专利名称：：一种筛选香型水稻的方法和分子标记的引物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学和遗传学领域，具体为筛选香型水稻的方法和分子标记的引物，用于辅助常规育种选育香型水稻。
背景技术：
：香米在蒸煮中会产生特别的香气因而受到消费者的青睐。香型稻米价格比非香型稻米高出许多，使其在国际稻米贸易中占有特别重要的地位。随着人们生活水平的提高，目前市场对香米需求量日益增加，由此也促进了香型水稻的遗传和育种研究。尽管过去人们对于稻米香味遗传研究结果存在分歧，但多数学者认为稻米香味是由一个隐性主基因控制的(闵绍揩等，水稻育种学，中国农业出版社，1996,322-353)，并位于第8号染色体上(Aha等，TheorApplGenet,1992,84:825_828；Garland等，TheorApplGenet,2000,101:364_371Jin等，PlantSci,2003,165:359_364；Cordeiro等，MolBreed,2002,9(4):245_250;Chen等，PlantSci2006，171:505_514;Li等，MolPlantBreed,2006,454-58)。还有报道显示，水稻香味与一种香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-Acetyl-l-pyrroline，简称2-AP)密切相关(Lorieux等，TheorApplGenet,1996,931145-1151;Yoshihashi等，JFoodSci,2002,67:619_622;Chen等，Plantcell,2008,201850-1861)。目前生产上使用的香型水稻一般产量都较低，而且抗病性也较差。如果能够将高产、抗病与稻米具有香味这些性状结合在一起，是许多水稻育种家们一直追求的育种目标。目前对于新香型水稻常规育种，大多都先将香型水稻与具有多种有利性状的非香型水稻杂交，为了在新培育的香型水稻中含有较多非香型水稻有利性状的遗传组成，往往还需要将香型水稻与高产非香型水稻杂交后代继续与非香型水稻回交数代，然后再进行自交使香味基因等不同基因位点纯合。在这过程中，如何快速、准确、简单地对回交和自交后代水稻是否具有香味基因以及香味基因是否纯合进行鉴定一直是香米育种中的一个难题。在过去的香米育种中尽管已有一些鉴定香味基因的方法被使用，然而当处理大量的样品时这些方法都存在很大的不足，如按照传统的咀嚼米粒方法来判断目标单株是否带有香味基因，不仅因连续品尝舌部易受损害，而且会因味觉灵敏度下降而产生误判，致使含有香味基因的优良杂合个体在多代的选择过程中被淘汰，最终导致香味基因的丢失；化学方法即KOH浸泡法常被利用(董彦君等，种子，1992(3)24-27;Sood等，IndianJGenetPlantBreeding,1978,38:268_271)，但是这种方法对人的嗅觉系统有很大的损害；近年来利用气相色谱-质谱联用仪(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)直接测量2-AP含量以检测香米的方法也被利用(Niu等，BMCPlantBiology,2008,8100-130；Fitzgerald等，PlantScience,2008，175:539_546)。虽然它是一种非常直接和客观的测定方法，但是这种方法费时并且非常的昂贵。在最近几年，随着分子生物学技术的发展，使分子标记辅助选育香稻成为可能。1992年Ahn等人在第8号染色体上发现一个和水稻香味密切连锁的RFLP标记RG28。Lorieux等(TheorApplGenet,1996,93:1145_1151)通过遗传作图的方法确认RG28和水稻香味密切相关，并且计算它们之间的遗传距离为5.8cM。