专利名称：蜜蜂囊状幼虫病pcr及荧光pcr快速检测方法
技术领域：
本发明属于生物领域。
背景技术：
囊状幼虫病(sacbrood disease)简称囊幼病，又叫尖头病、囊雏病，是由囊状幼虫 病毒(sacbrood bee virus, SBV)引起的蜜蜂幼虫肠道传染病，也是中蜂的主要病害之一。 在养蜂生产上时有发生，发病轻时，出现近百只幼虫死亡，工蜂采集活动正常；发病严重时， 蜂群只见幼虫增多却不见成蜂增加，造成大批幼虫死亡，工蜂表现不安，采集力明显下降， 甚至整群飞逃，给蜂农造成严重损失。蜜蜂囊幼病最早在1913年发现，但直到1964年才证实其病原体为囊状幼虫病毒 [9]，1971年，囊幼病在广东省佛R、从化、增城等地发生。第二年开始流行，并迅速蔓延至全 国乃至东南亚，尤其在东南亚一带几乎形成毁灭性的灾害。囊幼病多流行于夏秋高温季节， 其危害大，传染快，蜂群患病后轻者影响蜂群的繁殖和采集，重者会造成全场蜂群覆灭[1°]。 SBV主要感染幼虫使其致病死亡。一般在1 2日龄小幼虫阶段侵入，在5 6日龄大幼虫 阶段出现明显的症状，也可在成蜂体内繁殖，但不表现出症状。SBV—般在1 2日龄小幼虫 阶段侵入，在中肠细胞、脂肪细胞、王浆腺细胞和气管等组织中大量增殖，被害幼虫无法化 蛹，一般都在幼虫封盖前后表现症状，感染幼虫失去光泽，然后软塌下陷，贴于巢房下半部， 头部离开巢房壁翘起，形成钩状幼虫，虫体由苍白色逐渐变为淡褐色，由于虫体后部皮下渗 出液增多，用镊子夹出呈现典型的囊状[11]。幼虫通常在5 6日龄时死亡，发病高峰期患 病幼虫约有1/3死于封盖前，2/3死于封盖后[12]。发病初期出现“花子”，接着即可在脾面 上出现“尖头”，幼虫头部离开巢房壁翘起，形成钩状幼虫，体色由珍珠白变黄，继而变褐、黑 褐色。抽出后虫体呈现典型的囊状袋。封盖的病虫房盖下陷，工蜂将房盖咬一小孔或启开 拖出巢房，未被拖出的死幼虫，体色由淡褐色变为深褐色或黑色，后期呈一干片，似龙船状。 病死虫体干后不翘，无臭，无粘性，易清除。SBV是类小核糖核酸病毒(picornavirus)，属于正链RNA病毒，病毒粒子直径 28nm，无囊膜，圆形。基因组RNA碱基组成G+C含量37%到39%，对酸敏感。包含3种结构 蛋白，25、28和31. 5kDa，此外还有一个小的VP4样蛋白尚未见详细报道，SBV是蜜蜂病毒中 第一个完成全基因组测序的病毒，基因组RNA全长8832核苷酸，稍长于典型的哺乳动物微 小RNA病毒(大约7500核苷酸)，包含一个单独的开放阅读框(179到8752核苷酸)编码 2858氨基酸的蛋白。5'末端有结构基因，3'末端有非结构基因。SBV对外界不良环境的 抵抗力不强，在59°C热水中只能生存10分钟，室温干燥情况下可以存活3星期，在病虫尸 体可以存活1个月，如果病虫尸体腐败只能存活7 10天。据资料报道，在蜂粮中可存活 100 120天，残留在巢房壁上的病毒夏季能存活80 90天，冬天则可存活90 100天。 阳光直射4 7小时可以杀死。蜜蜂囊幼病的防治重在如何及早发现病毒的感染。在蜂群内有明显的感染症状 时，已经对蜂群产生了很大的危害，随后的防治措施也难以避免业已造成的巨大损失。在病毒的检测方面，传统的病毒离子的分离和形态观测需要繁琐的步骤和较高的试验条件。随 着分子生物学的发展，使得利用生物技术进行囊状病毒的检测成为可能。到目前为止，对囊 状幼虫病病毒的实验室诊断还主要基于电子显微镜的观察，以及传统的检测方法如琼脂扩 散试验、放射性免疫测定、ELISA等免疫学方法，这些方法的敏感性和特异性较低，无法避免 假阳性反应。
发明内容
