捕光复合体 藻胆蛋白体含量随感染时间推移明显呈下降趋势。
图1A、图1B、图1C、图1D、图IE —种烈性噬藻体PaV-LD全基因组的组织结构图。 箭头示预测基因在PaV-LD基因组序列中的位置、大小及方向。斜纹箭头示与噬藻体(噬菌 体)具有同源性的基因；黑色箭头示与蓝藻具有同源性的基因。白色箭头示未知功能基因。 比例尺每格长度为1000个碱基对。图2pET_NblA质粒表达纯化的SDS-PAGE分析图。M 蛋白分子量标准；1 =IPTG诱 导的细菌总蛋白；2:未经IPTG诱导的细菌总蛋白；箭头示NblA基因的表达产物。图3 —种烈性噬藻体PaV-LD对蓝藻致死效应图。A =PaV-LD感染蓝藻细胞培养液； B:正常蓝藻细胞培养液。
具体实施例方式为了实现上述目的，本发明中采用以下具体实施方式
获取烈性噬藻体PaV-LD基 因组序列实施例1 噬藻体PaV-LD的培养及其核酸制备方法，基本步骤如下1.噬藻体的培养一种烈性噬藻体PaV-LD感染的宿主蓝藻为浮丝藻。纯化的噬藻体液(滴度IO6IU/ ml)以1 10的体积比接种到指数生长期的浮丝藻中，4天后，收集噬藻体PaV-LD裂解的 藻液。一种烈性噬藻体PaV-LD的分离具体方法和步骤见Aquatic Microbial Ecology (Gao et al.，200954 163-170)。2.噬藻体纯化(1)噬藻体 PaV-LD 裂解的藻液 300ml，经 9000 转 / 分离心(Sigma 1-15K，12024-H 型角转头)15min去细胞碎片；(2)取上清液，加核酸酶(DNase和RNase)至其终浓度为1 μ g/ml，室温(置 20-25°C以下相同)放置1小时;(3)每IOOml悬液加入9. 3g聚乙二醇8000与5. 8g氯化钠，摇勻至溶解，置4°C， 过夜；(4)用超速离心机，以26000转/分(Beckman L-90K，Sff41型水平转头)离心 1. 5h ；(5)留沉淀，加入3-5ml高压灭菌(121°C，30min)的蒸馏水悬浮噬藻体；(6)噬藻体悬液置于蔗糖密度梯度(20% -60% )上，在4°C，以19000转/分 (Beckman L-90K, Sff41 型水平转头)离心 40min ；(7)取出噬藻体条带，用灭菌蒸馏水洗涤，以26000转/分离心(BeCkmanL-90K， Sff41型水平转头)1. 5h，弃上清，留噬藻体沉淀；(9)用 2mlTE 缓冲液(10mmol/L Tris-Cl，lmmol/L EDTA, ρΗ7· 4)将沉淀悬浮，制 备成噬藻体PaV-LD悬液，分装成每管0. 5ml，置于-20°C保存备用。3.基因组DNA提取(1)取上述0.5ml噬藻体PaV-LD悬液，加入蛋白酶K (终浓度为Img/μ L)，37 °C 温育1小时；(2)加等体积的Tris饱和酚，混勻，10000转/分(Sigmal_15K，12024-H型角转 头)，5min离心，上层清液转入另一新离心管；(3)加等体积Tris饱和酚-氯仿(1:1)，混勻，10000转/分离心5min,上层清
液转入另一新离心管；(4)加等体积氯仿-异戊醇(24 1)，混勻，10000转/分离心5min，上层清夜转
入另一新离心管；(5)加0. 4体积乙酸铵和2体积的异丙醇，充分混勻，室温放置lOmin，10000转/ 分离心5min ；(6)弃上清，用预冷的75% (体积/体积)乙醇洗涤沉淀两次，室温下晾干；(7)将晾干好的噬藻体PaV-LD基因组DNA溶于30 μ LTE缓冲液(IOmmol/
7LTris-Cl, lmmol/L EDTA, pH7. 4)中，_20°C保存备用，从而得到一种烈性噬藻体PaV-LD基 因组核酸DNA。实施例2 噬藻体PaV-LD全基因组序列的测定、序列拼接及其验证在由深圳华大基因科技有限公司完成噬藻体PaV-LD基因组大片段测序，提供含5 个重叠序列群和4个序列缺口的噬藻体PaV-LD基因组序列支架的基础上，本实验室继续进 行了拼接、序列分析及验证。具体步骤如下1.重叠序列群的链接根据深圳华大基因科技有限公司初步测序结果，在每个重叠序列群两端设计向外 延伸引物，采用PaV-LD基因组为模板DNA以及上下游引物进行PCR扩增序列缺口。(1) PCR扩增序列缺口第一个序列缺口 上游引物为5’ TAACTGCTAAATCTTTTTCCCTGCG 3’，下游引物为 5，CGATATTAACTGCTGAAACTGTGCG3，；扩增程序为 94°C预变性 5min，94°C变性 30sec，58°C退 火30sec, 72°C延伸1. Omin, 32个循环；72°C再延伸IOmin0片段大小为195个碱基。第二个序列缺口 上游引物为5 ’ CTGTAAAGAGGGAAGTTGGCATAGA3 ’，下游引物为 5，GATACCATCCCTTTCTAGGCTTTGA3，；扩增程序为 94°C预变性 5min，94°C变性 30sec，58°C退 火45sec，72°C延伸1. 