专利名称：一种利用磷脂酶a1催化酯化制备甘油二酯的方法
技术领域：
本发明属于功能性食用油脂技术领域，特别涉及一种利用磷脂酶Al催化酯化制备甘油二酯的方法。
背景技术：
甘油二酯(Diacylglycerol，DAG)是由两分子脂肪酸与甘油酯化得到的产物，它 是油脂的天然成分，属GRAS (Generally Recognized as Safe)物质。甘油二酯和甘油三酯 的能量值相近，但是它们在生物体内的吸收代谢模式不同，甘油二酯含量高的油作为食用 油可以抑制肥胖，减少与生活方式相关的疾病，因而受到广泛的关注。而国内对甘油二酯的 研究还处于研发阶段，还没有相关商业化产品。甘油二酯的制备主要有化学合成法、酶法和生物发酵法等。酶法制备DAG可以采 用甘油三酯水解法、脂肪酸酯化法和油脂甘油解法等方法制得。磷脂酶Al (Lecitase Ultra)是由一种基因改造的米曲霉微生物进行深层发酵 生产制得的产品。Lecitase Ultra保持了 Thermomyces Ianuginosus脂酶的稳定性和 Fusarium oxysporum磷脂酶的活性。商业化磷脂酶Al (Lecitase Ultra)的价格只有固定 化脂肪酶的5% 10%，采用磷脂酶Al (Lecitase Ultra)作为催化剂具有成本优势，工业 化应用前景良好。发明人在前期研究中已经报道了磷脂酶Al (Lecitase Ultra)催化大豆 油部分水解法制备甘油二酯产品的技术，但是水解法会产生30%左右的副产品——游离脂 肪酸。
发明内容
为了弥补现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种利用磷脂酶Al催 化酯化制备甘油二酯(DAG)的方法。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种利用磷脂酶Al (Lecitase Ultra)催化酯化制备甘油二酯的方法，包括以下操作步骤(1)将摩尔比为0. 5 1 2. 5 1的脂肪酸(FFA)和甘油(GLY)混合后，得到底 物；向底物中依次加入磷脂酶Al和去离子水，得到反应物；所述磷脂酶Al的加入量是在每 克底物中加50 120U，所述去离子水的加入量为底物质量的4. 0 12. Owt% ；(2)将反应物在真空条件下，控制温度30 55°C，搅拌反应4 16h，得到反应液； 将反应液离心分层，得到上层的粗甘油二酯；(3)将粗甘油二酯在温度160 165°C和压力0. 3 1. OPa条件下进行分子蒸馏， 去除未反应的脂肪酸，得到甘油二酯。步骤(1)所述脂肪酸的制备方法按以下操作步骤将大豆油置于容器中，在40 50°C恒温水浴中以转速100 400r/min搅拌水解反应6 12h，水解液静置分层30 60min，分为两层，上层为含有甘油酯及脂肪酸的油层；将油层在温度150 170°C、压力 0. 3 1. OPa条件下，通过分子蒸馏得到脂肪酸。
步骤(1)所述脂肪酸和甘油的摩尔比优选为2. 21 1 ；所述磷脂酶Al的加入量 优选在每克底物中加90U，所述去离子水的加入量优选为底物质量的8. 0wt%。
