专利名称：博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶的原核表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种高效表达博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶蛋白(FDH)的原核表达载体pET28a-FDH及其在FDH蛋白的原核表达和制备FDH重组蛋白中的应用。
背景技术：
甲酸脱氢酶(FDH，EC 1. 2. 1. 2)在有生命的生物体中广泛分布，FDH催化甲酸氧化成二氧化碳并在此过程中还原NAD+成NADH。甲酸脱氢酶(FDH)是广泛存在于甲基营养型细菌，酵母以及高等植物和动物中的一个酶家族。根据其四级结构、辅基的存在和类型以及底物特异性，分为几种不同的类型。其中一类是NAD+依赖的甲酸脱氢酶，催化甲酸离子氧化成二氧化碳，在NAD+的耦联反应中形成NADH。该类型的甲酸脱氢酶由两个相同的亚基组成，不含金属离子和辅基，对甲酸和NAD+具有高度的专一性。由于FDH反应的不可逆性以及能适应较宽的pH条件，这种酶在最适pH下对许多工序是一种多用途的高效生物催化剂，因此甲酸脱氢酶具有相当大的生物技术应用潜力。 FDH可用于在有机合成中发展NAD+再生系统，用来生产高附加值产品。德固赛公司(德国) 最近开始使用商业技术制造叔丁基-L-亮氨酸，用FDH作为NADH再生的催化剂，这在药物化学中是一个最大的酶法工艺。来源于耐热微生物的FDH有较好的耐热性能，因此具有很好的工业应用价值。微生物甲酸脱氢酶的研究特别受重视，其中研究最多的是甲基营养型细菌和酵母FDH的特性、结构和催化机制等。近年来，甲酸脱氢酶在辅酶再生中的应用已成为辅酶酶法再生研究领域的热点之一。它主要应用于辅酶NADH的酶耦联法再生系统中，所谓的酶耦联就是利用2个平行的氧化还原反应酶系统，1个酶催化底物转化，另1个酶则催化辅酶NADH循环再生。甲酸/甲酸脱氢酶体系是最成功的再生系统，它具有诸多优点(1) FDH容易得到，且适宜的pH范围宽， 易于实现再生反应与合成反应的有效耦合；(2)甲酸是最廉价的氢源之一；(3)甲酸在FDH 作用下转化为二氧化碳，可直接从产物中分离出去，使反应接近于不可逆过程；(4)甲酸的存在并不会影响体系中另一氧化还原酶的活性。甲酸脱氢酶在工业NADH再生中的应用已在酵母和细菌中被广泛研究。此外，甲酸脱氢酶还有相当大的农学应用潜力。例如，FDH可用作诊断酶在溶液和生理体液中用于测定甲酸和草酸的含量。在研究多种胁迫条件对FDH的影响时，可产生一些抗胁迫植株，如抗旱和抗冻等，这在农业生产上具有很大的应用价值。博伊丁假丝酵母是一种甲基营养型酵母菌，能以甲醇为碳源生长，FDH催化甲醇氧化途径的最后一步反应，在博伊丁假丝酵母的甲基营养生长中起很重的作用，来自博伊丁假丝酵母FDH是个由两个性质完全相同的亚基构成的二聚体，每个亚基由364个氨基酸构成，都有各自的活性中心。与其他生物的FDH相比，博伊丁假丝酵母FDH具有较高的活性 (6U/mg蛋白)，对NAD和甲酸也具有较高的亲和性(NAD的Km值为0. 04mM,甲酸的Km值为2. 4mM)，对热稳定性也比较好(Labrou 和 Rigden, Biochem. J. 2001，354 :455_463)，因此该
酶可能具有较好的应用前景。用较低的成本和简便 的方法快速生产并纯化有活性的FDH蛋白是满足其工业应用的必需条件，而FDH蛋白特异性抗体是检测植物中FDH蛋白表达水平的有效工具。但现有研究中还未有制备博伊丁假丝酵母FDH的抗体报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种FDH的原核表达载体(pET28a_FDH)，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点和FDH基因及一个组氨酸标签，利用该载体转化大肠杆菌(BL21)，可实现FDH蛋白的高水平表达。表达的重组蛋白质40%为可溶性蛋白，用亲和层析很容易从大肠杆菌可溶性总蛋白中纯化出高纯度的重组FDH蛋白质，用于FDH酶制剂的生产以及生化特性分析。其余60%以包涵体形式存在，用高浓度的尿素溶解包涵体后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离FDH蛋白，再从凝胶中回收FDH蛋白可得到纯度极高的FDH蛋白，用于抗体的制备。FDH重组蛋白表达量很高，因此不需要大规模培养细菌，纯化FDH蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案FDH的原核表达载体pET28a_FDH，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点和FDH基因及一个组氨酸标签。