专利名称：一种腈转化酶的高通量筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种腈转化酶的高通量筛选方法。 背景技术：
腈类化合物是重要的医药、农药和精细化工中间体。腈类物质的微生物降解有 氧化、还原和水解等3种途径。后者又可以根据参与水解反应的酶系不同分成两类一是 腈水解酶(nitrilase，Ε. C. 3. 5. 5. 1)，直接将腈水解为羧酸和氨；另一途径是先在腈水合 酶(nitrile hydratase, E. C. 4. 2. 1. 84)的作用下将腈水合生成酰胺，如果微生物中还存 在酰胺酶(amidase，Ε. C. 3. 5. 1. 4)，则在其作用下进一步生成羧酸和氨，反应需两步完成 (BiotechLett. 1994，16 :47_50)，如图 1 所示。目前，腈水合酶(NHase)的工业化应用越来越受到人们的关注。自1980年Asano 发现高NHase活力的微生物Pseudomonas chlororaphis B23，并将其成功应用于丙烯酰胺 的大规模生产以来，NHase这一生物催化领域的分支得以迅速发展，其应用范围扩展至精 细化工产品、医药中间体、农药中间体和化妆品等多个领域，合成的产物已经大大超过100 种，包括脂肪族、环脂肪族、芳香族以及杂环族的酰胺和羧酸。酰胺酶最早发现于1964年，分别是由Kelly和Jakoby在Pseudomonsaeruginosa 和Pseudomonas fluorescens中发现的。酰胺酶的底物范围很广，能够水解各种天然及人 工合成的脂肪族和芳香族酰胺。某些酰胺酶具有很好的立体选择性，在制备手性化合物方 面具有巨大的潜力，正日益受到工业界的重视。腈水解酶能够催化腈水解生成相应的羧酸和氨，1964年由哈佛大学的Thimarm和 Mahadevan从大麦叶子中正式分离得到，并命名为腈水解酶。它能将吲哚-3-乙腈转化为吲 哚-3-乙酸。第一个能产腈水解酶的微生物菌种是由Hook和Robinson利用天然腈化合物 蓖麻碱做为唯一碳源，筛选得到的假单孢菌(Pseudomonas)，该菌水解氰基吡啶的能力比蓖 麻碱高1. 18倍。在此之后利用腈水解酶催化腈水解生产相应羧酸的研究和应用也越来越多.鉴于腈转化酶在工业微生物技术领域的重要性，越来越多的研究集中于产腈转化 酶新菌株的筛选和现有菌株及酶的改良。从自然界的土壤、水体和污泥等环境中，通过传统 方法筛选产腈转化酶菌株效率低，工作量大。另一方面，随着基因工程技术的快速发展，可 供选择的生物催化剂的数量飞速增长。如通过定向(分子)进化技术，由于突变文库包含 的突变体数量巨大(通常含IO4 IO6突变子)，对快速、准确的高通量筛选模型的建立提 出了更为迫切的需求。腈水解酶和酰胺酶由于水解产物均含有氨和羧酸，因此可以通过显 色或荧光检测检测氨或羧酸的生成以构建快速筛选模型。Henke等利用酶催化底物水解所 产生的胺类物质，经衍生化生成容易检出的荧光染料，建立用于筛选以N-酰胺为底物的水 解酶。Duchateau等建立的模型依据碱性环境下氨基酸及其相应的氨基酰胺与Cu (II)形成 的复合物在光谱特性上的差异，用于筛选氨基酰胺酶。Zheng等构建了基于酰基转移反应的 立体选择性酰胺酶筛选模型，用于筛选R-型酰胺酶，制备(S) - (+) -2，2- 二甲基环丙烷甲酰胺。腈水合酶的筛选主要是以GC、HPLC或1hNMR法检测酰胺是否生成，这些方法不仅费时费 力，而且对设备要求高、通用性差。迄今为止，在国内外文献中尚无用于筛选腈水合酶的高 通量快速筛选模型报道，也没有同时可以用于腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶的高通量筛选 的方法报道。
发明内容
