专利名称：一种简单快速适用于细菌pcr检测样品的前处理方法
技术领域：
本发明涉及对细菌的PCR检测，尤其适用于PCR检测的前处理，其方法既简便又快速。
背景技术：
随着分子生物学的发展，PCR方法被用于临床检测与传统的微生物形态学、生化反应和血清学方法的鉴定相比，其方法简单快速、特异、敏感，在合适的条件下，往往几个菌就能被检测出来。但在实际应用中由于临床样品中含有大量抑制PCR反应的复杂成分，限制了其方法普遍应用。一般的检测程序通常大多是首先采用感染样品进行增菌培养，然后划板分离得到纯化菌再培养后进行初步鉴定，其中包括形态学比如菌落形态、染色等鉴定，有时还需要生化和血清学鉴定相配合，步骤繁琐，费时费力，从而大大限制了后续的PCR检测的实际应用。目前也有研究报道，有途径拓展PCR的应用问题。例如中国农业大学食品科学与营养工程学院许文涛等在2009年17 (4)的《农业生物技术学报》发表的题为《稻种PCR抑制因子的3种去除方法》论文中披露了 3种去除这些抑制物质的方法，即DNA样品稀释法， 硅膜纯化基因组法和低熔点琼脂糖纯化法；其中DNA样品稀释法去除抑制因子最简便快捷等。另外还有北京军事医学院疾病预防控制所传染病控制中心赵红庆等在2007年18(5) 《生物技术通讯》发表的题为《多重PCR技术在病原检测中的应用》综述了多重PCR在细菌病原体的检测，病毒病原体的检测，支原体衣原体及寄生虫的检测，微生物耐药性检测等方面的应用。又如在样本检测中，采用试剂盒能够从粪便标本中提取DNA并有效去除抑制物， 如天根公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit，该试剂盒使用硅胶膜技术，可以从新鲜或冷冻人粪便及其他带有高浓度PCR抑制物的样品中纯化DNA。但毕竟需要购买试剂盒，使成本大大增加，从而也限制了 PCR检测的实际应用。尤其外对粪便样本的处理方法较多，有浮力密度离心过滤法、两步过滤法、核酸吸附矩阵法、金属氢氧化物吸附法、酚抽提法等，都是相对比较繁琐的处理方法。另山东省农科院奶牛研究中心马广强等人在2006年22期0)153 页《中国人兽共患病杂志》发表的“直接从粪便中检测致牛犊腹泻产肠毒素大肠杆菌的双重 PCR方法的建立与应用》披露依据肠毒素大肠杆菌产生的毒素基因序列，设计了两种引物， 建立多重PCR方法。本发明与此对照，目的都是去除抑制物，但是盲菌培养与针对引物的扩菌培养有独到之处。简单快速的前处理方法，可有效的去除标本中的PCR抑制物，消除临床标本对PCR反应的抑制作用，避免假阴性结果出现。将为拓展PCR检测的应用，产生了极强的实用效果。
发明内容
本发明的目的在于提供适用于PCR检测的样品的前处理方法，即简单又易行，能使PCR检测方法在临床样品的应用中既简便又快速，拓展其方法的实用价值。本发明的目的是这样实现的一种简单快速适用于细菌PCR检测样品的前处理方法，在无菌操作下取需量的病变组织、分泌物或粪便的临床样本，接种于增菌培养液中，在 37°C下恒温培养12-16小时；无菌条件下取需量的培养液，再次接种于同种增菌液中，振荡培养4-6小时；取l-2ml菌液离心，转速为5000转/min，5-6分钟得到菌体沉淀；用双蒸水洗涤菌体2-3遍后，加入IOOul无菌双蒸水悬浮，在100°C下煮沸约10-12分钟，离心，转速为12000转/min，3-4分钟得上清液，即为菌粗制DNA，再进行后续的PCR分型检测即可。所述的PCR检测的前处理方法，实验检测中作为阳性对照的标准(或参考)菌株均购自中国菌种保藏中心。所述的PCR检测的前处理方法，选用的实验材料均为市售产品。本发明构思的样本的前处理方法关键是使待检细菌模板拷贝数进一步增加的同时去除了临床样本增菌培养时带入的影响后续PCR反应的抑制成分。