Garland等(TheorApplGenet,2000，101364-371)在前人工作的基础上建立了基于PCR技术的连锁性分子标记RG28，同时他们利用RG28进行香稻辅助育种。也有其他研究者曾利用与香米基因连锁的标记对香米进行辅助选择(Cordeiro等，MolBreed,2002,9(4):245_250；李金华等，分子植物育种，2006,4(1):54-58)。利用香米基因连锁标记的筛选方法在一定程度上提高了选择的速度，且操作简单。但是这些标记都只是与香米基因的连锁标记，彼此之间还有一定的遗传距离，在对杂交后代的筛选中，也有可能会因目的香味基因与标记之间存在一定遗传距离而发生交换，导致对后代筛选中存在一定的误差。对于香米分子标记鉴定，最理想和有效的方法是直接检测香米基因。Bradbury等人于2005年以Kyeema水稻(一种长谷粒茉莉花香型澳大利亚水稻品种)为材料首次报道了第8号染色体上编码甜菜碱乙醛脱氢酶2基因(Badh2/badh2)与水稻香味直接相关。Bradbury等人发现在badh2第7外显子有8个碱基的缺失和3个核苷酸的多态性(Bradbury等，PlantBiotechnolJ,2005,3(3):363_370)。有学者认为，位于非香型水稻第8号染色体上的Badh2编码的甜菜碱乙醛脱氢酶2通过消耗GABalcK香味物质2-AP的前体)致使水稻无香味。当Badh2发生突变，产生不完整的甜菜碱乙醛脱氢酶2，该酶失去原有功能，无法消耗GABald，从而增加了2-AP的积累，使稻米出现香味(Chen等，Plantcell,2008,20:1850_1861；Bradbury等，PlantMolBiol,2008,68:439_449)。由于水稻香味和甜菜碱乙醛脱氢酶2基因突变直接相关，因此甜菜碱乙醛脱氢酶2基因又可被称为香味基因。已有文献报道显示，水稻香味与水稻甜菜碱乙醛脱氢酶2基因(Badh2/badh2)外显子编码链序列直接相关，正常的甜菜碱乙醛脱氢酶2基因(Badh2)外显子碱基突变后(badh2)导致甜菜碱乙醛脱氢酶2失去原有的功能，使香味物质2-AP的前体物质积累，引起香味物质2-AP含量急剧增加，使水稻表现香味。在Bradbury等人2005年报道中，还根据甜菜碱乙醛脱氢酶2基因(Badh2/badh2)在非香稻与香稻第7外显子之间核苷酸差异，设计了两对引物，用于辅助育种(Bradbury等，PlantBiotechnolJ，2005，3(3):363_370)。在Bradbury等人之后，王丰等人根据香味基因与非香味基因比较在第7外显子编码链上缺失8个核苷酸序列特点，在甜菜碱乙醛脱氢酶2基因出现8个核苷酸序列缺失的两端设计了一对引物，用于香味基因型鉴定(王丰等，中国水稻科学，2008，22(4)347-352)。同年，王军等人采用与王丰等人相同的设计思路，也在甜菜碱乙醛脱氢酶2基因编码链上出现7个或8个核苷酸序列缺失的两端，设计了两对能够鉴定香味基因型的引物(王军等，分子植物育种，2008，6(6):1209-1212)。由于王丰等人和王军等人都是根据香味基因与非香味基因编码链上缺失7个或8个核苷酸序列设计引物，对于PCR扩增对应产生的香味基因和非香味基因产物长度之间只有7个或8个核苷酸序列差异，因此在进行电泳检测PCR产物时，都是使用比琼脂糖凝胶电泳检测操作复杂和麻烦许多的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。而且，前人在设计引物时都只注重了对香稻和非香稻香味基因外显子之间的差异性进行筛选，即只根据编码链之间的差异性区分香和非香型水稻。对于真核生物基因，除了作为编码链的外显子之外，还有内含子序列、3’与5’UTR区、启动子区等非编码序列。自1977年发现内含子以来，对作为真核生物基因组主要成员的内含子功能的研究越来越受到人们的关注。