所述的原核表达载体，其中甲酸脱氢酶基因FDH来源于博伊丁假丝酵母，在 GenBank中的登录号为DQ458777。所述的原核表达载体，其中FDH基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点 RBS, T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠FDH基因的起始密码子上游还有一个组氨酸标签序列。所述的原核表达载体，由下述方法构建而得(1)从GenBank中查找博伊丁假丝酵母FDH的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物FDH5 :5， -CATATGAAGATCGTTTTAGTCTTAT-3’FDH3 :5， -CTCGAGTTTCTTATCGTGTTTACCGTAAG-3‘5，端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位点；3，端引物末端加Xho I酶切位点。以Candida boidinii的基因组为模版扩增，得到FDH的全长DNA序列；(2)回收并纯化FDH全长基因片段，并将其连接到pMDlS-Τ载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-FDH ；(3)构建原核载体pET28a-FDH，用NdeI和XhoI双酶切pMD-FDH和pET28a，并回收纯化FDH基因片段以及载体片段pET28a，然后连接、转化、抽提质粒进行酶切检测，获得原核表达载体pET28a-FDH。所述的原核表达载体的制备方法，包括下述步骤(1)从GenBank中查找博伊丁假丝酵母FDH的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物FDH5 :5， -CATATGAAGATCGTTTTAGTCTTAT-3’
FDH3 :5， ~CTCGAGTTTCTTATCGTGTTTACCGTAAG~3‘5，端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位点；3，端引物末端加Xho I酶切位点。以Candida boidinii的基因组为模版扩增，得到FDH的全长DNA序列； (2)回收并纯化FDH全长基因片段，并将其连接到pMD18_T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-FDH ；(3)构建原核载体pET28a_FDH，用NdeI和XhoI双酶切pMD-FDH和pET28a，并回收纯化FDH基因片段以及载体片段pET28a，然后连接、转化、抽提质粒进行酶切检测，获得原核表达载体pET28a-FDH。本发明的原核表达载体在制备重组FDH蛋白中的应用。本发明的原核表达载体在制备FDH特异性抗体的抗原中的应用。应用本发明的原核表达载体制备FDH重组蛋白的方法，本发明的实验结果表明用 0. 5mM IPTG于28°C诱导6小时后可使FDH重组蛋白达到很高的表达量，表达的FDH重组蛋白40%为可溶性蛋白，60%形成包涵体蛋白，各占大肠杆菌总蛋白50%，用亲和层析很容易从大肠杆菌可溶性总蛋白中纯化出高纯度的重组FDH蛋白质，可用于FDH酶制剂的生产以及生化特性分析。60%的重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀中，利用高浓度的尿素溶解后进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)极易纯化FDH重组蛋白，然后割下含有FDH重组蛋白的凝胶，通过透析从凝胶中回收获得纯度很高的FDH重组蛋白，可作为抗原用于FDH特异性抗体的制备，为FDH酶制剂的生产以及生化特性分析、FDH特异性抗体抗原的制备提供一条新途径。
图1、博伊丁假丝酵母菌基因组DNA的检测。M =DNA marker III ； 1-3 基因组DNA。图2、FDH基因的TA克隆策略。图3、FDH基因TA克隆质粒的检测。(A)重组质粒pMD18_FH的电泳检测.M DL2000 ； 1-3 重组质粒pMD18-FDH ；4 正对照(分子量为3. 9kb的质粒DNA)。(B)重组质粒 PMD18-FDH 的单酶切检测· M :DNA marker III ； 1-4 用 Sal I+EcoRI 双酶切的 pMD18_FDH。 (C)重组质粒 pMD18-FDH 的 PCR 检验。M :DL2000 ； 1-4 以 pMD18_FDH 为模版用 FDH5 和 FDH3 引物扩增的PCR产物；5 负对照。