但由于样品中PCR抑制物的存在，必须摸索DNA浓度在相对的稀释度内方能检测的条件，避免样本中抑制物干扰的不确定性及假阴性的结果产生。本方法通过无菌操作取少许临床样本在增菌培养液中预培养细菌，达到增菌的目的，然后取少许培养后的增菌液进行再一次接种以重复培养，达到富集细菌同时去除样本中其他成分的目的。最后按常规操作收集菌体，进行后续的PCR检测，结果表明，得到的菌体DNA足以达到PCR扩增要求，即获得扩增结果，从而达到检测的目的。本发明将该方法直接应用临床标本，包括组织、血液、分泌物及其粪便标本等，其中粪便标本中含有能够抑制PCR扩增的多种成分，是临床标本中最难提取核酸及扩增的标本。对于粪便样本来说，如何去除粪便中PCR反应的抑制物是有效的制备DNA模板最关键的一步。该发明无论是理论分析和实验证明，这种临床样本处理方法可以大大提高临床样本用于PCR检测的特异性和敏感性，避免了假阴性的结果，同时对于早期感染或隐性携带者的活体检测也将很有帮助。本发明方法成功的解决了 PCR检测前处理的繁琐、时间长的限制瓶颈，通过对样品病原菌的富集，大量核酸的获取，PCR抑制物的去除，使其后续PCR检测的特异性和敏感性增加，彰显技术进步。
下面将结合附图对发明作进一步说明。附图1-1巴氏杆菌不同型标准株的多重PCR扩增产物的凝胶电泳分析参照图，从左至右l、DL2000，2-4依次为巴氏杆菌标准株A、B、E型，5为阴性对照。附图1-2病死牛不同组织样品经前处理后的多重PCR产物的凝胶电泳分析图，多重PCR检测结果从左至右1、DL2000, 2、巴氏杆菌标准株A型标准株阳性对照，3_5依次为肺、肝、脾，6、阴性对照。附图2-1产气荚膜梭菌不同型标准株多重PCR扩增产物的凝胶电泳分析参照图， 从左至右1、DL2000，2-4依次为产气荚膜梭菌标准株A、B、C、D型，5为阴性对照。附图2-2病死羊不同组织样品经前处理后的多重PCR产物的凝胶电泳分析图，多重PCR检测结果从左至右1、DL2000，2、产气荚膜梭菌标准株D株阳性对照，3-7依次为肺、 肝、脾、肠内膜、粪便，8、阴性对照。
具体实施例方式实施例细菌PCR检测样品的前处理方法，应用于巴氏杆菌感染样品及产气荚膜梭菌感染样品的检测一、巴氏杆菌感染样品的多重PCR检测；取羊肺炎病料包括肺、肝和脾组织；无菌操作将少许病变组织(肺、肝、脾)各接种于含TSB (大豆胰蛋白胨)培养液中，37°C恒温培养，12小时；无菌操作用接种环蘸取少许培养液接入到TSB培养液中，37°C振荡培养证；取 Iml 菌液，离心 5000 转 /min, 5min ；弃上清保留菌沉淀，用无菌双蒸水洗2遍；加入IOOul无菌双蒸水悬浮。100°C煮沸约10分钟左右；离心12000转/min，3min,上清为菌粗制DNA。PCR分型检测包括PCR反应液，巴氏杆菌血清型A、B、E三对特异引物组合，菌DNA 模板的制备；其中巴氏杆菌的反应的退火温度为55°C ；扩增体系为10倍buffer(含 Mg2+)5. 0ul,dNTP 1. 5ul (10mmol/l)，3 对特异上下游引物各 1. Oul (10umol/l)，Taq DNA 聚合酶2. 5U，模板10ul，用双蒸水补足至50ul ；PCR扩增反应条件为95°C 5分钟预变性；然后94°C 30秒，550C 30秒，72°C 45秒，共30个循环后再72°C 10分钟延伸；其中巴氏杆菌PCR产物的凝胶电泳分析扩增产物电泳后，3个标准菌株的核酸样品均可扩增出与试验设计大小相符目的条带；C403-A株(巴氏杆菌A型)样品扩增出了 1044bp和460bp两条带，C405-B株(巴氏杆菌B型)扩增出了 760bp和460bp两条带， C393-E株(巴氏杆菌E型)扩增出了 5 Ilbp和460bp两条带，图1_1为巴氏杆菌A\B\E三株标准菌株的PCR电泳结果作为参照。