5min, 32个循环；72°C再延伸IOmin0片段大小为958个碱基。第三个序列缺口 上游引物为5 ’ TCACGGGTTTTAACAACAAAGTAGG3 ’，下游引物为 5，CACTATCTCATTACCCGTTGTTTCG3，；扩增程序为 94°C预变性 5min，94°C变性 30sec，58°C退 火45sec，72°C延伸1. 5min, 32个循环；72°C再延伸lOmin。片段大小为1384个碱基。第四个序列缺口 上游引物为5 ’ TCACTCCACTCAATCTTCGGGATT3 ’，下游引物为 5，TGAACGCAGCAGAAGTCAGAAAG3，；扩增程序为 94°C预变性 5min，94°C变性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸1. Omin, 32个循环；72°C再延伸IOmin0片段大小为285个碱基。在无菌PCR管中加入反应体系IOX扩增缓冲液2. 5 μ L10mmol/L dNTP 混合液(各 2. 5mmol/L) 0. 5 μ L10ymol/L 上游引物0.5yLΙΟμπιοΙ/L 下游引物0.5yL模板 DNA1 μ LTaq 聚合酶0. 5 μ L力口 ddH2019. 5 μ L总体积25 μ L_(2)电泳检测及回收目的片段PCR产物用(质量/体积)的琼脂糖胶电泳检测后，将凝胶置于紫外分析仪内， 切下含PCR产物的胶块，并用DNA凝胶回收试剂盒(MBI Fermentas)回收，PCR产物最后溶 于IOyL的灭菌蒸馏水。(3)连接反应目的片段按如下体系与PMD18-T载体(TaKaRa公司产品)进行连接
8
含T4连接酶缓冲液目的片段序列PMD18-T 载体
5 μ L 4. 5μ L 0. 5μ L上述体系在16°C连接，过夜。(4)转化取100 μ L的大肠杆菌DH5a感受态细胞(TaKaRa公司产品)；加入连接反应产 物(10 μ L)，在冰上放置30min ；42°C恒温条件下热激90sec，再在冰上放置2-3min ；加入 890 μ L无氨苄青霉素的LB培养液，37°C振荡培养Ih ；涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37°C 恒温培养过夜。(5)测序从培养平板挑取单菌落进行PCR检测，将含有序列缺口的目的片段阳性克隆菌交 给华大基因科技有限公司测序。待所有序列缺口的核酸片段测序完毕后，进行拼接，由此获得噬藻体PaV-LD全基 因组95，299bp序列，一种分离的烈性噬藻体PaV-LD全基因，其序列为SEQIDN0 :1所示的核 苷酸序列。2.全基因组序列的验证为避免出现测序误差，利用premier 5. 0软件(PREMIER BiosoftInternational)，按l_2kb长度随机设计引物，进行PCR反应，并对PCR扩增产物进 行PMD18-T载体(TaKaRa公司产品)连接，转化到DH5 α感受态细胞(TaKaRa公司产品) 后，挑取大肠杆菌阳性克隆进行测序验证。共计进行了 25次验证，所有序列均与SEQ ID NO 1中相关序列一致，证明SEQ ID NO ；1中的序列正确。实施例3:噬藻体PaV-LD全基因组序列生物信息预测及其组织结构图绘制，基本步骤如下1.采用 GeneMarks (http // exon.biology. Ratech. edu/heuristic hmm2. cri)、 Glimmer3以及EditSeq(DNAStar)等计算机辅助软件分析噬藻体PaV-LD基因组序列，获得 基因组中开放阅读框(ORF)的位置、数量、大小及方向。2.利用 Nucleotide blast 在 NCBI 数据库(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)中 进行基因同源性比对。3.根据噬藻体PaV-LD基因组中每个开放阅读框的位置、大小、方向以及基因同源 性比对结果，采用Microsoft office计算机软件绘制PaV-LD基因组的组织结构图，见图实施例4:一种烈性噬藻体PaV-LD全基因在蓝藻水华控制中的应用，其步骤是1. PaV-LD接种病毒液的制备PaV-LD为分离于武汉东湖自然水生态环境中的噬藻体，感染蓝藻后获取蓝藻细胞 裂解液，经12000转/分离心(Sigmal-15K，12024-H型角转头)IOmin去细胞碎片，取上层 清液做为接种病毒液。2. PaV-LD对蓝藻生长控制在含量为IO6个/毫升藻细胞培养液中，接种IO6IU/毫升噬藻体PaV-LD，光照度为30001uX，25°C，光暗比为14 10的条件下连续培养，每天定时计数藻细胞量。经浮游计数 框可检测到，藻细胞量平均每天下降IO5个/毫升。