图4、FDH基因的原核表达载体构建策略。图5、FDH基因原核表达载体的检测。㈧重组质粒pET28a_FDH的电泳检测。1_7 重组质粒pET28a-FDH ；8 正对照(分子量为6. 6kb的质粒DNA)。(B)重组质粒pET28a_FDH 的单酶切检测。M =DNA marker III ； 1-5 用Pst I酶切的pET28a_FDH ；6 没有酶切的质粒 pET28a-FDH。(C)重组质粒 pET28a_FDH 的双酶切检测。M :DNA marker III ;1_5 用 Pst I+Sph I双酶切的pET28a-FDH ；6 没有酶切的质粒pET28a_FDH。图6、FDH重组蛋白表达条件的优化。(A)O. 2mM IPTG诱导。1 未加IPTG ；2-3 :16°C 诱导 4h、8h ；4-6 :23°C 诱导 2h、4h、6h ；7-9 :30°C 诱导 2h、4h、6h ；M 蛋白 Marker#SM0431 ； 10 :pET28a 空载体。(B)O. 5mM IPTG 诱导。M 蛋白 Marker#SM0431 ；1 未加 IPTG ；2-3 :16°C 诱导 4h、8h ；4-6 :23°C诱导 2h、4h、6h ；7-9 :30°C诱导 2h、4h、6h ；10 :pET28a 空载体。(C) ImM IPTG 诱导。M:蛋白 Marker#SM0431 ；1 未加 IPTG ；2-5 :30°C诱导 2h、4h、6h、8h ；6 :pET28a空载体。图7、可溶性和不溶性FDH重组蛋白的分布(A)及其纯化(B)图8、可溶性FDH重组蛋白的纯化图9、可溶 性FDH重组蛋白的酶活性分析图10、可溶性FDH重组蛋白酶活性的热稳定性分析
具体实施例方式试剂与仪器试剂主要分为分子生物学实验试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯。仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在上海生工合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1 博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)基因组DNA的制备与检测本发明所用的假丝酵母(Candida boidinii)购自中国工业微生物菌种保藏中心， 假丝酵母菌基因组DNA的制备采用CTAB法。取1. 5mL菌液于4°C 4000rpm离心2min，弃尽上清液，收集菌体。加 400 μ 1 2 X CTAB (Tris-HCl ρΗ 7. 5100mM, EDTA20mM, NaCl 1.4M，CTAB 2% )勻浆，65°C保温20min，加500 μ 1氯仿混勻后于室温下13000rpm离心lOmin。转移上清，加50μ 1的10% CTAB，加650 μ 1异丙醇置于室温1小时，4°C 12000rpm离心25min.， 沉淀用500 μ 1 75%酒精洗一次，真空干燥，力卩20 μ 1含有RNase的TE溶解，37°C保温一小时。实施例2 =FDH基因的扩增与TA克隆FDH基因的扩增及TA克隆的策略如图2所示，首选从GenBank中查找FDH的全长基因序列(FDH基因的GenBank登录号为DQ458777)，并设计一对引物，序列如下FDH5 CATATGAAGATCGTTTTAGTCTTATFDH3 CTCGAGTTTCTTATCGTGTTTACCGTAAG5，端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位点；3，端引物末端加Xho I酶切位点。在PCR反应混合液中加入IOng的博伊丁假丝酵母基因组DNA作为模板，同时加 Λ 50ng 的特异性引物 FDH5 和 FDH3U. 8μ IdNTP (IOmM), 2. 5 μ 1 的 ExTaq 反应 Buffer 禾口 0. 15 μ 1的ExTaq (5U/μ 1)聚合酶(大连宝生物公司)，加双蒸水使反应终体积为20 μ 1。 在PCR仪上于94°C加热3分钟，然后按照94°C、45秒，53°C、30秒，72°C、1分钟30秒的程序进行30个循环的反应，最后在72°C延长反应10分钟的程序进行PCR反应扩增得到FDH 基因。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。回收并纯化FDH全长基因 DNA(1.2kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的TA克隆试剂盒亚克隆到pMD18_T (大连宝生物公司)载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合液转化大肠杆菌感受态DH5ci (购自天根生化科技公司)，采用碱裂解法提取质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测其大小(图3A)，选取大小和理论值相符的重组质粒进行酶切检测。