专利名称：11α羟基坎利酮的合成方法
技术领域：
本发明涉及一种11 a羟基坎利酮的合成方法，属于生物化学领域。
背景技术：
由于依普利酮的化合物专利已过期，近年来全世界制药行业纷纷对该产品进行仿 制，目前已有阿根廷等几个非规范市场获得批准，我国也有四家企业申请注册。对依普利酮 的所有合成路线分析发现，虽然依普利酮有多条合成路线，但几乎所有路线都离不开一个 关键中间体即11a羟基坎利酮。目前由于11 a羟基坎利酮成本高，导致依普利酮价格昂 贵。鉴于上述情况，对依普利酮的关键中间体11 a羟基坎利酮生物合成进行研究，并使其 成本有较大幅度下降，满足依普利酮产业化的需要是极其有前景的。由于11 a羟基坎利酮 成本决定了依普利酮的产品成本，研究对依普利酮的推广也有着决定性意义。通过相关资料的检索，目前国内外对11a羟基坎利酮的合成主要有以下几种方 法第一种方法以表氢化可的松作为起始原料合成，路线如下 第二种方法以双酮为起始原料进行11 a羟化后再合成，路线如下 第三种方法以坎利酮为起始原料进行11 a羟化即得，路线如下 坎利酮Ila羟基坎利酮上述三种方法，第一种方法主要存在合成路线长，污染大，收率低，成本高，降低成 本的空间较少等缺点；第二种方法既需要生物技术又有较长的合成路线，存在生物转化酶 专一性差，投料浓度低，同时还存在污染大，降低成本的空间有限等缺点；相比上述二种方 法，第三种方法的优势非常明显，主要表现在用生物技术一步即得产品，具有线路短，污染 少等优点，但同时也存在常用转化酶(像黒根酶、梨头酶、绿僵酶等)对坎利酮专一性差 (50%)左右、投料浓度低(0.3%左右)、收率低(30%左右)等缺点，相比前二种方法，第三 种方法降低成本的潜力是巨大的。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种11 α羟基坎利酮的合成方法，更具体地，是 解决上述第三种合成方法的转化酶对坎利酮专一性差、投料浓度低和收率低的问题。本发明的技术方案一种11 α羟基坎利酮的合成方法，将原料坎利酮加入至培养 基，投入赭曲霉菌种发酵，再从菌丝体提取，精制得到Ila羟基坎利酮；所述的赭曲霉菌种 采用下述步骤得到1)、赭曲霉原菌种经紫外线波长为200 280nm，照射10 30分钟后培养出突变 优异菌种；2)、将步骤(1)得到的赭曲霉菌种加入传代固体培养基，培养基配比0. 05 0. 15%蛋白胨、1 3%麦芽糖、1 3%葡萄糖、1. 5 2. 5%琼脂，调节pH在4. 8 6，并在 条件为25 30°C，培养7 10天，经三代传代得到三代赭曲霉菌种，5°C以下低温冷冻储 存；3)、配置液体培养基，其配比为葡萄糖0. 5 1. 5%，蛋白胨0. 5 1. 5%，酵母浸 膏0.5 1.5%，玉米浆0.5 1.5%，调节pH在5. 5 6. 1，并灭菌，按5 10%的接种量 接种上述三代赭曲霉菌种，培养温度控制在25 32°C下，转速为100 200r/min，pH控制 在5 6之间，培养时间20 30小时。优选地，本发明的合成方法包括下述步骤1)、将配比为坎利酮0.8%、丙二醇2%、吐温80 1 %，加热溶解作为底物，投了 已培养好的菌种培养基中发酵；所述的发酵温度控制在29. 5 30. 5°C，转速为150r/min， PH控制在6 7之间，培养48 72小时，测转化率超过85%后加热灭菌；2)、将上述发酵后的培养液，经过离心机菌液分离，获得的菌丝体加入2. 5%的二 氯甲烷萃取3-4次，弃菌丝体残渣；蒸馏回收溶剂二氯甲烷后，加入0.5%甲苯，冷却结晶精 制，得到11 α-羟基坎利酮。
优选地，本发明所述的赭曲霉菌种采用下述步骤得到1)、赭曲霉原菌种经紫外线波长为254nm照射15分钟后，培养出突变优异菌种；2)、将步骤(1)得到的赭曲霉菌种加入传代固体培养基，培养基配比蛋白胨、 2%麦芽糖 、2%葡萄糖、2%琼脂，调节pH至5. 3，并在条件为25 30°C，培养7 10天， 经三代传代得到三代赭曲霉菌种，5°C以下低温冷冻储存；3)、配置液体培养基，其配比为葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母浸膏1%，玉米浆 1 %，调节PH至5. 8，并灭菌，按7 %的接种量接种三代赭曲霉菌种，培养温度控制在28 29°C下，转速为150r/min，pH控制在5 6之间，培养时间20 26小时。