步骤(2)所述温度优选控制在41. 15°C，所述搅拌反应的时间优选为12h。步骤(2)所述真空的绝对压力由优选为400 5000Pa ；所述搅拌的速度优选为 100 300r/min。步骤(2)所述离心的速度优选为3000r/min ；所述离心的时间优选为10 20min。步骤(3)所述分子蒸馏是优选在温度160°C和压力0. 3Pa条件下进行。本发明与现有技术相比具有如下的优点及有益效果(1)为了提高原料利用率，本发明以大豆油部分水解法得到的脂肪酸为反应底物， 采用磷脂酶Al催化脂肪酸和甘油酯化反应制备DAG，并通过一次分子蒸馏法得到纯化的 DAG产品，纯度为72. 62%。(2)和已经报道了采用固定化脂肪酶催化合成甘油二酯相比，本发明所采用商 业化磷脂酶Al (Lecitase Ultra)的价格只有固定化脂肪酶的5 % 10 %，采用磷脂酶 AKLecitase Ultra)作为催化剂具有成本优势，工业化应用前景良好。
图1是反应得到的粗甘油二酯和分子蒸馏甘油二酯产品的HPLC图谱，其中a为酯 化反应产物粗甘油二酯的HPLC图谱，b为酯化反应产物分子蒸馏重相HPLC图谱。
具体实施例方式下面结合具体的实例与附图对本发明作进一步详细的叙述，但本发明的实施方法 灵活，不仅仅限于此例所述的具体操作方式。以下实施例所用材料大豆油，嘉里粮油有限公司；磷脂酶AKLecitaseUltra，活 力单位10000U/mL)，丹麦诺维信公司；乙腈和异丙醇为HPLC级；甘油为AR级。反应原料脂肪酸的制备称取500. OOg大豆油于IOOOmL三口烧瓶中，在40°C恒温 水浴中搅拌速度为300r/min下反应8h，得到水解液；水解液静置分层30min，分为两层；上 层为含有甘油酯及脂肪酸的油层，油层在160°C、压力为l.OPa下，通过分子蒸馏得到水解 的脂肪酸(FFA)。油脂酸值按GB/T 5530-1995滴定法测定。酯化率的计算方法如下酯化率=(初始脂肪酸酸值-反应后油层酸值)/初始脂 肪酸酸值X100%。采用HPLC方法测定粗甘油二酯和分子蒸馏甘油二酯的含量。实施例1将脂肪酸和甘油按摩尔比0.5 1置于夹层烧杯中，得到底物；向底物中依次加入 80U/g底物的磷脂酶Al (Lecitase Ultra)和底物质量4. Owt %的去离子水，通过超级恒温 水浴控制反应温度为40°C，采用磁力搅拌器搅拌(转速300r/min)，反应在真空(绝对压力 400Pa)下进行，反应时间为12h ；酶解反应结束后，将反应液在3000r/min下离心IOmin分 层，下层为未反应的甘油，上层即为粗甘油二酯(含有脂肪酸杂质)；测定上层的酸值，酯化 率为43. 87%，粗甘油二酯中DAG含量为12. 78%。将上述所得粗甘油二酯层进分子蒸馏进料罐，脱水脱气后在蒸馏柱温150°C、压力
1. OPa、刮膜转速250r/min下分子蒸馏去除未反应的脂肪酸，得到甘油二酯产品。实施例2将脂肪酸和甘油按摩尔比2. 21 1置于夹层烧杯中，得到底物；向底物中依次加 入90U/g底物的磷脂酶Al (Lecitase Ultra)和底物质量4. Owt %的去离子水，通过超级恒 温水浴控制反应温度为41°C，采用磁力搅拌器搅拌(转速300r/min)，反应在真空(绝对压 力2000Pa)下进行，反应时间为12h ；酶解反应结束后，将反应液在3000r/min下离心IOmin 分层，下层为未反应的甘油，上层即为粗甘油二酯(含有脂肪酸杂质)；测定上层的酸值，酯 化率为82. 34%，粗甘油二酯中DAG含量为41. 54%，其HPLC分析图如图1 (a)所示。将上述所得粗甘油二酯层进分子蒸馏进料罐，脱水脱气后在蒸馏柱温165°C、压力 0. 3Pa、刮膜转速300r/min下分子蒸馏去除未反应的脂肪酸，得到甘油二酯产品，产品的得 率为49. 07%，纯度为72. 62%，其HPLC分析图如图1(b)所示。实施例3将脂肪酸和甘油按摩尔比2. 