用Sal I.EcoR I双酶切重组质粒，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD-FDH有两条带，其中一条较小为1. 2kb左右的FDH基因DNA片段(图，另一条为2. 7kb的载体片断。选取酶切检测正确的重组质粒PMD18-FDH做进一步的PCR检测，用FDH基因上下游特异性引物FDH5和FDH3作PCR，亚克隆成功的重组质粒均能扩增出1. 2kb左右的FDH基因 DNA片段(图3C)，测序分析证明重组质粒载体中插入的FDH全长基因序列正确。再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5 α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒 pMD18-FDH。实施例3 原核表达载体pET28a_FDH的构建pET28a-FDH 的构建策略如图 4 所示，用 Nde I (Fermentas)和 Xho I (Fermentas) 切开纯化的原核表达质粒载体pEI^8a (购自Novagen公司)和pMD18_FDH，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pET28a被切割后产生的载体片断 pET28a(5. 3kb)及pMD18_FDH被切割产生的FDH基因的DNA片断(1. 21Λ)，然后用宝生物 (TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pET28a载体片段和FDH基因的DNA片断产生原核表达载体pET28a-FDH。用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5 α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50yg/ml)的平板上，于37°C 过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒(图5A)，用Pst I (Fermentas)进行酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生一条6. 2kb大小的条带(因为I3St I在FDH基因处有单一识别位点，在pET48a(+)载体没有识别位点，故单酶切质粒应有一个片段)(图5B)。用I^st I、Sph I (Fermentas)进行双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生1. 171Λ和5. 38kb两条带(因为I^st I和Sph I分别只在基因片段和载体上有单一识别位点，故双酶切质粒应有两个片段)(图5C)。将连接成功的质粒载体pET28a_FDH重新转化大肠杆菌DH5 α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pET28a-FDH.实施例4 重组FDH蛋白的表达与表达条件的优化用原核表达载体pET28a_FDH转化大肠杆菌BL21的感受态细胞(天根生化科技)。 挑取单菌落加入2mL LB (含有Km 50mg/L)中，37°C过夜培养(OD6tltl值约为1. 5)。在不同浓度 IPTG(0. 2mM(图 6A)/0. 5mM(图 6B)/lmM(图 6C))、不同时间(ai/4h/6/ i)、不同温度 (160C /230C /300C )诱导后离心收集菌体，去除上清液，用wash buffer(IOmM Tris-Cl, pH7. 5)洗 2 次，加入适量 5 X SDS-PAGE 上样缓冲液(Sample loading buffer)，于 95°C加热 10分钟。冰浴冷却后于4°C离心(12000rpm)10分钟，取上清作SDS-PAGE。根据文献资料和软件分析预测目的蛋白大小为45kDa左右，采用12%分离胶。SDS-PAGE电泳参看《分子克隆实验指南(第三版)》。SDS-PAGE电泳结果(图6)表明用0. 5mM的IPTG于30°C诱导的时间越长，FDH蛋白表达量越高，6小时后FDH蛋白表达量最高，占大肠杆菌总蛋白的50% (图 6B)。实施例5 重组FDH蛋白的纯化用原核表达载体pET28a_FDH转化大肠杆菌BL21的感受态细胞，挑取单菌落入 500mL LB (含有Km 50mg/L)中，37°C培养至0D600值约为0. 