本发明有益效果本发明就是基于上述技术方案，克服三种合成方法缺陷，采用生 物合成技术，遴选出新型转化酶，使其达到对底物专一性好，投料浓度高，产物收率高的目 的，从而大大降低Ila羟基坎利酮的成本。上述技术方案的实施得到的新型转化酶对坎 利酮的专一性从以前的75%提高到现在的85%以上；坎利酮的投料浓度从0. 6%提高到 0.8%以上；11 α羟基坎利酮收率从50%提高到现在的60%以上；11 α羟基坎利酮主要质 量指标达到含量(HPLC)彡98%，总杂质彡2.0%，单一杂质峰彡1.5%。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步地详细地描述，但本发明的保 护范围并不限于此。实施例1一种11 α羟基坎利酮的合成方法，将原料坎利酮、丙二醇和吐温80加热溶解配制 成底物加入到培养基中，并投入赭曲霉菌种发酵，发酵完成后，再从菌丝体提取，精制得到 Ila羟基坎利酮。具体包括1)、菌种的遴选赭曲霉(原菌种)经人工诱导(波长为254nm的紫外线照射15 分钟紫外线)和自然突变成对底物坎利酮选择性高的优良赭曲霉菌种后冷冻干燥管低温 保存。 2)、菌种的培养传代固体培养基配比0. 07 %蛋白胨、1 %麦芽糖、1. 5 %葡萄糖、 2. 5%琼脂，调节pH至5. 2，培养条件25°C，培养7天，取经三代传代得到生产所用菌种，并 在5°C以下低温冷冻储存备用。3)、发酵菌种的培养液体培养基配比葡萄糖1. 1 %，蛋白胨0. 8 %，酵母浸膏 1 %，玉米浆1 %，调节PH至5. 6培养基灭菌后，按6 %的接种量接种三代赭曲霉菌种，培养 温度控制在28-29°C下150r/min (转速)，pH控制在5_6之间，培养时间22小时，菌检。4)、发酵将配比为坎利酮0. 8 %，丙二醇2 %和吐温801 %底物加热溶解后，投了 已培养好的菌种培养基中。发酵条件温度控制在29. 5°C 150r/min (转速)，pH控制在6 7之间，培养52小时。后测转化率超过85%后加热灭菌。5)、提取，精制经过离心机菌液分离，菌丝体加入2. 5%的二氯甲烷萃取3次，弃 菌丝体残渣。蒸馏回收溶剂二氯甲烷后，加入0.5%甲苯，冷却结晶精制，得到Ila羟基坎 利酮，含量98. 1%0实施例2一种11 α羟基坎利酮的合成方法，将原料坎利酮、丙二醇和吐温80加热溶解配制成底物加入到培养基中，并投入赭曲霉菌种发酵，发酵完成后，再从菌丝体提取，精制得到 Ila羟基坎利酮。具体包括1、菌种的遴选赭曲霉(原菌种)经人工诱导(波长为254nm的紫外线照射15分 钟紫外线)和自然突变成对底物坎利酮选择性高的优良赭曲霉菌种后冷冻干燥管低温保
存。 2、菌种的培养传代固体培养基配比0. 蛋白胨、2%麦芽糖、2%葡萄糖、2% 琼脂，调节PH至5. 3，培养条件25-30°C，培养9天，取经三代传代得到生产所用菌种，并在 5 0C以下低温冷冻储存备用。3、发酵菌种的培养液体培养基配比葡萄糖1 %，蛋白胨1 %，酵母浸膏1 %，玉米 浆1 %，调节PH至5. 8，再塞上棉塞盖8层纱布，再在纱布上加一层牛皮纸，高温121°C灭菌 30min，按7%的接种量接种三代赭曲霉菌种，放入摇床培养温度控制在29°C，150r/min (转 速)，PH控制在5-6之间，培养时间24小时，菌检。4、发酵将配比为坎利酮0.8%，丙二醇2%和吐温80 底物加热溶解后，投了 已培养好的菌种培养基中。发酵条件温度控制在30°C，150r/min (转速)，pH控制在6 7 之间，培养72小时。后测转化率超过85%后加热灭菌。5、提取，精制经过离心机菌液分离，菌丝体加入2. 5%的二氯甲烷萃取4次，弃菌 丝体残渣。蒸馏回收溶剂二氯甲烷后，加入0. 5%甲苯，冷却结晶抽滤精制，得到11 a -羟基 坎利酮，含量为98.6%。实施例3一种11 α羟基坎利酮的合成方法，将原料坎利酮、丙二醇和吐温80加热溶解配制 成底物加入到培养基中，并投入赭曲霉菌种发酵，发酵完成后，再从菌丝体提取，精制得到 11 α-羟基坎利酮。具体包括1、菌种的遴选赭曲霉(原菌种)经人工诱导(波长为254nm的紫外线照射18分 钟紫外线)和自然突变成对底物坎利酮选择性高的优良赭曲霉菌种后冷冻干燥管低温保存。2、菌种的培养传代固体培养基配比0. 12%蛋白胨、1.5%麦芽糖、2. 5%葡萄 糖、1. 8%琼脂，调节pH至5. 