专利名称：利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法
技术领域：
本发明属海水细菌分离培养领域，特别是涉及一种利用无菌纤维素滤膜富集海水 细菌的方法。
背景技术：
地球上辽阔的海域孕育了丰富的海洋微生物。海洋面积达3.6X108km2，约占地球 表面积的71%，占地球总水量的97%，是地球上最大的水体地理单元。浩瀚的海洋是生命 的摇篮，据统计，在海洋中发现并命名的生物大约有30万种，约占地球物种的80%，其中微 生物种类有百万种以上，而目前所研究和鉴定过的海洋微生物仅占所有海洋微生物种类的 5%。独特的海洋环境蕴藏着丰富的微生物资源，海洋微生物的生物多样性和所处环境的异 质性决定了其代谢产物多样性，为人类提供了种类繁多，分子结构新颖，化学组成复杂和生 理活性特异的天然活性产物。调查海洋微生物资源是开发微生物资源的前提和基础。海洋 微生物培养则是通过培养基，把海水和海洋沉积物中的细菌分离培养出来，然后再进行研 究以达到开发利用海洋微生物资源的目的。由于海洋微生物的多样性，对分离培养的要求 比较高，如何建立一种充分又全面地分离海洋微生物的方法，是大家研究的热点。目前，最常用的分离海水细菌的方法就是直接涂布法，即取定量的海水用涂布棒 直接涂布在培养基上，这种方法的缺点是由于海水中的含菌量非常小，用这种方法很难把 海水中所有的细菌都分离培养出来，达不到充分的分离培养海洋微生物的目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方 法，该方法可以克服因海水中所含菌量少，难以培养的缺点，通过先富集细菌再培养，使海 水中的大部分细菌可以分离培养出来，为全面研究海水中的细菌提供了可能，具有重要的 实际应用意义。本发明的一种利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法，包括(1)注射器、针头式过滤器灭菌将注射器、针头式过滤器分别用纸包好，进行高压灭菌；(2)在过滤器中放入无菌纤维素滤膜将滤膜经预处理后装入上述针头式过滤器中，滤膜和过滤器接触面充分贴合，不 留缝隙，防止过滤时周围漏液，一个过滤器放入一张滤膜；(3)过滤富集海水细菌先用注射器吸取海水，然后通过针头式过滤器，在无菌纤维素滤膜上富集海水细 菌；(4)培养海水细菌将富集了海水细菌的纤维素滤膜置于佐贝尔培养基上，纤维素滤膜与培养基的接 触面充分贴合，使滤膜上的细菌能充分吸收营养生长，进行海水细菌的培养。
所述步骤(1)中的注射器的型号为10毫升的塑料注射器，针头式过滤器的型号是 SwinnexPP可换膜针头式过滤器(过滤器中可装入直径为25mm的滤膜)。所述步骤(1)中的高压灭菌的条件为温度121°C，时间30min。所述步骤(2)中的滤膜预处理是指将无菌纤维素滤膜用70°C的蒸馏水浸泡，使其 全部湿润，4h后倒去水，再用70°C的蒸馏水浸泡过夜，使用前再用40°C蒸馏水浸泡清洗一 次。所述步骤(2)中的无菌纤维素滤膜的孔径为0.45um。所述步骤(3)中的海水取自东海东经120°到123°，北纬28°到31°的海域。所述步骤(5)中的佐贝尔(ZoBell)培养基的配方是蛋白胨5g，琼脂15g，酵母 膏lg，FeP040. Olg，人工海水1000ml，培养基pH值为7. 6 7. 8，培养基于121 °C高压灭菌 20min。所述的人工海水配方如下=NaCl 23. 476g, MgCl2 · 6H20 10. 6359g, Na2S043. 917g, CaCl2L 102g, KCl 0. 664g, NaHCO3O. 192g, KBr 0. 096g, H3BO3O. 026g, SrCl2 · 6H20 0. 04 03g, NaF 0. 072g, NaNO3O. 050g, NaH2PO4O. 005g, Na2SiO3 · 9H20 0. OlOg, MnCl2 · 4H20 0. 0003g, FeC6H5O7 · 3H20 0. 00054g，蒸馏水 1000ml。有益效果本发明的培养方法可以克服因海水中含菌量少，难以培养的缺点，通过先富集细 菌再培养，使海水中的大部分细菌可以分离培养出来，为全面研究海水中的细菌提供了可 能，具有重要的实际应用意义。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌，具体步骤如下(1)注射器、针头式过滤器灭菌注射器和针头式过滤器先分别用纸包好，再放入 灭菌锅中，于121°C，高压灭菌30分钟；(2)在灭过菌的过滤器中放入无菌纤维素滤膜无菌纤维素滤膜要先清洗，将滤膜平放于清洁盛器内，用70°C左右的蒸馏水浸泡， 使全部湿润，4h后倒去水，再用70°C的蒸馏水浸泡过夜，使用前再用40°C蒸馏水浸泡清洗 一次；用无菌镊子将清洗的滤膜装入已灭过菌的过滤器中，滤膜和过滤器接触面要充分 贴合，不留缝隙，防止过滤时周围漏液，一个过滤器放入一张滤膜；(3)过滤富集海水细菌先用注射器吸取海水，每次吸取IOml海水，然后通过针头 式过滤器(即注射器中的海水经针头注入到过滤器中)，在无菌纤维素滤膜上富集海水细 菌；(4)培养海水细菌用无菌镊子把收集了海水细菌的纤维素滤膜置于佐贝尔培养 基上，培养海水细菌，纤维素滤膜与培养基的接触面充分贴合，使滤膜上的细菌能充分吸取 营养生长。