近年来人们对内含子的功能提出许多新的见解，其中最重要的一个方面是内含子在基因表达调控中起着重要的作用。综合前人研究显示，内含子作为增强子、弱化子、静息子等对基因表达具有增强、抑制、双向(正、负)调节、似反义RNA等不同的调节作用(邱晓云等，国外医学遗传学分册，1996，19(1)44-48)。本实验室最近两年从美国、日本、泰国和我国不同地区收集了近30个香稻品种。在鉴定所收集香稻的香味基因(badh2)核苷酸突变位置时发现，有些香稻品种甜菜碱乙醛脱氢酶2基因的突变发生在第7外显子，有些香稻品种甜菜碱乙醛脱氢酶2基因的突变发生在第2外显子；同时还发现了一种外显子编码区、3’和5’UTR区无突变，而在第2内含子和第4内含子核苷酸序列突变情况却与编码链有突变的香型水稻基本相同的香稻品种(南海318)。通过品尝和KOH处理米粒的分析发现，南海318米粒也具有香味，但比一般香稻稍淡。在克隆了约1.3kb南海318水稻甜菜碱乙醛脱氢酶2基因启动子序列后进行了测序分析，结果显示影响启动子功能的保守序列也与非香型水稻日本晴完全相同。结合前人报道(Chen等，Plantcell,2008,20:1850_1861)和本实验室对多种香稻序列分析的研究显示，不论突变发生在编码区的哪个外显子或编码区外显子无突变，在香型水稻badh2的第2内含子和第4内含子中都各有一个区域的核苷酸序列分别表现出缺失和插入的变异现象在香稻中具有共性，尤其在第2内含子中都会涉及两个碱基序列TT的缺失以及在第4内含子中都会涉及插入一段较长的TA重复序列。由此表明，目前存在于香稻甜菜碱乙醛脱氢酶2基因内含子中明显突变的序列在进化中具有一定的保守性。在进一步研究后证实，南海318水稻米粒具有香味与第2和第4内含子存在变异的甜菜碱乙醛脱氢酶2基因(badh2)有关。由此表明，badh2内含子在香味形成过程中也可能具有重要的作用。因此在利用分子标记辅助筛选香型水稻育种中，对于扩增分子标记的引物设计，既要考虑甜菜碱乙醛脱氢酶2基因外显子编码序列，同时也应该考虑在香型水稻之间具有共同突变的内含子突变位点。
发明内容本发明的目的提供一种筛选香型水稻分子标记的引物。本发明还提供了一种筛选香型水稻的方法，快速并准确鉴定香味基因。一组筛选香型水稻分子标记的引物M7，用于鉴定香味基因，包括以下四个序列的引物(1)与香型水稻badh2的第4内含子反义链同源配对的香味等位基因正义引物序列(FS):aggaatatatatatatatatatatatataatg；(SEQIDNo.1)(2)与香型水稻badh2的第7外显子正义链同源配对的香味等位基因反义引物序列(FN):accataggagcagctgaaatatatac；(SEQIDNo.2)(3)与非香型水稻Badh2的第2内含子反义链同源配对的非香味等位基因正义引物序歹丨J(nFS):gcgcaacaacaagtgtatattgttt；(SEQIDNo.3)(4)与非香型水稻Badh2的第7外显子正义链同源配对的非香味等位基因反义引物序歹丨J(nFN):gcagctgaagccataatctttttac；(SEQIDNo.4)。一种筛选香型水稻的方法，包括以下步骤(1)提取水稻总DNA作为模板(可采用CTAB法或SDS法)，加入上述的四种引物进行PCR扩增；(2)取PCR产物进行凝胶电泳检测。PCR扩增的方法为93°C95°C预变性46分钟；93°C95°C变性2040秒，54°C56°C退火2040秒，71°C73°C延伸2040秒，共3640个循环；最后71°C73°C延伸812分钟。所述的香型水稻为甜菜碱乙醛脱氢酶2基因第7外显子有突变类型的香型水稻。约780bp条带对应香味等位基因的PCR产物，约2100bp条带对应非香等位基因PCR产物。