专利名称：一个棉花体细胞胚发生受体类激酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个棉花的体细胞胚发生类受体激酶，命名为GhSERKl，及其编码基因序列。本发明还涉及含有该基因的表达载体，以及利用该基因培育的转基因植株。
背景技术：
植物胚胎发育生物学的范畴广义地说包含着花的形成，雌雄配子体的发生，配子 的形成，受精与亲和性，以及果实，种子等孢子体形成过程中结构与功能的关系，形态建成 的生理与分子基础，以及遗传信息展现的时空顺序等生殖发育的多个方面(唐锡华等， 2001)。目前，已在植物的花萼、花瓣、花药、花柱和子房等生殖器官的细胞组织中检测到 了一些特异蛋白质，这些蛋白质是植物细胞在不同的生殖发育时期特异基因的表达产物， 被认为与各个时期细胞的功能或组织的形态建成密切相关。花粉发育是一个复杂交错的过 程。在花粉粒释放时许多反应都达到最大量。影响花粉发育的不同阶段的突变体已研究了 很多。许多已报道的花粉败育突变体都是由于孢子体突变，比如花药的药室内壁或绒毡层， 因为花药中壁细胞和孢子细胞间的互作对于小孢子和花粉粒成熟都起着重要的作用。Schmidt等在胡萝卜(Daucus carota)中寻找能够监测悬浮细胞培养体细胞 向胚性细胞转变的标记基因时发现的一段cDNA克隆，氨基酸顺序以及激酶体外分析表 明，该基因编码一种亮氨酸重复受体类激酶LRR-RLK(Schmidt等，2001)。随后体细胞 胚发生相关类受体蛋白激酶(SERK)基因相继地在拟南芥、水稻等多种植物中克隆和表 达，并被证实是植物界中广泛存在的结构保守基因家族。SERK基因不仅在胚性组织中 表达，还在非胚性组织中表达，参与了植物胚胎发育、雄性发育、病害防御和信号传导等 活动。目前研究发现SERK基因的表达参与下列过程首先，SERK可标记有胚胎发生能 力的细胞无论是DcSERK、AtSERK还是MtSERK，研究表明SERK是胚胎发生细胞的一个 很好的标记。与其它标记如单克隆抗体JIM8、JIM13以及同功酶、酯酶等相比，SERK在 培养条件下显得具有非常的独特性，能够显示其它标记所不能显示的被标记细胞与细 胞成胚能力之间的关系(Schmidt ED, 1997 ；Thomas TL，1993 Jianru Ζ, 2002) 其次， SERK 参与油菜素类固醇(brassinosteroid, BR)信号转导(Russinova E 等，2004) BR参与了包括植物生长发育、抵抗逆境等许多生理活动。目前已鉴定BR信号转导的部 分组分，如 BRIl(BR insensitive 1)、BAKl(BRI1-associated receptor kinase 1)、 BIN2 (BR-insensitive2)、BESl (BRI 1-EMS-suppressor lprotein,即 BIN2 底物 1 蛋白)、 BZRl (brassinazoleresistantl protein,即BIN2底物2蛋白)等，各组分的功能和相互 之间的关系也已有了解。BAKl是一种SERK蛋白，等同于AtSERK3。遗传和生化实验证明， BAK1/BRI1复合物引发BR信号。AtSERK3 (BAKl)的一个作用可能是通过改变质膜与胞内体 中BRIl的平衡介导BR信号(Rumyana K等，2006)。第三，SERK参与植物病害防御=LRR-RLKs 参与植物抗病反应的报导较多，如Xa21基因参与了水稻抗白叶枯病反应。OsSERKI属于 LRR-RLKs之一，不仅能被稻瘟菌侵染诱导表达，还参与了水稻抗稻瘟菌的反应。水稻受稻瘟菌侵染后，OsSERKl被诱导表达，且它的表达量与水稻的抗病性有定性关系(Song WY等，1995 ；Staskawicz BJ等，1995)。最后，SERK参与孢子体发育目前，有报导称拟南芥serkl 或serk2的单突变体不能引起孢子体发育的任何异常表型，但serklserk2双突变体导致孢 子体发育不完全或雄性不育。serklSerk2双突变体的造孢细胞产生小孢子母细胞只能进 行减数分裂到四分体时期，随后母性细胞消失，导致雄性完全不育(Catherine A等，2005)。 Tean等观察到SerklSerk2双突变体的造孢细胞的外层细胞只能发育成3层细胞，缺乏野生 型的绒毡层细胞，使孢子体不能正常发育成成熟的花粉粒，这与emsl/exs和tpdl突变体表 型相似。