为了克服传统的腈水合酶筛选模型在筛选过程中费时费力、对设备要求高、通用 性差等缺点，本发明提供了一种基于络合显色反应的腈转化酶高通量筛选方法，该方法不 仅可用于高通量筛选腈水合酶，而且还可用于酰胺酶和腈水解酶的快速筛选。本发明采用的技术方案是一种腈转化酶的高通量筛选方法，所述腈转化酶为腈水合酶、酰胺酶或腈水解酶， 所述方法包括取待测样品溶于蒸馏水中，加入底物氨基腈类化合物或羟基腈类化合物或 酰胺类化合物、至底物浓度为1 IOOmM,于10 50°C水浴转化反应10 120min，取转 化液，先后添加Fe2+和Fe3+离子水溶液，进行显色反应，添加两种离子的时间间隔为0 lOmin，所加入的底物、Fe2+、Fe3+物质的量之比为1 1 3 1 3;所述氨基腈类化合物为下列之一 α -氨基腈2_氨基-2，3-二甲基丁腈、2-氨基 丁腈、2-氨基丙腈，其他氨基腈β -氨基丙腈、3-氨基丁腈；所述羟基腈类化合物为α -羟基腈，具体为下列之一 2_羟基丙腈、扁桃腈；所述酰胺类化合物为下列之一 2_氨基-2，3_ 二甲基丁酰胺、2-氨基丁酰胺；结果判断添加底物为氨基腈类化合物或羟基类腈化合物时，若转化液先由无色变为浅绿色 再变为黄色则表明被测样品含有腈水合酶，若转化液不发生明显的颜色变化、最终显示黄 色则表明被测样品含有腈水解酶或同时含有腈水合酶和酰胺酶，若转化液先由无色变为浅 黄色再变为蓝色则表明被测样品不含腈转化酶；添加底物为酰胺类化合物时，若转化液不发生明显的颜色变化，最终显示黄色则 表明被测样品含有酰胺酶，若转化液先由无色变为浅绿色再变为黄色则表明被测样品不含 酰胺酶。本发明采用的络合显色反应方法是α -氨基腈或α -羟基腈水溶液先后加入Fe2+ 和Fe3+离子溶液后，发生络合反应，溶液颜色先由无色变为浅黄色再变为蓝色；脂肪族化合 物，同一分子上含有两个氨基的化合物(如氨基酰胺、乙二胺等)的水溶液先后加入Fe2+和 Fe3+离子溶液也会发生络合反应，使溶液颜色先变浅绿色，最后变为黄色；氨基酸水溶液先 后加入Fe2+和Fe3+离子溶液后，不发生明显的颜色变化，最终显示Fe3+离子溶液的黄色。所述的α -氨基腈和α -羟基腈显色机理为α -氨基腈和α -羟基腈在水溶液中的不稳定，容易自发解离产生酮或醛、氢氰酸 禾口氛(Cyanide in biology. Academic Press. London. 1981)，其在水溶液中的解离途径如 图2所示。游离氰离子先后与Fe2+和Fe3+反应，生产不同的产物显示出不同的颜色。翟慕衡(配位化学.安徽安徽人民出版社，2007)等指出亚铁离子溶液加入KCN后，与后者反应产生络离子[Fe (CN)6]4-(氰亚铁酸根)，该离子在水溶液中显黄色；再加入 铁离子后，Fe3+与[Fe(CN)6]4_络离子反应生成Fe4[Fe(CN)6]3沉淀，后者为常用的染料普鲁士蓝。图3进一步阐明了游离氰离子与Fe2+和Fe3+显色反应的机理。
所述的氨基酰胺显色机理为 最外电子层具有(T9 (d5除外)结构的过渡元素离子在水溶液中一般都会显示一定 的颜色。这些离子在水溶液中，都是以水合离子的形式存在，水合离子之所以具有颜色，是 因为其离子存在着未成对的d电子。过渡元素离子在其周围作为配体的水分子的电场作用 下，d轨道产生分裂现象，形成能量不同的高、低两组轨道。当自然光照射水溶液时，水合离 子的未成对d电子吸收一部分光能后，可以从低能量轨道跃迁到高能量轨道，称d-d跃迁。 被吸收的光的补色所呈现出的颜色即为水溶液颜色。亚铁离子溶液加入氨基酰胺如2-氨基-2，3-二甲基酰胺(ADBA)或乙二胺(en) 后，水合配离子([Fe(H2O)6]2+)变成[Fe (ADBA)2]2+或[Fe(en)2]2+0由于ADBA或乙二胺分子 比水分子产生的配位场强度大，配位后使d轨道的分裂能变大，未成对的d电子要吸收更大 的光能量后才能从低能量轨道跃迁到高能量轨道。