上述方法可用于筛选鉴定甜菜碱乙醛脱氢酶2基因第7外显子突变的香型水稻与非香型水稻杂交后代、甜菜碱乙醛脱氢酶2基因第7外显子突变的香型水稻与非香型水稻杂交后的自交后代，或者甜菜碱乙醛脱氢酶2基因第7外显子突变的香型水稻与非香型水稻杂交后又与非香型水稻回交的后代。如模板总DNA由纯合香型水稻提取，扩增产物只有约780bp条带。如模板总DNA由非香型水稻提取，扩增产物只有约2IOObp条带。如模板总DNA由香型与非香型水稻杂交后代的杂合子水稻提取，约780bp条带和2100bp条带两种扩增产物都具有。如模板总DNA由香型水稻与非香型水稻杂交后又与非香型水稻回交的后代水稻提取，只有约2100bp条带的为无香味基因纯合植株；同时具有780bp和2100bp两个条带的为香味基因杂合类型植株。如模板总DNA由香型水稻与非香型水稻杂交后的自交后代水稻提取，只有约780bp条带的为香味基因纯合植株；只有约2100bp条带的为非香味基因纯合植株；同时具有780bp和2100bp两个条带的为香味基因杂合类型植株。本发明的引物是根据香型水稻与非香型水稻香味基因本身的序列差异设计的，该组引物可从明确功能的DNA序列上扩增获得PCR产物，不同于一般的连锁性分子标记，而且本发明设计的引物，既涉及了香型水稻香味基因的外显子编码序列，同时也涉及了香型水稻香味基因之间具有共同突变的内含子位点。该组引物的使用只适合以下两种情况以badh2第7外显子突变类型香稻品种作为香源水稻，在进行香型水稻新品种培育过程中，获得进行辅助筛选的分子标记；对不同香稻品种进行badh2是否属于第7外显子突变类型的香稻的鉴定。以前也有学者利用香型水稻与非香型水稻甜菜碱乙醛脱氢酶2基因(badh2/Badh2)之间的序列差异设计功能性引物，但是他们都只注重badh2/Badh2编码序列间差异进行引物设计，没有考虑香味基因和非香味基因内含子序列的差异性。基因内含子对基因的表达也有重要的影响，因此本发明设计的分子标记同时考虑了外显子和内含子两个方面。本发明设计的功能性分子标记，分别位于香味基因和非香味基因编码链和内含子中两者有差异的序列，筛选含有香味基因的准确率可以达到100%。对以第7外显子突变类型香稻为香源培育新型香稻过程中，利用本发明设计的引物进行辅助选择含有香味基因的植株，有利于提高选择效果，同时还能够对育种过程的后期形成的自交后代香味基因是否呈纯合状态进行鉴定，从而快速有效地实现育种目标。在利用本发明设计的引物辅助进行新型香稻选育中，可以在待测水稻植株生长的任何一个时期取任何一个部位作为材料，如叶片、或茎、或根等提取少量总DNAJf7FS/7FN/7nFS/7nFN四个引物同时放在一个PCR管里进行扩增反应，然后再利用操作简便的琼脂糖凝胶电泳检测就能够很快地将所需要的单株挑选出来。本发明克服了目前香稻育种中使用品尝方法或与香味基因连锁标记筛选可能存在的选择失误和偏差，或通过嗅出KOH处理后稻米是否有香味时可能对人的嗅觉造成伤害，或利用设备检测会需要昂贵的设备购置及检测费用，或利用只是将香稻甜菜碱乙醛脱氢酶2基因外显子上编码链核苷酸序列与非香稻之间的差异性作为选择引物，而没有同时考虑该基因外显子编码链以及内含子核苷酸序列与非香稻之间的差异作为选择的引物，有可能导致因忽略甜菜碱乙醛脱氢酶2基因内含子在决定稻米香味表现上的作用，从而有可能导致出现筛选出的后代香味程度降低及偏差等方面的不足，实现对含有香味基因筛选的简便、快速和有效性，同时还能够对育种过程的后期形成的自交后代香味基因是否呈纯合状态进行鉴定。图1为三种水稻甜菜碱乙醛脱氢酶2基因分别在第2、第4内含子和第7外显子主要差异序列比较图。其中W香99075为香型水稻，261S和日本晴为非香型水稻。箭头位置显示2对引物分别与香型水稻W香99075及非香型水稻甜菜碱乙醛脱氢酶2基因结合位点及PCR扩增方向，阴影表示差异位点，数字表示该核苷酸在甜菜碱乙醛脱氢酶2基因中的位置，起始密码子的第一个核苷酸定为+lbp。