6时，加0. 5mM IPTG诱导后6 小时，离心收集菌体，用wash buffer洗2次，加入30ml蛋白抽提缓冲液(磷酸钠缓冲液 (pH7. 4) 20mmol/L)，悬浮菌体。于冰浴上超声波破碎细菌细胞(工作3秒，间歇9秒，功率30W，全程30分钟)。于4°C离心(6000g)30分钟，得到上清和沉淀。取适量上清和沉淀蛋白样品加入适量上样缓冲液作SDS-PAGE，结果说明所表达的重组蛋白质40%为可溶性蛋白， 60%形成包涵体蛋白(图7A)。沉淀用8M尿素(IOml)溶解，加入适量上样缓冲液，跑12% SDS-PAGE，然后用0. 25M KCl于4°C染色30分钟，割出FDH蛋白条带，放入透析袋，加入2ml SDS-PAGE buffer,进行水平电泳4_5小时或过夜，将FDH蛋白从凝胶中洗脱出来，可获得纯度达95%以上的FDH蛋白样品(图7B)，最后在1 XPBS溶液中透析过夜后可作为抗原用于 FDH抗体的制备。上清过0.45um滤膜，用亲和层析柱分离纯化可溶性FDH重组蛋白。参看His-Trap HP说明书，首先用5柱体积纯水洗柱，用5柱平衡缓冲液(磷酸钠缓冲液(pH7. 4) 20mmol/ L，5mM咪唑)平衡柱子，然后上蛋白样品，用5柱体积浓度分别为30、70、500mM的咪唑缓冲液(磷酸钠盐缓冲液20mmol/L，NaClO. 5mmol/L,咪唑)进行梯度洗脱，收集洗脱液，每管 2mL。最后分别用5柱体积纯水和5柱体积20%乙醇洗柱。测定及各洗脱液中蛋白的浓度， 用50ug跑SDS-PAGE检测蛋白的纯度，图8的数据说明FDH重组蛋白在500mM的咪唑缓冲液中被洗脱下来，蛋白质的纯度达90%，加70%硫酸铵沉淀洗脱液中的蛋白质，用磷酸钾缓冲液(磷酸钾缓冲液(PH7. 5) 100mmol/L,DTT lmmol/L，20%甘油)溶解后可用于固定化酶的制备或生化特性分析。实施例6 重组FDH蛋白的酶活性分析由于FDH酶催化的反应伴随着NAD的还原形成NADH，因此可通过测量FDH反应液在340nm吸光度增加的量计算出其酶活。通过Bradford法测定可溶性总蛋白样品和纯化后蛋白样品的浓度，在Iml的反应体系(磷酸钾缓冲液(pH7. 5) 100mmol/L,甲酸钠162mmol/ L，NAD+L 62mmol/L)于40°C温育10分钟后加入200 μ g蛋白启动反应，测定340nm吸光度的增值。一个酶活单位U定义为40°C每分钟还原1 μ mol NAD+为NADH所需的酶量。按公式酶活性(U/mg) = (A/6. 22) X (1/B) X (1/C)计算酶的活性，其中A是Δ A34tlnm，B是反应中可溶性蛋白含量，C是时间，6. 22是每μ mol NADH在340nm处吸光系数。如图9A所示， 未纯化的粗蛋白酶活为0. 12U/mg，而纯化后蛋白酶活达到0. 376U/mg。在30°C、40°C、5(rC、 65°C四个温度下分别测定了 FDH酶蛋白的活力，结果表明(图9B)在40°C左右FDH活性最高，达到0. 376U/mg。FDH在65°C温育IOmin后仍具有77% (0. 289U/mg)的活性，表明重组 FDH是一种适用温度范围较广、耐热性较强的酶蛋白。实施例7 重组FDH蛋白酶活性的热稳定性分析取适量FDH纯化蛋白样品在不同温度(30°C、40°C、5(rC、65°C )下保温不同时间 (0min、10min、20min、40min、IOOmin)后测定其剩余酶活力，结果如图10所示。从图10可以看出，FDH重组蛋白具有较好的热稳定性，在30°C -50°C的环境下都较为稳定，酶活变化不大，在IOOmin保温后仍有接近70%的相对活性。FDH对高温环境(65°C )并不敏感，长时间保温对酶活影响并不大，65°C保温IOOmin后仍然具有51%的相对活性。通过上述的实验，本发明达到了如下的结果利用本发明的原核表达载体 (pET28a-FDH)转化大肠杆菌(BL21)，可实现FDH蛋白的高水平表达。表达的重组蛋白质 40%为可溶性蛋白，用亲和层析很容易从大肠杆菌可溶性总蛋白中纯化出高纯度的重组 FDH蛋白质，用于FDH酶制剂的生产以及生化特性分析。其余60%以包涵体形式存在，用高浓度的尿素溶解包涵体后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离FDH蛋白，再从凝胶中回收FDH蛋白可得到纯度极高的FDH蛋白，用于抗体的制备。FDH重组蛋白表达量很高，因此不需要大规模培养细菌，纯化FDH蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。
权利要求