从而使d电子对可见光的吸收光谱向短 波方向移动，溶液颜色由浅绿色变为蓝绿色。溶液吸收光谱的波长变短引起的颜色变化可 由图4示意。再加入Fe3+后，Fe3+对ADBA或乙二胺的亲和力比Fe2+更强，破坏了 [Fe (ADBA)2]2+ 或[Fe(en)2]2+配离子，从而使颜色变为黄色。相似的反应有(物质的颜色与结构.北京 北京师范大学出版社，1991):绿色的NiCl2溶液加入乙二胺后显色变为深蓝色，再加入Fe3+ 后深蓝色消失，产生黄色沉淀。所述的Fe2+离子水溶液为FeSO4或FeClyjC溶液，浓度为0. 01 1. OM ；所述的Fe3+ 离子水溶液为Fe (NO3) 3或FeCl3水溶液，浓度为0. 01 1. OM0所述显色反应温度为20 40°C，显色反应时间为1 5min。本发明方法不仅适用于未知微生物的筛选，也适用于已知微生物的筛选，也可直 接采用已知或未知的酶作为筛选对象，待测样品可为微生物菌种的菌悬液、也可以是溶解 后的酶液。所述待测样品为微生物菌种的菌悬液时，加入底物进行转化反应后，转化液经 离心，取上清液再进行显色反应。所述的微生物可来自实验室保存的菌种，也可来自各种可 分离到微生物的样品，如果园、农田、化工厂排污口等的土样、水样、污泥和保藏的微生物菌 种。所添加的底物为α -氨基腈，如2-氨基-2，3_ 二甲基丁腈、2_氨基丁腈和2_氨 基丙腈时，所述的转化液先后添加含Fe2+和Fe3+离子的溶液后，若转化液先由无色变为浅绿 色再变为黄色则表明被测样品含有腈水合酶；若转化液不发生明显的颜色变化，最终显示 Fe3+离子溶液的黄色则表明被测样品含有腈水解酶或同时含有腈水合酶以及酰胺酶；若转 化液先由无色变为浅黄色再变为蓝色则表明被测样品不含腈转化酶。所添加的底物为α-氨基腈以外的氨基腈类物质，如β-氨基丙腈、3-氨基丁腈 时，所述的转化液先后添加含Fe2+和Fe3+离子的溶液后，若转化液先由无色变为浅绿色再变 为黄色则表明被测样品含有腈水合酶；若转化液不发生明显的颜色变化，最终显示Fe3+离 子溶液的黄色则表明被测样品不含腈水合酶。所添加的底物为α _羟基腈，如2-羟基丙腈、扁桃腈时，所述的转化液先后添加含Fe2+和Fe3+离子的溶液后，若转化液不发生明显的颜色变化，最终显示Fe3+离子溶液的黄色 则表明被测样品含有腈水合酶或腈水解酶；若转化液先由无色变为浅黄色再变为蓝色则表明被测样品不含腈转化酶。所添加的底物为2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺、2-氨基丁酰胺时，所述的转化液先 后添加含Fe2+和Fe3+离子的溶液后，若转化液不发生明显的颜色变化，最终显示Fe3+离子溶 液的黄色则表明被测样品含有酰胺酶；若转化液先由无色变为浅绿色再变为黄色则表明被 测样品不含酰胺酶。本发明所述的基于络合显色反应的腈转化酶高通量筛选方法的有益效果主要体 现在能够较好地克服传统的基于GC、HPLC或ihNMR的筛选方法存在费时费力、设备要求高 和通用性差等缺点，通过简单的颜色对比即可以快速鉴定所试样品是否存在腈水合酶、酰 胺酶或腈水解酶；具有操作简便、检测快速又经济实惠等优点，为腈水合酶、酰胺酶或腈水 解酶的快速筛选带来了极大的便利。
图1为腈类化合物的两种分解途径；图2为α _氨基腈和α _羟基腈在水中变化途径；(a)自发分解，(b)质子化稳定；图3为氰离子与Fe2+和Fe3+显色反应的机理；图4为吸收光谱波长变短引起溶液颜色变化。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 含2-氨基-2，3-二甲基丁腈水合活力的腈水合酶产生菌的筛选将待筛选的微生物培养后，经离心、生理盐水洗涤，均勻悬浮于蒸馏水中，制备成 OD600 = 10的菌悬液。