5 1置于夹层烧杯中，得到底物；向底物中依次加入 50U/g底物的磷脂酶Al (Lecitase Ultra)和底物质量12. Owt%的去离子水，通过超级恒温 水浴控制反应温度为55°C，采用磁力搅拌器搅拌(转速lOOr/min)，反应在真空(绝对压力 IOOOPa)下进行，反应时间为16h ；酶解反应结束后，将反应液在3000r/min下离心20min分 层，下层为未反应的甘油，上层即为粗甘油二酯(含有脂肪酸杂质)；测定上层的酸值，酯化 率为72. 58%，粗甘油二酯中DAG含量为32. 38%。将上述所得粗甘油二酯层进分子蒸馏进料罐，脱水脱气后在蒸馏柱温160°C、压力 0. 5Pa、刮膜转速250r/min下分子蒸馏去除未反应的脂肪酸，得到甘油二酯产品。实施例4将脂肪酸和甘油按摩尔比2 1置于夹层烧杯中，得到底物；向底物中依次加入 60U/g底物的磷脂酶Al (Lecitase Ultra)和底物质量8. Owt %的去离子水，通过超级恒温 水浴控制反应温度为30°C，采用磁力搅拌器搅拌(转速200r/min)，反应在真空(绝对压力 5000Pa)下进行，反应时间为9h ；酶解反应结束后，将反应液在3000r/min下离心15min分 层，下层为未反应的甘油，上层即为粗甘油二酯(含有脂肪酸杂质)；测定上层的酸值，酯化 率为`73. 7%，粗甘油二酯中DAG含量为33. 41%。将上述所得粗甘油二酯层进分子蒸馏进料罐，脱水脱气后在蒸馏柱温162°C、压力 0. 4Pa、刮膜转速250r/min下分子蒸馏去除未反应的脂肪酸，得到甘油二酯产品。实施例5将脂肪酸和甘油按摩尔比1.5 1置于夹层烧杯中，得到底物；向底物中依次加入 100U/g底物的磷脂酶Al (Lecitase Ultra)和底物质量6. Owt%的去离子水，通过超级恒温 水浴控制反应温度为40°C，采用磁力搅拌器搅拌(转速200r/min)，反应在真空(绝对压力 3000Pa)下进行，反应时间为4h ；酶解反应结束后，将反应液在3000r/min下离心18min分 层，下层为未反应的甘油，上层即为粗甘油二酯(含有脂肪酸杂质)；测定上层的酸值，酯化 率为39. 72%，粗甘油二酯中DAG含量为11.54%。将上述所得粗甘油二酯层进分子蒸馏进料罐，脱水脱气后在蒸馏柱温163°C、压力 0. 4Pa、刮膜转速250r/min下分子蒸馏去除未反应的脂肪酸，得到甘油二酯产品。实施例6
将脂肪酸和甘油按摩尔比1 1置于夹层烧杯中，得到底物；向底物中依次加入110U/g底物的磷脂酶Al (Lecitase Ultra)和底物质量10. 0wt%的去离子水，通过超级恒 温水浴控制反应温度为45°C，采用磁力搅拌器搅拌(转速lOOr/min)，反应在真空(绝对压 力SOOPa)下进行，反应时间为8h ；酶解反应结束后，将反应液在3000r/min下离心12min分 层，下层为未反应的甘油，上层即为粗甘油二酯(含有脂肪酸杂质)；测定上层的酸值，酯化 率为79. 58%，粗甘油二酯中DAG含量为35. 11%。将上述所得粗甘油二酯层进分子蒸馏进料罐，脱水脱气后在蒸馏柱温164°C、压力 0. 7Pa、刮膜转速250r/min下分子蒸馏去除未反应的脂肪酸，得到甘油二酯产品。实施例7将脂肪酸和甘油按摩尔比2. 3 1置于夹层烧杯中，得到底物；向底物中依次加入 90U/g底物的磷脂酶Al (Lecitase Ultra)和底物质量5. 的去离子水，通过超级恒温 水浴控制反应温度为50°C，采用磁力搅拌器搅拌(转速lOOr/min)，反应在真空(绝对压力 3000Pa)下进行，反应时间为8h ；酶解反应结束后，将反应液在3000r/min下离心16min分 层，下层为未反应的甘油，上层即为粗甘油二酯(含有脂肪酸杂质)；测定上层的酸值，酯化 率为67. 