图2为实施例1香稻品种W香99075和非香稻品种以及W香99075与非香水稻杂交F1植株香味基因鉴定图。其中第一泳道为标准分子量DNA；第2泳道为香稻品种W香99075植株PCR扩增产物，分子量约780bp；第3泳道为非香稻品种261S植株PCR扩增产物，分子量约2IOObp；泳道4为香稻品种W香99075与非香水稻杂交F1植株PCR扩增产物，分子量分别为约780bp和2100bp。图3为实施例2中非香水稻品种与W香99075香稻品种杂交后代F1植株与非香水稻回交一代植株PCR检测分析图。其中M为标准分子量DNA;124为回交一代植株。只有约2IOObp—条带对应于回交后代非香纯合植株PCR产物，具有约780bp和2IOObp两条带对应于回交后代香味基因杂合植株PCR产物。图4为实施例2中W香99075香稻品种与非香稻品种杂交F1植株自交得到的F2后代植株香味基因分离分析图。图中M为标准分子量DNA;146为非香稻品种与香稻品种杂交后代F2植株，只有约780bp—条带对应于自交后代香型纯合植株PCR产物，只有约2IOObp—条带对应于自交后代非香纯合植株PCR产物，具有约780bp和2IOObp两条带对应于自交后代香味基因杂合植株PCR产物。具体实施例方式香味基因为第7外显子突变类型香关。可采用CTAB法或SDS法提取总DNA。PCR扩增反应程序为94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，共38个循环；最后72°C延伸10分钟。实施例IW香99075香型水稻和261S、日本晴非香型水稻及杂交水稻的甜菜碱乙醛脱氢酶2基因(badh2/Badh2)的克隆和分析首先采用分子生物学常规方法，分别以W香99075和261S作为香型和非香型水稻为例，克隆了这两种水稻的甜菜碱乙醛脱氢酶2基因(badh2/Badh2)，并进行了测序分析，同时查看了已公布在Genbank中非香型水稻日本晴的甜菜碱乙醛脱氢酶2基因序列(AP004463)。比较香型水稻W香99075与非香型水稻261S及日本晴的badh2/Badh2序列，W香99075与非香型水稻之间的差异主要位于三个区段，除了作为编码链的第7外显子有差异夕卜，在第2内含子和第4内含子也存在差异。W香99075相对于非香型水稻在第7外显子主要存在不连续的8个碱基缺失和一个核苷酸差异，在第2内含子主要存在连续的两个TT缺失和T-C的单核苷酸改变，在第4内含子中主要存在一段TATATATA插入和A-T核苷酸变化，如图1所示，箭头位置显示2对引物分别与香型水稻W香99075及非香型水稻甜菜碱乙醛脱氢酶2基因结合位点及PCR扩增方向，阴影表示差异位点，数字表示该核苷酸在甜菜碱乙醛脱氢酶2基因中的位置，起始密码子的第一个核苷酸定为+lbp。进一步分析其他香稻甜菜碱乙醛脱氢酶2基因时发现，有些香稻品种的编码链碱基突变发生在第7外显子，也有些香稻品种甜菜碱乙醛脱氢酶2基因的突变发生在第2外显子，还有的在编码链中无碱基突变现象，但是在第2内含子中的TT缺失以及在第4内含子中的一段较长的TA重复序列插入变异现象在香稻中却具有共性。根据甜菜碱乙醛脱氢酶2基因序列在香型水稻与非香型水稻之间的差异，我们在属于第7外显子突变的香型水稻和非香型水稻badh2/Badh2第2内含子、第4内含子和第7外显子处，设计了两对引物，作为香型水稻育种鉴别香味基因或非香味基因功能性分子标记的引物(即M7:7FS/7FN/7nFS/7nFN)，为以下序列(1)香味等位基因正义引物序列(FS)，与香型水稻badh2的第4内含子反义链同:aggaatatatatatatatatatatatataatg(2)香味等位基因反义引物序列(FN)，与香型水稻badh2的第7外显子正义链同:accataggagcagctgaaatatatac(3)非香味等位基因正义引物序列(nFS)，与非