SerklSerk2双突变体的不育性可通过用野生型花粉粒恢复，且产生的种子可以正 常发育。然而目前尚未见SERK基因在重要经济作物棉花中的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供棉花GhSERKl基因的基因组序列，全长cDNA序列与氨基 酸序列，它们分别为序列表中SEQ ID NO1、2、3 所示。本发明的另一个目的是提供棉花GhSERKl基因的开放读码框序列，为序列表中 SEQ ID NO 4 所示。本发明的再一个目的是提供棉花GhSERKl基因的表达载体pK7GGS11683 (CGMCC No 3879)，以及这个表达载体上所含有的cDNA序列，它为序列表中SEQ ID NO 5所示。同 时用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。含有该发明GhSERKl基因的表 达载体和细胞系，以及含有该类基因的植物品系种均为本发明的保护范围。本发明还有一个目的是所述的表达载体可通过使用农杆菌侵染，花粉管通道，基 因枪转化等导入植物细胞，可使用本发明的方法转化的植物宿主包括单子叶植物和双子叶 植物，例如棉花、水稻、小麦、玉米、油菜、甘蔗、黄瓜、苜蓿等。
图1表示利用简并引物扩增棉花基因组DNA获得的GhSERKl基因的DNA片段的电 泳图。图2表示含有GhSERKl基因组DNA的BAC克隆酶切图。图3表示GhSERKl编码基因开放读码以cDNA为模板PCR扩增结果的琼脂糖电泳 图。图4为GhSERKl基因基因组结构(包含预测的转录起始位点)。图5为GhSERKl基因外显子与内含子结构示意图。图6为GhSERKl基因全长cDNA中5，UTR,开放读码框(CDS)与3，UTR结构示意图。图7为GhSERKl蛋白跨膜结构域预测示意图。图8为GhSERKl蛋白结构域示意图。图9为在雄性不育系和可育系与生殖发育相关组织中，GhSERKl基因的表达差异。图10为转GhSERKl基因表达载体(pK7GGS11683与pK7GGS17016)的构建过程示意图。
图11为转表达载体pK7GGS17016棉花的PCR鉴定。图12为转表达载体pK7GGS11683棉花的PCR鉴定。图13为转表达载体pK7GGSl 1683棉花的花器官表型图。图14为转表达载体PK7GGS17016棉花的花器官表型图。
具体实施例方式实施例1棉花GhSERKl编码基因的克隆材料与方法1)棉花材料棉花材料选用自选品种Y18R。2)菌种大肠杆菌 E. coli DH5 α。3)载体pMD18_T、pK7GWIWG2 (I)。4)工具酶和修饰酶各种限制性内切酶和修饰酶购自TaKaRa公司、NEB公司及 Fermentas 公司。5)化学试剂化学药品均为国内外分析纯。6)引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。下述实施例中所有方法如无特别说明均为常规方法。实施例1，棉花GhSERKl基因的克隆(1)棉花基因组的制备采用改良CTAB法提取陆地棉品种Y18叶片部位的基因 组，用于PCR;1)提取液配制IL 提取液含Tris_HCl (PH8. 0)0. IMEDTA (PH8. 0)0. 02MNaCl1. 5MPVP40 (w/v)2%CTAB (w/v)2%以上溶液各自溶解后混合，定容到IL ；临用前加2% β-巯基乙醇。2)称取0. 3g幼嫩棉花叶片放入2mL离心管里，加入钢珠，液氮速冻后，放置于 Genegrid研磨仪上振荡30s，加入ImL预热65°C提取缓冲液。颠倒混勻。3)将溶液置于65°C水浴中40分钟；加等体积氯仿异戊醇(24 1，V/V)振 荡混勻，4°C离心机12000rpm离心10分钟，将上清转移到另一离心管中，用氯仿异丙醇 (24 1，V/V)再抽提一次，离心收集上清；4)加入0. 6倍体积的冰预冷的异丙醇，缓慢颠倒离心管混勻，室温静置30min。用 毛细管将絮状DNA挑出，或者直接室温12000rpm离心10分钟，用70%的酒精洗涤1_2次， 再用100%酒精洗涤1次，室温干燥DNA。5)加 200 μ L TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, ΡΗ8. 