专利名称：一种l-门冬酰胺酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及L-门冬酰胺酶的制备领域，具体涉及一种简单、快速、高效的L-门冬 酰胺酶的制备方法。
背景技术：
L-门冬酰胺酶(L-asparaginase，L-ASP)，又名L-天冬酰胺酶或L-天门冬酰 胺酶，商品名为左旋门冬酰胺酶，目前在临床上主要用于治疗儿童急性淋巴细胞白血病 (childhood acute lymphoblastic leukemia，ALL)。L-ASP 单独使用对 ALL 的有效率为 60%，与长春碱(vincristine)及皮质留类药物(corticosteroids)等药物联合使用时，对 ALL的有效率高达95%，是临床治疗白血病的重要药物。L-ASP抗肿瘤的作用机制是降低人体内L-天冬酰胺和L-天氨酰胺的浓度，这两 种氨基酸是合成嘌呤环和嘧啶环的重要组成部分。肿瘤细胞缺乏天冬酰胺合成酶，不能合 成L-天冬酰胺，癌细胞合成核苷酸和蛋白质的能力就会显著降低，从而达到抑制肿瘤细胞 增殖效果。国内外生产L-门冬酰胺酶的方法均采用微生物发酵技术，即通过微生物培养技 术获取大量含L-门冬酰胺酶蛋白的细胞，然后通过提取纯化获得高纯度的L-门冬酰胺酶 蛋白。公开报道的分离纯化工艺一般是细胞破壁——蛋白沉淀——透析——亲和层析。 细胞破壁的方法主要有丙酮破壁法、渗透休克法、反复冻融法。蛋白沉淀的方法主要有硫酸 铵分级沉淀法和乙醇分级沉淀法。上述的几种破壁和沉淀法要么工艺繁琐、效率低下，要么 消耗能源、不环保，很难实现工业化规模的生产。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的L-门冬酰胺酶制备方法中存在的工艺繁琐、效率 低下、消耗能源多不环保、很难实现工业化生产的缺陷，提供一种简单易行，效率高，收得率 可达60%以上，制得的L-门冬酰胺酶的纯度达99%以上的L-门冬酰胺酶的制备方法。本发明目的通过以下技术方案予以实现一种L-门冬酰胺酶的制备方法，包括如下步骤(1)取欧文氏菌菌体，加入磷酸二氢钠抽提液，调节pH值至4. 8 5. 2，经搅拌、离 心收取上清液；(2)将上清液过滤，通过阳离子交换层析柱进行吸附层析；(3)用缓冲液洗脱；(4)将洗脱液过滤，通过亲和层析柱进行吸附层析；(5)用缓冲液洗脱，得到L-门冬酰胺酶。作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(1)中，所述磷酸二氢钠抽提液是溶菌 酶含量为0. 2mg/ml的50mmol/L的磷酸二氢钠缓冲液，调节的pH值最优选为5. 0。作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(1)中，所述搅拌的时间为20 30min，最优选的搅拌时间为25min。作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(2)中，所述过滤是经1.2μπι滤膜过滤，过滤后的上清液以50ml/min的速度流经被平衡好的阳离子交换层析柱中吸附。作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(2)中，所述阳离子交换层析柱是 CM-纤维素阳离子交换层析柱。作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(3)中所述用缓冲液洗脱方法如下用 PH为7. 0的50mmol/L磷酸二氢钠缓冲液洗涤阳离子交换层析柱凝胶，至洗脱液OD28tl < 0. 1 时，更换洗脱液为pH为8. 8的lOOmmol/L磷酸二氢钠缓冲液洗脱，收集OD28tl > 0. 1的洗脱 液。作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(4)中，所述过滤是经0.2μπι滤膜过 滤，过滤后以50ml/min的速度流经平衡好的亲和层析柱中吸附。作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤⑷中，所述亲和层析柱为 DEAE-Sephadex亲和层析柱。作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(5)中所述用缓冲液洗脱方法如下用 PH为7. 0的50mmol/L磷酸二氢钠缓冲液洗涤亲和层析柱凝胶，至洗脱液OD28tl < 0. 1时，更 换洗脱液为pH为8. 8的lOOmmol/L磷酸二氢钠缓冲液，洗脱收集OD28tl > 0. 1的洗脱液。