本发明目的是建立PCR检测方法，为蜜蜂囊状幼虫病诊断、防治、检疫以及蜂产品 病原污染检测提供快速、准确、简便的蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法。本发明步骤是a、首先采集成蜂标本和幼虫标本；b、引物设计与合成蜜蜂囊状幼虫病PCR检测用引物SBVl 5' -ACC AAC CGA TTC CTC AGT AG-3'SBV2 5' -CCT TGG AAC TCT GCT GTG TA-3'蜜蜂囊状幼虫病实时荧光PCR检测用Taqman探针及引物SBV311F 5’ -AAGTTGGAGGCGCGTAATTG-3’SBV380R 5’ -AAATGTCTTCTTACTAGAGGTAAGGATTG-3，SBV331T 5’ -FAM-CGGAGTGGAAAGATTATCTACAATCCTTACCTCTA-TAMRA-3’c、(1)取单只蜜蜂，用PBS溶液清洗多次，尽可能弃去多余PBS，加入500μ L Trizol试剂，用研磨器尽可能研磨，再加入500 μ L Trizol试剂，快速混勻，室温静置 IOmin ；(2)加入200 μ L氯仿，将盖子盖紧，用手剧烈振荡15s，室温静置IOmin ；(3) 40C 12000g离心15min，取上清液加等体积的异丙醇，颠倒混勻液体，室温静 置 IOmin ；(4) 40C 12000g离心15min，弃去上清，用ImL 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡混勻， 4°C，12000g 离心 IOmin ；(5)弃去上清，在超净工作台上干燥IOmin ；用20 μ L DEPC水溶解RNA沉淀，由于 RNA易降解，故本试验每次将所提的RNA立即进行反转录，防止降解；d、将提取的病毒基因组RNA 10 μ L，通用引物2 μ L，离心混勻后煮沸变性lOmin， 立即冰浴5min，以消除RNA的二级结构；各组分混勻，65°C作用10min，42°C反应90min，最 后99°C 5min,4°C 5min以灭活反转录酶，整个过程完成后即可进行PCR。本发明为我国蜜蜂囊幼病诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准 确、简便的检测方法，为有效控制囊幼病的传播、降低蜂蜜中药物残留、提高蜂产品质量提 供技术保障。
图1是本发明SBV PCR扩增结果；图2是本发明SBV PCR特异性检测结果；
图3是本发明PCR敏感性检测结果；图4是本发明特异性试验结果；图5是本发明荧光PCR敏感性试验。
具体实施例方式本发明的步骤是a、首先采集成蜂标本和幼虫标本；b、引物设计与合成蜜蜂囊状幼虫病PCR检测用引物SBV1 5， -ACC AAC CGA TTC CTC AGT AG-3，SBV2 5' -CCT TGG AAC TCT GCT GTG TA-3'蜜蜂囊状幼虫病实时荧光PCR检测用Taqman探针及引物SBV311F 5’ -AAGTTGGAGGCGCGTAATTG-3，SBV380R 5， AAATGTCTTCTTACTAGAGGTAAGGATTG-3，SBV331T 5’ -FAM-CGGAGTGGAAAGATTATCTACAATCCTTACCTCTA-TAMRA-3’c、(1)取单只蜜蜂，用PBS溶液清洗多次，尽可能弃去多余PBS，加入500μ L Trizol试剂，用研磨器尽可能研磨，再加入500 μ L Trizol试剂，快速混勻，室温静置 IOmin ；(2)加入200 μ L氯仿，将盖子盖紧，用手剧烈振荡15s，室温静置IOmin ；(3) 40C 12000g离心15min，取上清液加等体积的异丙醇，颠倒混勻液体，室温静 置 IOmin ；(4) 40C 12000g离心15min，弃去上清，用ImL 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡混勻， 4°C，12000g 离心 IOmin ；(5)弃去上清，在超净工作台上干燥IOmin ；用20 μ L DEPC水溶解RNA沉淀，由于 RNA易降解，故本试验每次将所提的RNA立即进行反转录，防止降解；d、将提取的病毒基因组RNA 10 μ L，通用引物2 μ L，离心混勻后煮沸变性lOmin， 立即冰浴5min，以消除RNA的二级结构；各组分混勻，65°C作用10min，42°C反应90min，最 后99°C 5min,4°C 5min以灭活反转录酶，整个过程完成后即可进行PCR。