0)或者纯水(ddH20)，室温放置 1小时，或者65°C水浴使DNA完全溶解；6)加入20ul无DNA酶的RNA酶水(10mg/mL)，37°C保温1小时，用等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1，V/V)抽提1 2次，将上清转移到另一个离心管中；7)加0. 1倍体积的3M NaAc (PH5. 2)，2倍体积的冰预冷的无水乙醇，混勻后放置5分钟。缓缓水平转离心管5分钟，此时将于界面处形成一团粘稠透明的絮状沉淀用毛细管轻轻钩出，转移到1. 5ml的离心管中；或者直接12000rpm离心10分钟，沉淀DNA。8)加lmL70%的酒精洗涤沉淀，IOOOOg离心10分钟，去掉上清，再用70%、100% 的酒精各洗沉淀一次，在空气中使核酸沉淀干燥；9)用50ul的TE重新溶解沉淀，于_20°C或_70°C贮存。结合生物信息学获取SERK基因保守片断EST序列根据GenBank库SERK基因结 构特点，结合保守结构域序列设计2条简并引物上游引物5，CAGTTTCARACHGARGTDGAG3，下游引物5，ATGTTTGCWGCTTTYACRTC3，(M =AorC ；K =GorT ；W =AorT ；R =AorG ；Y =CorT ；S =CorG ；D =AorGorT ；H =AorCorT ；N AorCorGorT)扩增获得一个目的扩增结果，大小为1500bp，回收后与pMDIS-T载体连接、16°C过 夜，转化受体菌DH5 α，菌液PCR及酶切鉴定正确的菌株送测序。(图1中，M =Marker, 1，，2， 3,4,5分别是GhSERKl以棉花基因组DNA为模板PCR扩增获得1. 5Kb片段)在已知序列的基础上，设计特异引物上游引物5‘ CAGTTTCAGACAGAAGTAGAG3 ‘下游引物5‘ ATGTTTGCTGCTTTCACATC3 ‘筛选棉花Y18基因组BAC文库，获得阳性克隆后(图2中，1 =Marker, 2 箭头所指 为阳性BAC克隆插入片段大小)，测序获得GhSERKl的全长基因组序列，为序列表中SEQ ID NO :1 (图4 为利用Softberry软件分析获得GhSERKl基因基因组结构，包含预测转录起始 位点后GhSERKl基因全长为6920bp ；其中⑶S表示外显子，共11个外显子，10个内含子； TSS表示预测的转录起始位点，转录起始位点TSS至ATG为453bp ；图5为GhSERKl基因中 外显子与内含子的位置及相对片段长度，其中方框为外显子，直线为内含子，共6467bp ；)。3) GhSERKl全长cDNA序列的获得采用3，RACE 和 5，RACE 的方法得到 了 GhSERKl 全长 cDNA 序列，3，RACE 和 5，RACE 按TaKaRa公司的3，RACE和5，RACE试剂盒说明操作。具体方法包括以下步骤1、总RNA的提取1)将0. 2g冷冻的材料放入预冷的研钵中，研磨成粉状，倒入2mL离心管中，加ImL 预热至80°C的基本提取液，10 μ 1 DTT贮备液和25 μ 1蛋白酶K贮备液，混勻；2) 420C，IOOrpm,温和摇动 90 分钟；3)每管加入80 μ 1 2mol/L KCl溶液，调整KCl终浓度至160mmol/L，冰浴1小时；4) 12，OOOrpm离心 20 分钟，取 900 μ 1 上清液，加入 300 μ 1 8mol/L LiCl，混勻，冰 上过夜沉淀；5) 12，OOOrpm离心20分钟，弃上清，沉淀用2mol/L LiCl (冰预冷)洗2 3次，直
至上清液无色；6)悬浮 LiCl-RNA 沉淀于 400 μ 1 10mmol/L Tris-Cl (ρΗ7· 5)，混勻，12，OOOrpm 离 心10分钟，转移上清至新离心管中；7)加入1/10体积的2mol/L KAc (ρΗ5· 5)，混勻，冰浴15分钟；
8) 12，OOOrpm离心10分钟，除去盐不溶性物质，取上清；9)用2. 5倍体积的无水乙醇于_20°C沉淀过夜或_70°C沉淀2 3小时；10)用70%冷乙醇洗涤RNA沉淀，真空快速干燥，溶于DEPC水中；11)力卩 RNase-Free DNase, 37°C, 30 分钟；