图1-2为羊肺炎临床组织样品经过前处理后PCR检测结果，根据扩增片段大小确定有巴氏杆菌A型感染。二、产气荚膜梭菌感染样品检测；取羊羔猝死剖检样品，包括肝、脾、肺、肠和粪便；无菌操作，将样品分别接种于厌气肝汤中，37°C恒温厌氧培养，12小时；无菌操作用接种环蘸取少许培养液接入到厌气肝汤中，37°C恒温厌氧培养，12 小时；取 Iml 菌液，离心 5000 转 /min, 5min ；弃上清保留菌沉淀，用无菌双蒸水洗2遍；加入IOOul无菌双蒸水悬浮。100°C煮沸约10分钟左右；离心12000转/min，3min,上清为粗制菌DNA。PCR分型检测包括PCR反应液，巴氏杆菌血清型A、B、E三对特异引物组合，菌DNA 模板制备；其中巴氏杆菌的反应的退火温度为55°C ；扩增体系为10倍buffer(含 Mg2+)5. Oul,dNTP 1. 5ul (10mmol/l)，3 对特异上下游引物各 1. Oul (10umol/l)，Taq DNA 聚合酶2. 5U，模板10ul，用双蒸水补足至50ul ；PCR扩增反应条件为95°C 5分钟预变性；然后94°C 30秒，550C 30秒，72°C 45秒，共30个循环后再72°C 10分钟延伸；
其中巴氏杆菌PCR产物的凝胶电泳分析扩增产物电泳后，3个标准菌株的核酸样品均可扩增出与试验设计大小相符目的条带；C403-A株(巴氏杆菌A型)样品扩增出了 1044bp和460bp两条带，C405-B株(巴氏杆菌B型)扩增出了 760bp和460bp两条带， C393-E株(巴氏杆菌E型)扩增出了 5 Ilbp和460bp两条带，图2_1为巴氏杆菌A\B\E三株标准菌株的PCR电泳结果作为参照。图2-2为临床组织样品经过前处理后PCR检测结果， 根据扩增片段大小确定有巴氏杆菌A型感染。 以上检测中所用作为阳性对照的标准菌株均购自中国菌种保藏中心。
权利要求
1.一种简单快速适用于细菌PCR检测样品的前处理方法，其特征在于在无菌操作下取需量的病变组织、分泌物或粪便的临床样本，接种于增菌培养液中，在37°C下恒温培养 12-16小时；无菌条件下取需量的培养液，再次接种于同种增菌液中，振荡培养4-6小时；取 l-2ml菌液离心，转速为5000转/min，5-6分钟得到菌体沉淀；用双蒸水洗涤菌体2_3遍后， 加入IOOul无菌双蒸水悬浮，在100°C下煮沸约10-12分钟，离心，转速为12000转/min，3-4 分钟得上清液，即为菌粗制DNA，再进行后续的PCR分型检测即可。
2.按照权利要求1所述的PCR检测的前处理方法，其特征在于实验检测中作为阳性对照的标准(或参考)菌株均购自中国菌种保藏中心。
3.按照权利要求1所述的PCR检测的前处理方法，其特征在于选用的实验材料均为市售产品。
全文摘要
本发明提供的一种简单快速适用于细菌PCR检测样品的前处理方法，在无菌操作下取需量的病变组织、分泌物或粪便的临床样本，接种于增菌培养液中，在37℃下恒温培养12-16小时；无菌条件下取需量的培养液，再次接种于同种增菌液中，振荡培养4-6小时；取1-2ml菌液离心，转速为5000转/min，5-6分钟得到菌体沉淀；用双蒸水洗涤菌体2-3遍后，加入100ul无菌双蒸水悬浮，在100℃下煮沸约10-12分钟，离心，转速为12000转/min，3-4分钟得上清液，即为菌粗制DNA，再进行后续的PCR分型检测即可。实验检测中作为阳性对照的标准(或参考)菌株均购自中国菌种保藏中心。
文档编号C12Q1/04GK102242185SQ201010171590
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者李建军, 杨学云, 段新华, 王志才, 王登峰 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院