香型水稻Badh2的第2内含子反义Iill^liJmS^tgcgcaacaacaagtgtatattgttt(4)非香味等位基因反义引物序列(nFN)，与非香型水稻Badh2的第7外显子正义链同源配对:gcagctgaagccataatctttttac用上述两对引物，分别以香型水稻W香99075、非香型水稻261S以及W香99075与261S杂交获得的F1植株总DNA为模板，进行PCR扩增，然后电泳分析鉴定，如模板总DNA由纯合香型水稻提取，扩增产物只有约780bp条带；如模板总DNA由非香型水稻提取，扩增产物只有约2100bp条带；如模板总DNA由香型与非香型水稻杂交获得的杂合子水稻提取，约780bp条带和2100bp条带两种扩增产物都具有。结果如图2图中第一泳道为标准分子量DNA；第2泳道为香稻品种W香99075植株PCR扩增产物，分子量约780bp；第3泳道为非香稻品种261S植株PCR扩增产物，分子量约2100bp；泳道4为香稻品种W香99075与非香水稻杂交F1植株PCR扩增产物，分子量分别为约780bp和2100bp。用PCR常规方法进行扩增，在灭菌后的PCR管添加如下成分及用量(总体系为50μ1，在冰上进行PCR体系的配制)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>扩增完成后取8μ1PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。结果发现，这两对引物能够很好地区分出香型水稻W香99075、非香型水稻以及W香99075与非香型水稻杂交获得的F1植株和F1植株与非香型水稻回交获得的后代植株香味基因的组成，也能够从W香99075香稻品种与非香稻品种杂交F1植株自交得到的F2后代植株中有效地鉴定出香味基因是否还存在，以及是否呈纯合或杂合的状态。将本发明设计的两对引物，分别对20多种香稻植株总DNA进行PCR扩增反应。结果显示，对属于甜菜碱乙醛脱氢酶2基因第7外显子突变类型的香稻能够快速被鉴定出来。因此充分说明，本发明设计的两对引物能够快速、有效地用于香型水稻新品种的辅助选育中。实施例2上海市闵行区农科所于2000年利用261S与W香99075杂交成功培育了二系杂交晚粳“闵优香粳”杂交稻。该品种具有省肥稳产高产的特点，一般每亩有效穗18-19万，每穗总粒数145粒左右，结实率90%，谷粒呈椭圆形，千粒重高达28.5g，米饭有清香气味，产量在2001和2002年上海市水稻区试中名列前茅(陆玉其等，上海农业科技，2004，(3):38)。“闵优香粳”米饭有清香气味主要是其父本“W香99075”是一个常规香稻。由于母本261S稻米无香味，因此，根据香米基因遗传特点，在“闵优香粳”杂交稻中只有1/4稻谷具有香味，所以，“闵优香粳”米饭的清香气味较淡。比较“闵优香粳”杂交稻两个亲本261S和W香99075单株分蘖数，平均分别为9和11，尽管26IS比W香99075稍少，但26IS穗型明显大于W香99075，261S每穗颖花数约比W香99075多50%。我们曾经将261S与多个分蘖数同W香99075相当，同时穗型较大的常规稻杂交，并观察F1植株的杂种优势现象。尽管结果显示261S与许多常规稻杂交配合力都较好，有些组合产量明显高于“闵优香粳”，但由于父本不是香稻，这些组合后代稻米也无香味。而且观察现有香稻品种，主要都是一些穗型相对较小的类型。因此，从目前现有状况分析，无法快速获得产量高于“闵优香粳”的淡香型两系杂交稻，也无法快速培育稻谷全香类型的二系杂交稻。但是，如果能够成功培育出大穗型香型两系不育系，将为完成如上两种杂交稻的培育奠定了基础。纯合香稻遗传组成可用aa表示，正常的非香型两系不育系261S水稻遗传组成可用AA表示。