12)加等体积的氯仿异戊醇抽提；13)用2. 5倍体积的无水乙醇于_20°C沉淀过夜或_70°C沉淀2 3小时；14)用70%乙醇洗涤沉淀，干燥；15)将RNA溶于DEPC处理的水中备用。2、第一链cNDA的合成用东洋纺公司的ReverTra Ace- α -反转录酶试剂盒，按试 剂盒说明书进行操作反应体系RNA (1-5 μ g)11. 0μ 1RNase Inhibitor (IOU/μ 1)Ι.ΟμΙ5 X RT buffer4. 0 μ 1dNTP Mixture(IOmmo1/L each)2. 0 μ 1AMV Oligo (lOpmol/μ 1)1· 0 μ 1ReverTra Ace_1. 0 μ 1total20. 0μ 1反应条件42°C，20min；99°C，5min ；4°C，5min ；瞬间离心，_20°C保存。3、设计引物进行3，RACE和5，RACE用于3' RACE 引物3， Primer 5 ‘GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG 3，3’ Nested Primer 5 ‘CGCTACGTAACGGCATGACAGTG 3’3' RACE fpl 5' -CCTCCTTTTGTACCACCACCGCC-3‘3' RACE fp2 5' -CGCCAATTTCTTCTCCAAGTGGG-3‘用于5，RACE的特异引物5’ Primer 5 ‘ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3‘5' Nested Primer 5' -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3‘5' RACE rpl 5' -GTCCAAGATGAACTTCTGGGTCCTC-3‘5' RACE rp2 5' -AATTCTTGAGGTTTCCGCCGACGCC-3‘将扩增出的DNA片段用1 %的琼脂糖胶分离、回收并连接到pMDIS-T easy Vector，转化Ε. coli DH5 α，酶切鉴定正确后送华大基因测序，利用生物软件Vector9. 0、 Conting对获得的序列进行拼接，获得基因的全长cDNA序列，为序列表中SEQ IDNO :2，根据 BLAST的分析结果，因为与拟南芥的SERKl基因相似性最高，因此命名为GHSERK1。(图6为 GhSERKl基因全长cDNA结构，其中5，肌1 为42牝？，开放读码框(CDS)为1884bp，3，UTR为 194bp ；)根据获得的序列设计引物扩增其开放读码框cDNA序列，3'端引物为fp2，5'端 引物为rp2，为方便鉴定，在其5'端引物加入HindIII酶切位点，在其3'端引物加入SalI 酶切位点rp2 5' -CGCAAGCTTATGGAAGGAAGCAAAAAGG-3‘
fp2 5' -CGCGTCGACCCTTGGACCGGATAACTCAAC-3'PCR反应体系cDNAΙ.ΟμΙ反应buffer (IOX)5. O μ 1dNTP(2. 5mmol/L each)4. O μ 1fp2(10yM)1. Ομ 1Γρ2(10μΜ)1. Ομ 1Taq 酶(2· 5υ/μ 1)1. 25μ 1ddH.O_36. 75 μ 1total50. Ομ 1反应条件:95°C,5min；95°C，30 秒；55°C，45 秒；72°C，2min30s ；35 个循环；72°C, 5min ；4°C，pause。反应结束后，对PCR产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图 3所示(泳道M为marker，泳道1为GhSERKlRT-PCR产物得到分子量约为1. 8kb的条带)， 与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收该片段，然后将该回收片 段与pGEM-T Easy (Promega公司)载体进行连接。连接体系PCR 回收产物3. 0μ1pMD18-TΙ.ΟμΙT4DNA LigaseΙ.ΟμΙ反应buffer (10Χ)Ι.ΟμΙddH20_4. 0μ 1total10. 0μ 116 °C保温过夜。用上述连接产物转化大肠杆菌T0P10感受态。将重组体系加入感受态细胞溶液 中，轻轻混勻，置冰上30分钟。在42 °C下热激处理90秒，立即置冰上，冰浴2分钟。加 入500 μ 1 LB液体培养基，37 °C摇床180rpm，培养45分钟，然后涂布在有氨苄青霉素 (50mg/L)的LB固体培养基上，倒置培养37°C过夜，筛选阳性克隆，得到重组质粒命名为 pGEMTGSl⑶S(CGMCC No 3878)。