1.FDH的原核表达载体pET28a-FDH，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点和FDH基因及一个组氨酸标签。
2.如权利要求1所述的原核表达载体，所述甲酸脱氢酶基因FDH来源于博伊丁假丝酵母，在GenBank中的登录号为DQ458777。
3.如权利要求1所述的原核表达载体，其中FDH基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠FDH基因的起始密码子上游还有一个组氨酸标签序列。
4.如权利要求1所述的原核表达载体，由下述方法构建而得(1)从GenBank中查找博伊丁假丝酵母FDH的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物FDH5 :5’ -CATATGAAGATCGTTTTAGTCTTAT-3’ FDH3 :5’ -CTCGAGTTTCTTATCGTGTTTACCGTAAG-3‘5，端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位点；3，端引物末端加Xho I酶切位点。以Candida boidinii的基因组为模版扩增，得到FDH的全长DNA序列；(2)回收并纯化FDH全长基因片段，并将其连接到pMDlS-Τ载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-FDH ；(3)构建原核载体pET28a-FDH，用NdeI和XhoI双酶切pMD_FDH和pET28a，并回收纯化FDH基因片段以及载体片段pET28a，然后连接、转化、抽提质粒进行酶切检测，获得原核表达载体pET28a-FDH。
5.权利要求1所述的原核表达载体的制备方法，包括下述步骤(1)从GenBank中查找博伊丁假丝酵母FDH的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物FDH5 :5’ -CATATGAAGATCGTTTTAGTCTTAT-3’ FDH3 :5’ -CTCGAGTTTCTTATCGTGTTTACCGTAAG-3‘5，端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位点；3，端引物末端加Xho I酶切位点。以Candida boidinii的基因组为模版扩增，得到FDH的全长DNA序列；(2)回收并纯化FDH全长基因片段，并将其连接到pMDlS-Τ载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-FDH ；(3)构建原核载体pET28a-FDH，用NdeI和XhoI双酶切pMD-FDH和pET28a，并回收纯化FDH基因片段以及载体片段pET28a，然后连接、转化、抽提质粒进行酶切检测，获得原核表达载体pET28a-FDH。
6.权利要求1的原核表达载体在制备重组FDH蛋白中的应用。
7.权利要求1的原核表达载体在制备FDH特异性抗体的抗原中的应用。
8.应用权利要求1-4所述原核表达载体制备FDH重组蛋白的方法，将上述载体热刺激法导入大肠杆菌蛋白表达专用受体菌株BL21中，获得转化子菌落，用0.5mM IPTG于28°C诱导6小时可表达FDH重组蛋白，表达的重组蛋白质40%以可溶性形式存在于上清中(占大肠杆菌可溶性总蛋白40% )，60%存在于包涵体中，通过割胶纯化从上包涵体中获得高纯度的重组蛋白质，可作为抗原用于FDH抗体的制备。用亲和层析从大肠杆菌可溶性总蛋白中纯化出有活性的重组FDH蛋白质，可用于FDH酶制剂的生产或生化特性分析。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶蛋白的原核表达载体pET28a-FDH。该载体是含有博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶基因(FDH)的原核表达载体。本发明从博伊丁假丝酵母中克隆出FDH基因，用T7启动子控制它在大肠杆菌中的表达，表达的重组蛋白质40％以可溶性形式存在于上清中(占大肠杆菌可溶性总蛋白40％)，60％存在于包涵体中，通过割胶纯化从包涵体中很容易获得高纯度的重组蛋白质，可作为抗原用于FDH特异性抗体的制备。用亲和层析很容易从大肠杆菌可溶性总蛋白中纯化出有活性的重组FDH蛋白质，用于FDH酶制剂的生产及其生化特性分析。
文档编号C12N15/53GK102277370SQ20101017202
公开日2011年12月14日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者张婧, 李昆志, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学