与未接种噬藻体PaV-LD的正常藻细胞 对照样比较，3天后藻液颜色有明显差别，正常藻液呈蓝绿色，而接种了噬藻体PaV-LD的藻 液因细胞裂解而呈浅黄色。如图3所示，一种烈性噬藻体PaV-LD对蓝藻细胞的致死效果。实施例5:一种表达降解蓝藻藻胆蛋白体光捕复合物NblA基因的方法，其步骤是1.表达载体pET-NblA的构建针对表达载体pET32a(InVitr0gen公司产品)的酶切位点设计两条引物，其一为 5，端带KpnI酶切位点的上游表达引物PaVF =T GTT GGTACCCTT ATA ACAGCG GAA3，;其二为 3，端带XhoI酶切位点的下游表达引物PaVR :5，AGT TCTCGA GTT TGG GTT GTT TTC C。在无 菌PCR管内加入2. 5μ LlOX扩增缓冲液(BestBio公司产品)，0. 5yL 10mmol/L dNTP混 合液(各 2. 5mmol/L)，0. 5 μ LlO μ mol/LPaVF, 0. 5 μ L 10 μ mol/L PaVR, 1 μ L 模板(PaV-LD 基因组DNA)，0. 5 μ L Taq聚合酶(BestBio公司产品)，加水至25 μ L总体积；扩增程序为 94°C预变性 5min，94°C变性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 1. 0min，32 个循环；72°C再延 伸 IOmin0PCR产物经1 %的(质量体积比)琼脂糖胶电泳，用DNA凝胶回收试剂盒 (MBIFermentas公司产品)回收，连接到PMD18-T载体(TaKaRa公司产品)，并转化DH5 α 感受态细胞(TaKaRa公司产品)，筛选获得含NblA全长的质粒pT_NblA。表达载体pET32a (Invitrogen公司产品)和质粒pT_NblA分别经KpnI和XhoI双 酶切后，进行(质量/体积)琼脂糖胶电泳，切胶回收NblA基因片段和载体片段。表 达载体pET32a(Invitrogen公司产品)和NblA基因片段按1 5的比例连接，产物转化 E. coli BL21(DE3)感受态细胞(Invitrogen公司产品)，在含100mg/L氨苄青霉素的LB平 板上培养16小时，挑选出阳性克隆并测序验证。2.表达载体pET-NblA的诱导表达将测序鉴定读框正确的阳性克隆接种于5ml含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培 养基中，37°C振荡培养到0D_约为0. 6时加入IPTG(苯甲基磺酰氟)至终浓度0. Immol/ L，37°C诱导4小时。离心(12000转/分，4°C，IOmin)，取诱导后的菌体细胞，加入50 μ L高 压灭菌(121°C，30min)的蒸馏水，再加入等体积的上样缓冲液(1. OM Tris (pH6. 8)，50%甘 油，10% SDS，β-巯基乙醇，溴酚蓝)，100°C加热变性5分钟。离心(12000转/分，4°C， IOmin)，取上清进行SDS-PAGE电泳检测。结果表明，成功构建了降解蓝藻藻胆蛋白体光捕复合物基因(NblA)的原核高效 稳定表达系统pET-NblA，并表达获得相应的表达产物(分子量大小约23. 9KDa)，见图2。
权利要求
一种分离的烈性噬藻体PaV LD全基因，其序列为SEQID NO1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的一种分离的烈性噬藻体PaV-LD全基因在蓝藻水华控制中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种烈性噬藻体PaV-LD基因组及制备方法和应用，其步骤A、噬藻体的培养烈性噬藻体PaV-LD接种感染指数生长期的浮丝藻，感染裂解后，获取噬藻体PaV-LD裂解的藻液；B、噬藻体纯化噬藻体PaV-LD裂解的藻液离心去细胞碎片，加核酸酶至其终浓度，室温放置，备用；C、基因组DNA提取取上述噬藻体PaV-LD悬液，加入蛋白酶K，混匀，离心，室温下晾干；将晾干好的噬藻体PaV-LD基因组DNA溶于TE缓冲液中，保存备用；D、PaV-LD全基因组序列的测定拼接后获得SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。一种分离的烈性噬藻体PaV-LD全基因组在蓝藻水华控制中的应用。制备噬藻体PaV-LD基因组核酸可程序化操作，烈性噬藻体PaV-LD溶藻功能基因产物的大量表达，批量生产。
文档编号C12N15/10GK101899450SQ201010162329
公开日2010年12月1日 申请日期2010年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者张奇亚, 高恶斌 申请人:中国科学院水生生物研究所