以该载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷 酸序列测定。最后获得GhSERKl基因的开放读码框序列，为序列表中SEQ ID N0:3，根据开 放读码框序列推测出其蛋白序列为序列表中SEQ ID NO :4。(图7 为根据GhSERKl基因的 氨基酸序列预测的跨膜结构域，其中胞外结构域1_241位氨基酸；跨膜结构域242-264位 氨基酸；胞内结构域265-627位氨基酸；图8为GhSERKl蛋白结构域示意图，其中外显子1 编码信号肽(signal peptide, SP)；外显子2编码亮氨酸拉链结构(leu zipper, ZIP)；外显 子3 6编码5个富亮氨酸重复序列(leu-rich repeat, LRR)，其中除外显子4编码LRR2 和LRR3外，其他每一个外显子编码一个LRR ；外显子7编码含SPP(Ser-Pro-Pro)基序的富 脯氨酸结构域；外显子8编码跨膜结构域(transmembrane region, TM)；外显子9 11编 码胞内激酶活性结构域。)实施例2GhSERKl基因在棉花中的表达特性分析1，模板制备采用改良的热硼酸法(上文已述)，从棉花两个雄性可育系(Y18与P30B)和一个雄性不育系(P30A)的与生殖发育相关的组织花蕾(6个发育时期 2-day-old, 5-day-old, 7-day-old, 11-day-old, 14-day-old, 18-day-old,以 i @ 3mm 的 花蕾作为现蕾第一天)，花萼，花瓣，花药，胚珠中提取总RNA，其中与可育系Y18与P30B 相比，雄性不育系P30A的表型雌蕊正常发育，而花粉完全败育。提取的RNA质量由OD26tl/ OD280比值和0. 7%琼脂糖凝胶电泳鉴定。以其为模板按下列方案进行逆转录反应在一 个PCR小管中加入2yg总RNA和IyL Oligo (dT) 1(1，65°C温育lOmin，然后迅速置于冰上 2min，再力口入 5 XMMLV (RNase H free) Buffter 5 μ L, dNTP (25mmol/L) 5 μ L, Ribonuclease Inhibitor 20U, MMLV 200U，最后用 Nuclease free 水补充至总体积 25 μ L，42 °C 温育 90min, 72°C lOmin, 95°C水浴 5min 灭活匪LV，得到的 cDNA_20°C保存备用。2，模板cDNA的相对定量及内标引物的设计根据棉花延伸因子基因EFl α的序列 信息，内参引物设计如下GhEFl α fp 5' -GCGATCTGGTAAGGAGCTTG 3‘GhEFl α rp 5' -GGAGAAGGTTTCCACAACC-3‘以棉花cDNA做模板，用该引物进行PCR扩增。PCR 反应体系模板 1 μ 1，PCR Buffer 5 μ 1, IOmMdNTP 3 μ 1, GhEFl α fp 1 μ 1, GhEFl α rp 1 μ 1，Taq IU，ddH20 8 μ 1。PCR 条件94 °C，2min ；94 °C，30Sec ；55 °C，30Sec ；72 °C，30Sec ；30cycle ；72 "C, lOmin。根据PCR产物的电泳结果对模板cDNA进行稀释，调整模板cDNA的用量，直到 GhEFl α fp和GhEFl α rp引物扩增出的DNA条带的量基本一致，使每微升溶液中模板cDNA 的含量基本一致。3)荧光定量PCR分析根据内参基因EFla所设计的引物GhEFl a fp和GhEFl a rp，以及GhSERKl基因的 特异引物SPl 5' -GTTGGCCGAGAGATGGGATG-3‘SP2 5' -ATGCGGACTGGGCTTACAGG 3‘以棉花两可育系(Y18与P30B)和一个不育系(P30A)上述与生殖发育相关的组 织cDNA为模板PCR扩增，每个样品设置3次重复。实时定量PCR扩增体系反应体系如下 cDNA模板0. 2μ L、10y L 2 X SYBR Green I MIXUOymol Γ1 正向引物 0. 4 μ L、10 μ mo 1 L-1 反向引物0. 4μ L，加水到总体积20 μ L0 PCR程序94°C预变性5min ； 94 °C 30s, 59 °C 30s， 721308，44个循环；72151^11，41保存。