实施例2配置佐贝尔培养基，具体步骤如下 (1)配置人工海水将 NaCl 23. 476g, MgCl2 · 6H20 10. 6359g, Na2S043. 917g, CaCl2L 102g, KCl 0. 664g, NaHCO3O. 192g, KBr 0. 096g, H3BO3O. 026g, SrCl2 · 6H20 0. 0403g, NaF 0. 072g, NaNO3O. 050g, NaH2PO4O. 005g, Na2SiO3 · 9H20 0. OlOg, MnCl2 · 4H20 0. 0003g, FeC6H5O7 · 3H200. 00054g，蒸馏水 1000ml，充分溶解。(2)配置佐贝尔培养基将蛋白胨5g，琼脂15g，酵母膏lg，FeP040. Olg，分别加入 装有IOOOml的人工海水烧杯中；(3)加热培养基将已加入所需营养物质的培养基加热至沸腾，使琼脂充分溶解；(4)调pH值待加热后的培养基冷却至60°C左右时，用pH测量仪调pH值到7. 6 7. 8 ；(5)培养基灭菌将培养基分装入250ml三角瓶，放入灭菌锅中，于121 °C高压灭菌 20mino
权利要求
一种利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法，包括(1)注射器、针头式过滤器灭菌将注射器、针头式过滤器分别用纸包好，进行高压灭菌；(2)在过滤器中放入无菌纤维素滤膜将滤膜经预处理后装入上述针头式过滤器中，滤膜和过滤器接触面充分贴合，不留缝隙，防止过滤时周围漏液，一个过滤器放入一张滤膜；(3)过滤富集海水细菌先用注射器吸取海水，然后通过针头式过滤器，在无菌纤维素滤膜上富集海水细菌；(4)培养海水细菌将富集了海水细菌的纤维素滤膜置于佐贝尔培养基上，纤维素滤膜与培养基的接触面充分贴合，进行海水细菌的培养。
2.根据权利要求1所述的一种利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法，其特征 在于所述步骤(1)中的注射器的型号为10毫升的塑料注射器，针头式过滤器的型号是 Swinnex PP可换膜针头式过滤器。
3.根据权利要求1所述的一种利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法，其特征在 于所述步骤(1)中的高压灭菌的条件为温度121°C，时间30min。
4.根据权利要求1所述的一种利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法，其特征在 于所述步骤(2)中的滤膜预处理是指将无菌纤维素滤膜用70°C的蒸馏水浸泡，使其全部 湿润，4h后倒去水，再用70°C的蒸馏水浸泡过夜，使用前再用40°C蒸馏水浸泡清洗一次。
5.根据权利要求1所述的一种利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法，其特征在 于所述步骤(2)中的无菌纤维素滤膜的孔径为0. 45um。
6.根据权利要求1所述的一种利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法，其特征在 于所述步骤(3)中的海水取自东海东经120°到123°，北纬28°到31°的海域。
7.根据权利要求1所述的一种利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法，其特征在 于所述步骤(5)中的佐贝尔培养基的配方是蛋白胨5g，琼脂15g，酵母膏lg，FeP040.01g， 人工海水1000ml，培养基pH值为7. 6 7. 8，培养基于121 °C高压灭菌20min。
8.根据权利要求7所述的一种利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法，其特征在 于所述的人工海水配方如下:NaCl 23. 476g，MgCl2 · 6H20 10. 6359g，Na2SO4 3. 917g，CaCl2 1. 102g, KCl 0. 664g, NaHCO3 0. 192g, KBr 0. 096g, H3BO3 0. 026g, SrCl2 · 6H20 0. 0403g, NaF 0. 072g, NaNO3 0. 050g, NaH2PO4 0. 005g, Na2SiO3 · 9H20 0. OlOg, MnCl2 · 4H20 0. 0003g, FeC6H5O7 · 3H200. 00054g，蒸溜水 1000ml。
全文摘要
本发明涉及一种利用无菌纤维素滤膜富集海水细菌的方法，步骤包括(1)注射器、针头式过滤器灭菌；(2)在灭过菌的过滤器中放入无菌纤维素滤膜；(3)通过注射器把海水注入过滤器，富集海水细菌；(4)把收集了海水细菌的纤维素滤膜置于培养基上，培养海水细菌。本发明的培养方法可以克服因海水中所含菌量少，难以培养的缺点，通过先富集细菌再培养，使海水中的大部分细菌可以分离培养出来，为全面研究海水中的细菌提供了可能，具有重要的实际应用意义。
文档编号C12R1/01GK101864386SQ201010174899
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者刘双霜, 张兴群 申请人:东华大学