取5ml该菌悬液置于具塞三角瓶(50ml)中，再放入30°C水浴中预 热5min，添加20μ1 2-氨基-2，3-二甲基丁腈开始反应。15min后取样，IOOOOrpm下离心 5min。取上清液100 μ 1于96孔板中，先后加入浓度为IOOmM的FeSO4和FeCl3水溶液各 100μ 1，观察其颜色变化。先后加入FeSO4和FeCl3水溶液后，上清液先由无色变为浅绿色 再变为黄色的实验组含有腈水合酶。经比色法对照，筛选获得两株红球菌属菌株能催化2-氨基-2，3- 二甲基丁腈水合 反应(Rhodococcus sp. ZJB-09153和Rhodococcus sp. ZA)，并经实验证实，该菌株具有腈水 合酶活力。实施例2 :含β _氨基丙腈水合活力的腈水合酶产生菌的筛选将待筛选的微生物培养后按实施例1的方法制成菌悬液，取IOml该菌悬液置于具塞三角瓶(50ml)中，再放入20°C水浴中预热lOmin，添加30μ1 β-氨基丙腈开始反应。 IOmin后取样，12000rpm下离心4min。取上清液200 μ 1于96孔板中，先后加入浓度为1. OM 的FeCl2和Fe (NO3) 3水溶液各20 μ 1，观察其颜色变化。先后加入FeCl2和Fe (NO3) 3水溶液 后，上清液先由无色变为浅绿色再变为黄色的实验组含有腈水合酶。经比色法对照，实施例1筛选获得的菌种Rhodococcus sp. ZJB-09153、 Rhodococcus sp. ZA和实验室保藏的菌种 Nocardia globerula ZJB-09141 能催化 β -氨基 丙腈水合反应，并经实验证实，该菌株具有腈水合酶活力。
实施例3 含2-氨基丁酰胺水解活力的酰胺酶产生菌的筛选将待筛选的微生物培养后按实施例1的方法制成菌悬液，取7ml该菌悬液置于具 塞三角瓶(50ml)中，再放入40°C水浴中预热4min，添加20 μ 1 2-氨基丁酰胺开始反应。 40min后取样，IOOOOrpm下离心6min。取上清液180 μ 1于96孔板中，先后加入浓度为200mM 的FeCl2和Fe (NO3) 3水溶液各60 μ 1，观察其颜色变化。先后加入FeCl2和Fe (NO3) 3水溶液 后，上清液不发生明显的颜色变化，最终显示Fe3+离子溶液的黄色的试验组含有酰胺酶。经比色法对照，菌种Delftiatsuruhatensis ZJB-05174(CCTCC No :M 205114)能 催化2-氨基丁酰胺水解反应，并经实验证实，该菌株具有酰胺酶活力。实施例4 含2-氨基-2，3- 二甲基丁腈水解活力的腈水解酶产生菌的筛选将待筛选的微生物培养后按实施例1的方法制成菌悬液，取8ml该菌悬液置于具 塞三角瓶(50ml)中，再放入35°C水浴中预热8min，添加30μ 1 2-氨基-2，3-二甲基丁腈 开始反应。30min后取样，12000rpm下离心5min。取上清液150 μ 1于96孔板中，先后加 入浓度为500mM的FeSO4和Fe (NO3) 3水溶液各30 μ 1，观察其颜色变化。先后加入FeSO4和 Fe (NO3) 3水溶液后，上清液不发生明显的颜色变化，最终显示Fe3+离子溶液的黄色的试验组 含有腈水解酶或同时含有腈水合酶和酰胺酶。再按实施例3的方法确认上述试验组含有腈 水解酶还是酰胺酶。经比色法对照，菌种Bacillus subtilis ZJB-063 (CCTCC No :M 206038)能催化 2-氨基_2，3- 二甲基丁腈水解反应，并经实验证实，该菌株具有腈水解酶活力。实施例5 含扁桃腈水解酶活力的腈水解酶产生菌的筛选将待筛选的微生物培养后按实施例1的方法制成菌悬液，取IOml该菌悬液置于具塞三角瓶(50ml)中，再放入35°C水浴中预热lOmin，添加30μ 1扁桃腈开始反应。30min后 取样，IOOOOrpm下离心6min。