SYBR Green I染料购买于Toyobo公司，实时荧 光定量PCR仪选用MJ公司的PTC-200，BIO-RAD公司的Chromo4软件收集数据。参考Jiang 等(2007年)所描述的方法用2_Δ Δετ法处理GhPG2基因在各个组织之间相对表达的CT值。 (图9 中，FB =Flower Bub (花蕾)；S印als (花萼)；Petal (花瓣)；Anther (花药)；Ovule (胚 珠))3，结合棉花发育特点，荧光定量结果表明1)在花蕾发育的前三个时期，P30A的花萼与花瓣原基正常分化，此时P30A中 GhSERKl基因表达与可育系相同，呈递增趋势；2)在花蕾发育的第四期至第五期，此时正值棉花雄蕊分化与发育。根据细胞学形态观察，P30A雄蕊中绒毡层发育异常，而此时GhSERKl基因表达下降；
3)到第六期，花蕾已进入雌蕊分化与发育阶段，此时GhSERKl基因表达上升。4)P30A成熟花药中GhSERKl基因的表达明显低于P30B。其成熟花萼，花瓣和胚珠与P30B的相近。结论=GhSERKl与棉花的生殖发育相关，而且可能参与花粉的绒毡层发育。实施例3、棉花GhSERKl植物表达载体的构建利用Invitrogen公司的GATEWAY系统构建植物表达载体，选择GhSERKl中两个 cDNA片段，它们分别为序列表中SEQ IDNO :5、6。分别命名为1683和7016，其中片段1683和 7016是SERK基因保守结构域的两个部分。将它们分别与pMD18-T连接，命名为pMDGS11683 与pMDGS17016，分别与入门载体pD0NR211进行BP重组反应，将它们重组到pD0NR211上。BP重组体系pMDGS11683orpMDGS170161.0μ 1(50 IOOng)pD0N0R221 (30 50ng)0. 5 μ 1BP enzyme MixΙ.ΟμΙddH20_2. 5μ 1total5. 0μ 125°C保温 1 小时，加 1 μ 1 Proteinase K，37°C，IOmin 终止反应。将重组产物转化大肠杆菌T0P10感受态，经卡那筛选得到阳性克隆，将重组子命 名为 pD0NR211-1683 与 pD0NR211-7016。提取阳性克隆质粒pD0NR211-1683 与 pD0NR211-7016 (统称 pD0N0R221_GhSERK)， 利用LR重组反应将它们分别重组到植物表达载体pK7GWIWG2(I)上。LR重组体系pD0N0R221-GhSERK 质粒(50 IOOng)1. 0 μ 1pK7GWIWG2 (I) (30 50ng)0. 5 μ 1LR enzyme Mix0. 5 μ 1ddH,0_0. 5μ 1total2. 5μ 125°C保温 1 小时，加 1 μ 1 Proteinase K，37°C，IOmin 终止反应。用上述重组体系转化大肠杆菌T0P10感受态，经壮观霉素筛选得到阳性克隆，将 重组子命名为 PK7GGS11683 (CGMCC No 3879)与 pK7GGS17016。(图 IOEntry Clone (入门 载体)pD0NR211-1683, pD0NR211-7016 ；Destination Vector (表达载体):pK7GWIWG2 (I)； Gene =GhSERKl中两个cDNA片段，分别命名为1683和7016 ；Binary Vector (双元载体) PK7GGS11683，pK7GGS17016。)实施例4、棉花GhSERKl转基因棉花的筛选与获得1、棉花GhSERKl植物表达载体转化棉花用gene pulser Xcell电转仪(美国Bio Rad公司)并参照说明书进行操作，将 质粒PK7GGS11683与pK7GGS17016用电击转化法转化农杆菌LBA4404，经含利福平和壮观霉 素的抗性平板进行筛选得到农杆菌阳性克隆，再利用喷施农杆菌法，在上述阳性克隆农杆 菌的介导下将PK7GGS11683与pK7GGS17016转化棉花。