材料1.病料蜜蜂病料来自2005年以来对吉林省不同地区40个蜂场的蜜蜂及蜂产品检疫样 品；中国农业科学院蜜蜂研究所病料37份；福建农林大学蜂学院蜜蜂病料20份；包括的蜂 种有意大利蜜蜂，高加索蜜蜂，浙江浆蜂，中华蜜蜂。蜜蜂囊状幼虫病病料、蜜蜂急性麻痹病病料、蜜蜂慢性麻痹病病料、残翼病病料、 黑蜂王台病病料、美洲幼虫腐臭病病料、欧洲幼虫腐臭病病料、患白垩病蜜蜂幼虫病料由中 国农科院蜂病研究所和福建农林大学蜂学院提供。2.试齐[JTaqHS DNA 聚合酶、dNTP(各 2. 5mmol/L) UOXbuffer 缓冲液、6XLoading buffer, IOObp DNA Ladder Marker等购自宝生物工程(大连)有限公司，PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。TRIzol试剂盒GIBC0BRL公司产品；One Step RNA PCR(AMV)试剂盒购自大连宝 生物工程有限公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)等购自大连宝生物工程有限公司；DEPC水配制与器皿处理配制0. 的DEPC水溶液，37°C磁力搅拌24h。取出适 量高压，用高压后DEPC水配制成75%的酒精，剩余分装以备RT-PCR和提取RNA使用。用未 高压DEPC水处理离心管和枪头，将离心管和枪头在未高压处理的DEPC水中浸泡过夜，晾干 后高压除去DEPC。3.实验仪器高速冷冻离心机(SIGMA 3K30，德国西格马公司)，核酸蛋白分析仪(Gene Spec V, Hitachi NaKa instruments Co. , Ltd. B^), PCRifiIft (Biometra Tgradient-96, ΙΗ Biometra 公司)，荧光定量 PCR 扩增仪(ABI Sequence Detection system 7000)，电泳仪 (SAVANT PS500A美国)，凝胶成像系统(Kodak EDAS290，美国柯达公司)，生化恒温培养箱， 微量移液器(0. 1 1000 μ 1 BIOHIT芬兰)、恒温水浴锅等。方法1.病料的采集和处理病料的采集和保存按如下步骤进行①成蜂标本的采集和保存对患成年蜂病的蜂群可取蜂群内巢脾上或蜂箱底部带 有典型病状的蜜蜂及在蜂箱前面爬行的垂死蜜蜂和死亡蜜蜂20 30只。装入密封袋内， 作好记录和标记，注意不要用酒精浸泡，尽快转移到液氮中保存。②幼虫标本的采集和保存第一，割取一小块有病虫或死虫的巢脾，装入密封袋 内。第二，挑取单个幼虫若干只装入已消毒的冻存管内，尽快转移到液氮中保存。注意，凡 是供作微生物检验的标本，均不能加任何防腐剂，也不能用化学剂处理。2.引物设计与合成2. 1蜜蜂囊状幼虫病PCR检测用引物的设计与合成根据Genebank网站公布的蜜蜂囊状幼虫病病毒全基因组核苷酸序列 (GeneBankAF092924)，设计引物SBV1和SBV2由大连TaKaRa宝生物工程有限公司合成，理论 扩增片段大小为487bp，其引物序列见表1-1。表1-1蜜蜂囊状幼虫病病毒PCR引物Tab 1—1 The primers ofPCR for SBV