大穗型香型两系不育系水稻培育过程主要为先以非香型两系不育系261S水稻(AA)为母本，香型水稻(aa)为父本进行杂交，杂交后的F1植株遗传组成为Aa，再以F1植株为父本，与两系不育系261S(AA)回交，回交一代植株香味基因位点遗传组成分别为AA和Aa0在回交一代植株中选取株高、分蘖数等性状都与两系不育系261S水稻相似的单株并取叶片，利用本发明设计的两对引物对选出的回交一代植株进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，含有香味基因杂合后代呈现约780bp和2100bp两个条带，无香味基因纯合后代只有约2100bp—个条带，如图3所示(M为标准分子量DNA;124为回交一代植株。约780bp条带对应香味等位基因的PCR产物，约2100bp条带对应非香等位基因PCR产物。只有约2100bp条带，为无香味基因纯合植株；同时具有780bp和2100bp两个条带，为香味基因杂合类型植株)。从中选取含有两个PCR扩增条带、同时农艺性状也尽量与261S水稻相像的植株，继续与非香型两系不育系261S水稻(AA)回交，回交第二代植株香味基因位点遗传组成同样是AA和Aa。再利用本发明设计的两对引物对回交第二代植株进行PCR扩增，同样将含有香味基因及农艺性状与261S水稻相像的杂合子水稻再与非香型两系不育系261S水稻回交获得回交第三代植株。同样的操作再获得回交第四代植株。261S属于两系不育系水稻，在上海5月20日前后播种种植，大约在8月底至9月初盛花，并表现雄性不育。在上海7月10日前后播种种植，大约在9月22日至9月28日盛花，部分雄性恢复育性，能够自交结实。因此，在培育大穗型香型两系不育系水稻时，获得第1次杂交和回交植株的亲本种植可以在上海5月中下旬播种种植。其他回交种子培育的亲本在上海均于7月10日前后播种种植，或冬季于12月初播种种植于海南省。在上海5月20日播种种植的回交第四代植株在种植期间，取叶片进行香味基因鉴定。在开花前，对含有香味基因单株穗子进行套袋。水稻成熟后，从含有香味基因植株和261S对照植株中各随机选取5个单株进行株高、分蘖数、套袋结实率和平均每穗颖花数记录和统计分析。经统计分析显示，回交四代单株和261S水稻株高差异不显著；两类植株套袋都没有种子。这说明，含有香味基因回交四代植株与261S水稻相同，在上海5月20日播种种植，能够表现雄性不育现象；两类植株分蘖数以及平均每穗颖花数的统计分析显示也都不存在显著性差异(表1)。在上海7月10日播种种植的回交第四代植株种植期间，也取叶片进行香味基因鉴定。水稻成熟时，田间观察含有香味基因回交四代植株，大多性状也都已经与261S对照非常相似。随机选取7月10日播种种植、并含有香味基因回交四代单株和261S对照单株，计算自交结实率。经统计分析，两类植株自交结实率也无显著差异(表1)。再将含有香味基因的回交第四代植株进行自交2代，利用本发明设计的两对引物对自交植株进行PCR扩增，从中获得香味基因位点为纯合的大穗型香型两系不育系水稻。表1含有香味基因两系不育系株系和261S对照植株主要农艺性状比较<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>还可用本方法从W香99075香稻品种与非香稻品种杂交F1植株自交得到的F2后代植株中有效地鉴定出香味基因是否还存在，以及是否呈纯合或杂合的状态，如图4所示。图4中M为标准分子量DNA；146为非香稻品种与香稻品种杂交后代F2植株，约780bp条带对应香味等位基因的PCR产物，约2100bp条带对应非香等位基因PCR产物。从凝胶电泳图像上观察到的三种类型扩增产物可推测F2植株香味基因的状态只有约780bp条带，为香味基因纯合植株；只有约2100bp条带，为非香味基因纯合植株；同时具有780bp和2100bp两个条带，为香味基因杂合类型。