取上清液180 μ 1于96孔板中，先后加入60 μ 1浓度为200mM 的FeCl2和Fe (NO3) 3水溶液各60 μ 1，观察其颜色变化。先后加入FeCl2和Fe (NO3) 3水溶液 后，上清液不发生明显的颜色变化，最终显示Fe3+离子溶液的黄色的试验组含有腈水解酶 或同时含有腈水合酶和酰胺酶。再按实施例3和4的方法确认上述试验组含有腈水解酶还 是酰胺酶。经比色法对照，菌种Alcaligenes faecalis ZJUTB10 (CCTCC No :M208168)能催化 扁桃腈水解反应，并经实验证实，具有腈水解酶活力。
权利要求
一种腈转化酶的高通量筛选方法，所述腈转化酶为腈水合酶、酰胺酶或腈水解酶，所述方法包括取待测样品溶于蒸馏水中，加入底物氨基腈类化合物或羟基腈类化合物或酰胺类化合物、至底物浓度为1～100mM，于10～50℃水浴转化反应10～120min，取转化液，先后添加Fe2+和Fe3+离子水溶液，进行显色反应，添加两种离子的时间间隔为0～10min，所加入的底物、Fe2+、Fe3+物质的量之比为1∶1～3∶1～3；所述氨基腈类化合物为下列之一2-氨基-2，3-二甲基丁腈、2-氨基丁腈、2-氨基丙腈、β-氨基丙腈、3-氨基丁腈；所述羟基腈类化合物为下列之一2-羟基丙腈、扁桃腈；所述酰胺类化合物为下列之一2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺、2-氨基丁酰胺；添加底物为氨基腈类化合物或羟基类腈化合物时，若转化液先由无色变为浅绿色再变为黄色则表明被测样品含有腈水合酶，若转化液不发生明显的颜色变化、最终显示黄色则表明被测样品含有腈水解酶或同时含有腈水合酶和酰胺酶，若转化液先由无色变为浅黄色再变为蓝色则表明被测样品不含腈转化酶；添加底物为酰胺类化合物时，若转化液不发生明显的颜色变化，最终显示黄色则表明被测样品含有酰胺酶，若转化液先由无色变为浅绿色再变为黄色则表明被测样品不含酰胺酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的Fe2+离子水溶液为FeSO4或FeCl2水溶 液，浓度为0. 01 1. OM ；所述的Fe3+离子水溶液为Fe (NO3)3或FeCljK溶液，浓度为0. 01 1. OM0
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述显色反应温度为20 40°C，显色反应时 间为1 5min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待测样品为微生物菌种的菌悬液，加入 底物进行转化反应后，转化液经离心，取上清液再进行显色反应。
全文摘要
本发明提供了一种腈转化酶的高通量筛选方法，所述方法包括取待测样品溶于蒸馏水中，加入底物氨基腈类化合物或羟基腈类化合物或酰胺类化合物、至底物浓度为1～100mM，于10～50℃水浴转化反应10～120min，取转化液，先后添加Fe2+和Fe3+离子水溶液，进行显色反应，所加入的底物、Fe2+、Fe3+物质的量之比为1∶1～3∶1～3，添加两种离子的时间间隔为0～10min，根据溶液颜色变化进行判断所含腈转化酶的种类。本发明所述的基于络合显色反应的腈转化酶高通量筛选方法，能够较好地克服传统筛选方法的缺点，通过简单的颜色对比即可以快速鉴定所试样品是否存在腈水合酶、酰胺酶或腈水解酶，具有操作简便、检测快速又经济实惠等优点，为腈水合酶、酰胺酶或腈水解酶的快速筛选带来了极大的便利。
文档编号C12Q1/34GK101838681SQ20101018727
公开日2010年9月22日 申请日期2010年5月31日 优先权日2010年5月31日
发明者戴昌龙, 林志坚, 沈寅初, 郑仁朝, 郑裕国, 雷利华 申请人:浙江工业大学