NamePrimerSizeSBV1 SBV25'-ACC AAC CGA TTC CTC AGT AG-3 ’ 5’-CCT TGG AAC TCT GCT GTG TA-3’487 bp2. 2蜜蜂囊状幼虫病实时荧光PCR检测用Taqman探针及引物的设计与合成根据Genebank网站公布的蜜蜂囊状幼虫病病毒病毒核苷酸序列(GeneBank AF092924)，应用DNAman软件设计出一对引物SBV311F、SBV380R及探针SBV331T。核酸探针 SBV331T两端用荧光染料修饰，5’端报告荧光为-FAM(6-Carboxyf luoresciein)，在518nm 处有最大的吸光值；3，端淬灭荧光为-TAMRA(6-Carboxytetramethylrhodamine)，在 582nm
6处有最大吸光值，由TakaRa宝生物工程(大连)有限公司合成，引物及探针序列见表l_2t表1-2蜜蜂囊状幼虫病病毒实时定量荧光PCR引物及探针
权利要求
一种蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法，其特征在于a、首先采集成蜂标本和幼虫标本；b、引物设计与合成蜜蜂囊状幼虫病PCR检测用引物SBV15’ ACC AAC CGATTC CTC AGTAG 3’SBV25’ CCT TGGAAC TCT GCT GTG TA 3’蜜蜂囊状幼虫病实时荧光PCR检测用Taqman探针及引物SBV311F5’ AAGTTGGAGGCGCGTAATTG 3’SBV380R5’ AAATGTCTTCTTACTAGAGGTAAGGATTG 3’SBV331T5’ FAM CGGAGTGGAAAGATTATCTACAATCCTTACCTCTA TAMRA 3’；c、(1)取单只蜜蜂，用PBS溶液清洗多次，尽可能弃去多余PBS，加入500μL Trizol试剂，用研磨器尽可能研磨，再加入500μL Trizol试剂，快速混匀，室温静置10min；(2)加入200μL氯仿，将盖子盖紧，用手剧烈振荡15s，室温静置10min；(3)4℃12000g离心15min，取上清液加等体积的异丙醇，颠倒混匀液体，室温静置10min；(4)4℃12000g离心15min，弃去上清，用1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，振荡混匀，4℃，12000g离心10min；(5)弃去上清，在超净工作台上干燥10min；用20μL DEPC水溶解RNA沉淀，由于RNA易降解，故本试验每次将所提的RNA立即进行反转录，防止降解；d、将提取的病毒基因组RNA 10μL，通用引物2μL，离心混匀后煮沸变性10min，立即冰浴5min，以消除RNA的二级结构；各组分混匀，65℃作用10min，42℃反应90min，最后99℃5min，4℃5min以灭活反转录酶，整个过程完成后即可进行PCR。
全文摘要
一种蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法，属于生物领域。本发明目的是建立PCR检测方法，为蜜蜂囊状幼虫病诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的蜜蜂囊状幼虫病PCR及荧光PCR快速检测方法。设计与合成蜜蜂囊状幼虫病PCR检测用引物、蜜蜂囊状幼虫病实时荧光PCR检测用Taqman探针及引物。本发明为我国蜜蜂囊幼病诊断、防治、检疫以及蜂产品病原污染检测提供快速、准确、简便的检测方法，为有效控制囊幼病的传播、降低蜂蜜中药物残留、提高蜂产品质量提供技术保障。
文档编号C12Q1/70GK101956020SQ201010163488
公开日2011年1月26日 申请日期2010年4月30日 优先权日2010年4月30日
发明者刘和平, 刘金华, 宋战昀, 王振国, 石建平, 罗雁非, 肖成蕊, 魏春艳 申请人:中华人民共和国吉林出入境检验检疫局