实施例3已有报道显示，江苏等育种单位已成功培育了抗条纹叶枯病高产常规水稻(张大友等，江苏农业科学，2009，5:121-122)，但目前还没有抗条纹叶枯病香型水稻的报道。利用本发明设计的、作为扩增功能性分子标记的引物(M7:7FS/7FN/7nFS/7nFN)的两对引物还能够辅助抗条纹叶枯病高产香型水稻的选育。先将非香型抗条纹叶枯病高产常规水稻(AA)与香型水稻(aa)杂交，再将F1植株(Aa)继续与非香型抗条纹叶枯病高产水稻(AA)回交。利用本发明设计的两对引物对回交一代植株进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果同样显示，含有香味基因杂合后代呈现约780bp和2100bp两个条带，无香味基因纯合后代只有约2100bp—个条带。从中选取含有两个PCR扩增条带、同时农艺性状较好的植株继续与非香型抗条纹叶枯病高产水稻(AA)回交，回交第二代植株香味基因位点遗传组成同样是AA和Aa。再利用本发明设计的两对引物对回交第二代植株进行PCR扩增，同样将含有香味基因的杂合子水稻再与高产非香型水稻回交获得回交第三代植株。采用如上同样的方法获得第四代回交植株。同样将含有香味基因的回交植株进行自交2代，利用本发明设计的两对引物对自交植株进行PCR扩增，选出香味基因位点纯合的植株，再进行条纹叶枯病抗性鉴定，获得抗条纹叶枯病高产香型水稻后代。权利要求一组筛选香型水稻分子标记的引物M7，其特征在于，包括以下四个序列的引物(1)与香型水稻badh2的第4内含子反义链同源配对的香味等位基因正义引物序列，SEQIDNo.1所示的aggaatatatatatatatatatatatataatg；(2)与香型水稻badh2的第7外显子正义链同源配对的香味等位基因反义引物序列，SEQIDNo.2所示的accataggagcagctgaaatatatac；(3)与非香型水稻Badh2的第2内含子反义链同源配对的非香味等位基因正义引物序列，SEQIDNo.3所示的gcgcaacaacaagtgtatattgttt；(4)与非香型水稻Badh2的第7外显子正义链同源配对的非香味等位基因反义引物序列，SEQIDNo.4所示的gcagctgaagccataatctttttac。2.一种筛选香型水稻的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)提取水稻总DNA作为模板，加入权利要求1所述的四种引物进行PCR扩增；(2)取PCR产物进行凝胶电泳检测。3.权利要求2所述筛选香型水稻的方法，其特征在于，所述的水稻为甜菜碱乙醛脱氢酶2基因第7外显子突变的香型水稻与非香型水稻杂交后代、甜菜碱乙醛脱氢酶2基因第7外显子突变的香型水稻与非香型水稻杂交后的自交后代，或者甜菜碱乙醛脱氢酶2基因第7外显子突变的香型水稻与非香型水稻杂交后又与非香型水稻回交的后代。4.权利要求2所述筛选香型水稻的方法，其特征在于，PCR扩增的方法为93°C95°C预变性46分钟；93°C95°C变性2040秒，54°C56°C退火2040秒，71°C73°C延伸2040秒，共3640个循环；最后71°C73°C延伸812分钟。全文摘要本发明公开了一种筛选香型水稻的方法及扩增与稻米香味形成直接有关的甜菜碱乙醛脱氢酶2基因(Badh2/badh2)分子标记的引物。该方法为(1)提取水稻总DNA作为模板，加入分子标记的四种引物进行PCR扩增；(2)取PCR产物进行凝胶电泳检测。本发明可辅助选择含有香味基因的植株，有利于提高选择效果，同时还能够对育种过程的后期形成的自交后代香味基因是否呈纯合状态进行鉴定，从而快速有效地实现育种目标。文档编号C12Q1/68GK101831498SQ20101018108公开日2010年9月15日申请日期2010年5月25日优先权日2010年5月25日发明者于洋,任永刚,张红梅,徐小龙,李建粤,赵国超申请人:上海师范大学