0，培养条件25-30°C，培养7天，取经三代传代得到生产所用 菌种，并在5°C以下低温冷冻储存备用。3、发酵菌种的培养液体培养基配比葡萄糖1.3%，蛋白胨1. 1%，酵母浸膏 0.9%,玉米浆0. 9%，调节pH至5. 8，再塞上棉塞盖8层纱布，再在纱布上加一层牛皮纸，高 温125°C灭菌30min，按7%的接种量接种三代赭曲霉菌种，放入摇床培养温度控制在29°C， 150r/min (转速)，pH控制在5-6之间，培养时间24小时，菌检。4、发酵将配比为坎利酮0.8%，丙二醇2%和吐温80 底物加热溶解后，投了 已培养好的菌种培养基中。发酵条件温度控制在30°C，150r/min (转速)，pH控制在6. 5之 间，培养72小时。后测转化率超过85%后加热灭菌。5、提取，精制经过离心机菌液分离，菌丝体加入2. 5%的二氯甲烷萃取3次，弃菌 丝体残渣。蒸馏回收溶剂二氯甲烷后，加入0. 5%甲苯，冷却结晶抽滤精制，得到11 a -羟基 坎利酮，含量为98.0%。
权利要求
一种11α羟基坎利酮的合成方法，其特征在于，该合成方法将原料坎利酮、丙二醇和吐温80加热溶解配制成底物加入到培养基中，并投入赭曲霉菌种发酵，发酵完成后，再从菌丝体提取精制得到11α羟基坎利酮；所述的赭曲霉菌种采用下述步骤得到1)、将赭曲霉原菌种经波长为200nm～280nm紫外线照射10～30小时；2)、将步骤(1)得到的赭曲霉菌种加入传代固体培养基，培养基配比0.05～0.15％蛋白胨、1～3％麦芽糖、1～3％葡萄糖、1.5～2.5％琼脂，调节pH在4.8～6，并在条件为25～30℃，培养7～10天，经三代传代得到三代赭曲霉菌种，5℃以下低温冷冻储存；3)、配置液体培养基，其配比为葡萄糖0.5～1.5％，蛋白胨0.5～1.5％，酵母浸膏0.5～1.5％，玉米浆0.5～1.5％，调节pH在5.5～6.1，并灭菌，按5～10％的接种量接种三代赭曲霉菌种，培养温度控制在25～32℃下，转速为100～200r/min，pH控制在5～6之间，培养时间20～30小时。
2.根据权利要求1所述的11a羟基坎利酮的合成方法，其特征在于包括下述步骤1)、发酵将配比为坎利酮0.8%、丙二醇2%、吐温801%，加热溶解作为底物，投入 已培养好的菌种培养基中发酵；所述的发酵温度控制在29. 5 30. 5°C，转速为150r/min， pH控制在6 7之间，培养48 72小时，转化率超过85%后加热灭菌；2)、菌丝体提取精制将上述发酵后的培养液，经过离心机菌液分离，获得的菌丝体加 入2. 5fft %的二氯甲烷萃取3-4次，弃菌丝体残渣；蒸馏回收溶剂二氯甲烷后，加入0. 5fft % 甲苯，冷却结晶精制，得到11a羟基坎利酮。
3.根据权利要求1所述的11a羟基坎利酮的合成方法，其特征在于，所述的赭曲霉菌 种采用下述步骤得到1)、将赭曲霉原菌种经波长254nm的紫外线照射15min；2)、将步骤(1)得到的赭曲霉菌种加入传代固体培养基，培养基配比蛋白胨、2% 麦芽糖、2%葡萄糖、2%琼脂，调节pH至5. 3，并在条件为25 30°C，培养7 10天，经三 代传代得到三代赭曲霉菌种，5°C以下低温冷冻储存；3)、配置液体培养基，其配比为葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母浸膏1%，玉米浆1%，调 节pH至5. 8，并灭菌，按7%的接种量接种三代赭曲霉菌种，培养温度控制在28 29°C下， 转速为150r/min，pH控制在5 6之间，培养时间20 26小时。
全文摘要
本发明公开了一种11α羟基坎利酮的合成方法，该方法是将坎利酮、丙二醇和吐温80加热溶解配制成底物加入到培养基中，并投入赭曲霉菌种发酵，发酵完成后，再从菌丝体提取精制得到11α羟基坎利酮；本发明采用生物合成技术，遴选出新型转化酶，从而大大降低11α羟基坎利酮的成本。该新型转化酶对坎利酮的专一性从以前的75％提高到现在的85％以上；坎利酮的投料浓度从0.6％提高到0.8％以上；11α羟基坎利酮收率从50％提高到现在的60％以上；11α羟基坎利酮主要质量指标达到含量(HPLC)≥98％，总杂质≤2.0％，单一杂质峰≤1.5％。
文档编号C12R1/66GK101845474SQ20101017849
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者王喜情 申请人:台州南峰药业有限公司