47%，粗甘油二酯中DAG含量为26. 47%。将上述所得粗甘油二酯层进分子蒸馏进料罐，脱水脱气后在蒸馏柱温165°C、压力 0. 8Pa、刮膜转速250r/min下分子蒸馏去除未反应的脂肪酸，得到甘油二酯产品。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种利用磷脂酶A1(Lecitase Ultra)催化酯化制备甘油二酯的方法，其特征在于包括以下操作步骤(1)将摩尔比为0.5∶1～2.5∶1的脂肪酸和甘油混合后，得到底物；向底物中依次加入磷脂酶A1和去离子水，得到反应物；所述磷脂酶A1的加入量是在每克底物中加50～120U，所述去离子水的加入量为底物质量的4.0～12.0wt％；(2)将反应物在真空条件下，控制温度30～55℃，搅拌反应4～16h，得到反应液；将反应液离心分层，得到上层的粗甘油二酯；(3)将粗甘油二酯在温度160～165℃和压力0.3～1.0Pa条件下进行分子蒸馏，去除未反应的脂肪酸，得到甘油二酯。
2.根据权利要求1所述的一种利用磷脂酶Al催化酯化制备甘油二酯的方法，其特征在 于步骤(1)所述脂肪酸的制备方法按以下操作步骤将大豆油置于容器中，在40 50°C 恒温水浴中以转速100 400r/min搅拌水解反应6 12h，水解液静置分层30 60min，分 为两层，上层为含有甘油酯及脂肪酸的油层；将油层在温度150 170°C、压力0. 3 1. OPa 条件下，通过分子蒸馏得到脂肪酸。
3.根据权利要求1所述的一种利用磷脂酶Al催化酯化制备甘油二酯的方法，其特征在 于步骤(1)所述脂肪酸和甘油的摩尔比为2. 21 1;所述磷脂酶Al的加入量是在每克底 物中加90U，所述去离子水的加入量为底物质量的8. 0wt%。
4.根据权利要求1所述的一种利用磷脂酶Al催化酯化制备甘油二酯的方法，其特征在 于步骤(2)所述温度控制在41. 15°C，所述搅拌反应的时间为12h。
5.根据权利要求1所述的一种利用磷脂酶Al催化酯化制备甘油二酯的方法，其特征在 于步骤(2)所述真空的绝对压力为400 5000Pa ；所述搅拌的速度为100 300r/min。
6.根据权利要求1所述的一种利用磷脂酶Al催化酯化制备甘油二酯的方法，其特征在 于步骤(2)所述离心的速度为3000r/min ；所述离心的时间为10 20min。
7.根据权利要求1所述的一种利用磷脂酶Al催化酯化制备甘油二酯的方法，其特征在 于步骤(3)所述分子蒸馏是在温度160°C和压力0. 3Pa条件下进行。
全文摘要
本发明公开了一种利用磷脂酶A1(Lecitase Ultra)催化酯化制备甘油二酯的方法，该方法包括以下步骤(1)将摩尔比为0.5∶1～2.5∶1的脂肪酸和甘油混合后，得到底物；向底物中依次加入的磷脂酶A1和去离子水，得到反应物；所述磷脂酶A1的加入量是在每克底物中加50～120U，所述去离子水的加入量为底物质量的4.0～12.0wt％；(2)将反应物在真空条件下，控制温度30～55℃，搅拌反应4～16h，得到反应液；将反应液离心分层，得到上层的粗甘油二酯；(3)将粗甘油二酯在温度160～165℃和压力0.3～1.0Pa条件下进行分子蒸馏，去除未反应的脂肪酸，得到甘油二酯。
文档编号C12P7/64GK101845466SQ20101017422
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月10日 优先权日2010年5月10日
发明者汪勇, 王丽丽, 胡长鹰, 赵谋明 申请人:暨南大学;华南理工大学