通过本发明方法制备得到的L-门冬酰胺酶经HPLC检测> 99 %，达到《中国药典》 (2005版)的要求。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明L-门冬酰胺酶的制备方法简单易行，步骤简单易行，不涉及到易燃易爆等 危险试剂，既经济又环保，制得的L-门冬酰胺酶的纯度达99%以上，达到《中国药典》(2005 版)的要求，适用于大规模的L-门冬酰胺酶工业化生产。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。1.取发酵完离心收集的菌体3kg，加入其重量30L的磷酸二氢钠抽提液，调pH值 为5. 0，机械搅拌25min，离心收取上清液；2.将步骤1收取的上清液经1. 2 μ M滤膜过滤后，以50ml/min速度流经被平衡好 的CM-纤维素阳离子交换层析柱中吸附；3.用10L pH为7. 0的50mmol/L磷酸二氢钠缓冲液，洗涤步骤2层析柱凝胶至洗 脱液OD28tl < 0. 1时，更换洗脱液为pH为8. 8的lOOmmol/L的磷酸二氢钠缓冲液洗脱，收集 OD280 > 0. 1的洗脱液；4.将步骤3收集的洗脱液经0. 2 μ m滤膜过滤，过滤后以50ml/min速度流经平衡 好的DEAE-S印hadex亲和层析柱中吸附；5.用10L pH为7. 0的50mmol/L的磷酸二氢钠缓冲液，洗涤步骤4亲和层析柱凝 胶，至洗脱液OD28tl < 0. 1时，更换洗脱液为pH为8. 8的lOOmmol/L的磷酸二氢钠缓冲液， 洗脱收集OD28tl > 0. 1的洗脱液，即得高纯度的L-门冬酰胺酶。测定L-门冬酰胺酶的比活为448 IU/ml，分离纯化收率为61%，纯度为99. 5%。
权利要求
一种L-门冬酰胺酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)取欧文氏菌菌体，加入磷酸二氢钠抽提液，调节pH值至4.8～5.2，经搅拌、离心收取上清液；(2)将上清液过滤，通过阳离子交换层析柱进行吸附层析；(3)用缓冲液洗脱；(4)将洗脱液过滤，通过亲和层析柱进行吸附层析；(5)用缓冲液洗脱，得到L-门冬酰胺酶。
2.根据权利要求1所述的L-门冬酰胺酶的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述磷 酸二氢钠抽提液是溶菌酶含量为0. 2mg/ml的50mmol/L的磷酸二氢钠缓冲液。
3.根据权利要求1所述的L-门冬酰胺酶的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述搅 拌的时间为20 30min。
4.根据权利要求1所述的L-门冬酰胺酶的制备方法，其特征在于步骤(2)中，所述过 滤是经1. 2 ym滤膜过滤，过滤后的上清液以50ml/min的速度流经被平衡好的阳离子交换 层析柱中吸附。
5.根据权利要求1或4所述的L-门冬酰胺酶的制备方法，其特征在于步骤(2)中，所 述阳离子交换层析柱是CM-纤维素阳离子交换层析柱。
6.根据权利要求1所述的L-门冬酰胺酶的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述用 缓冲液洗脱方法如下用pH为7. 0的50mmol/L磷酸二氢钠缓冲液洗涤阳离子交换层析柱 凝胶，至洗脱液0D28(1 < 0. 1时，更换洗脱液为pH为8. 8的lOOmmol/L磷酸二氢钠缓冲液洗 脱，收集0D28(1 > 0. 1的洗脱液。
7.根据权利要求1所述的L-门冬酰胺酶的制备方法，其特征在于步骤(4)中，所述过 滤是经0. 2 ym滤膜过滤，过滤后以50ml/min的速度流经平衡好的亲和层析柱中吸附。
8.根据权利要求1或7所述的L-门冬酰胺酶的制备方法，其特征在于步骤(4)中，所 述亲和层析柱为DEAE-S印hadex亲和层析柱。
9.根据权利要求1所述的L-门冬酰胺酶的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述用 缓冲液洗脱方法如下用pH为7. 0的50mmol/L磷酸二氢钠缓冲液洗涤亲和层析柱凝胶，至 洗脱液0D28(1 < 0. 1时，更换洗脱液为pH为8. 8的lOOmmol/L磷酸二氢钠缓冲液，洗脱收集 0D280 > 0. 1的洗脱液。
全文摘要
本发明公开了一种L-门冬酰胺酶的制备方法。本发明制备方法是用含溶菌酶的提取液对欧文氏菌菌体进行破壁，经过离子交换层析和亲和层析，获得高纯度的L-门冬酰胺酶。本发明L-门冬酰胺酶的制备方法简单易行，效率高，收得率可达60％以上，制得的L-门冬酰胺酶的纯度达99％以上，达到《中国药典》(2005版)的要求。本发明制备方法对环境无污染，经济环保，可用于工业化生产。
文档编号C12N9/82GK101831417SQ20101017620
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月11日 优先权日2010年5月11日
发明者夏枫耿, 明飞平, 梁淑娃, 蓝碧峰, 谢鹏, 谭颖嫦, 黄乐天 申请人:广州市微生物研究所