2、抗性筛选转基因植株喷施农杆菌法转化后收到的种子，播种于大田中，培养到幼苗长出8-10片真叶且较粗壮时喷施卡那霉素，可发生显色反应的为阳性植株。同时剪取叶片，提基因组DNA鉴定 是否为转基因株系，鉴定正确的转基因株系记为Tl代转基因材料。3、转基因棉花的PCR鉴定1)棉花基因组DNA的提取上文已详述。2)转基因植株的PCR鉴定以步骤1基因组DNA为模板，上游引物1683-sp :5， -GAATGCTGGAAGGTGATGGG-3，；7016-sp :5， -TTGCGTTGGGATCTGCTAGG-3，；下游引物5，-CCATAGGGGTTTAGATGCAACTG-3，；用PCR的方法对转基因植株进行鉴定，其中上游引物根据所选择的棉花SERKl cDNA片段序列设计，下游引物根据植物表达载体PK7GWIWG2 (I)载体序列设计。PCR反应体系基因组DNAΙ.ΟμΙ反应buffer (IOX)2. 0 μ 1dNTP(2. 5mmol/L each)1. 6μ 1上游引物(10μ Μ)0. 5μ 1下游引物(10μ Μ)0. 5μ 1Taq 酶(2· 5υ/μ 1)0. 5 μ 1dd Η,Ο_13. 9μ 1total20. 0μ 1反应条件:95°C,5min；95°C，30 秒；58°C，45 秒；72°C，2min30s ；35 个循环；72°C, 5min ；4°C，pause。反应结束后，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图11， 12所示(图11 泳道1-9为转质粒pK7GGS17016的株系，10为阳性质粒pK7GGS17016，11为 野生型，M为marker ；图12 泳道1_8为转pK7GGS11683的株系，9为阳性质粒pK7GGS11683， M为Marker，10为野生型植株，11为无模板对照)所有转基因株系的扩增条带与阳性质粒 扩增条带大小一致，与预期大小相符，而野生型则没有扩增条带，表明目的基因成功转入棉 花中。4、转表达载体pK7GGS11683与pK7GGS17016棉花的花器官表型分别含有干扰载体pK7GGS11683与pK7GGS17016的转基因棉花花器官的表型为 雌蕊发育正常，但雄蕊中无花粉粒，即出现雄性完全败育的现象(图13 左面为野生型的花 器官，右面为转表达载体PK7GGS11683棉花的花器官；图14 左面为野生型的花器官，右面 为转表达载体PK7GGS17016棉花的花器官)。结合实施例2的结果，说明=GhSERKl基因与棉花生殖发育相关，而且在雄蕊发育 中起重要作用。
权利要求
一个棉花体细胞胚发生相关类受体蛋白激酶基因GhSERK1，它的氨基酸序列如SEQ IDNO4所示。
2.一个棉花体细胞胚发生相关类受体蛋白激酶基因GhSERKl，其基因组碱基序列如 SEQ IDNO 1 所示。
3.一个棉花体细胞胚发生相关类受体蛋白激酶基因GhSERKl，其开放读码框(CDS)碱 基序列如SEQ ID NO 3所示。
4.一个棉花体细胞胚发生相关类受体蛋白激酶基因GhSERKl，其干扰载体 PK7GGS11683 上含有的 GhSERKl 序列如 SEQ ID NO 5 所示。
5.根据权利要求2或3提供的核苷酸序列片段所构建的表达载体，其特征在于含有 任选权利要求2或3所述的其中之一核苷酸片段的表达载体。
6.根据权力要求5所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为植物表达载体 pK7GGS11683(CGMCC No 3879)。
7.含有权利要求5、6所述表达载体的转基因细胞系。
8.一种培育转基因植株的方法，其特征在于将权利要求5、6所述的植物表达载体导 入植物细胞，获得的转基因植株。
9.根据权力要求8所述的方法，其特征在于所述被转化的目的植物为单子叶植物或 双子叶植物，如水稻、小麦、棉花、玉米、拟南芥、油菜或大豆等。
全文摘要
本发明公开了一个新棉花体细胞胚发生相关受体类激酶GhSERK1，及其编码基因与应用。它的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示；其编码基因的基因组序列分别如SEQ ID NO1所示；其编码基因的cDNA序列如SEQ ID NO2所示；其开放读码框序列为序列表中SEQ ID NO4所示。本发明还公开了该基因(GhSERK1)在棉花雄蕊发育中起重要作用的特性。该基因对培育雄性不育植物品种提供基因源，对培育植物雄性不育系具有重要的意义。
文档编号C12N15/63GK101824421SQ20101019047
公开日2010年9月8日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者张锐, 石雅丽, 郭三堆 申请人:中国农业科学院生物技术研究所;郭三堆