专利名称：基于PCR扩增的DL2000中DNA小片段制备模板p1251及其制备体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和基因工程研究领域中电泳耗材DNA分子量标准制备方 法的创新。具体地说，本发明以一种专有的PCR模板设计，建立了全新的基于PCR扩增方法 的DL2000DNA marker小片段的制备体系。
背景技术：
DNA分子量标准是指一组分子量已知的DNA分子的混合物，电泳后按照其分子量 的大小和迁移率的不同，在凝胶上形成一个DNA片段分布的梯度(ladder)，用以指示电泳 过程中未知DNA样品的分子量。目前，DNA分子量标准多是购自生物公司；同时由于其应用 的普遍性和必要性，为了节约开支，很多实验室都自己制备常用的分子量标准。国内市场 上的DNA分子量标准从最初的以进口产品为主、到目前以国产产品为主和许多自制品的出 现，其神秘的面纱正在慢慢退去。按照DNA分子量标准制备所涉及的关键技术(过程)，其 制备方法可以分为限制性内切酶酶切和PCR扩增两种方法；其中限制性内切酶酶切的DNA 分子的来源又可以分为天然的基因组DNA和人工构建的质粒载体；PCR扩增又可分为单片 段的扩增和多片段的扩增。1.通过限制性核酸内切酶酶切制备DNA分子量标准利用DNA分子中存在的限制性内切酶酶切位点(天然的或人为加入的)，采用合 适的内切酶对其进行消化，从而形成一组分子量各异的DNA片段，用来作为DNA分子量标 准。按照被消化DNA的来源可以分为两种天然来源的特种DNA(如基因组)和人工构建的 质粒DNA。天然来源的基因组DNA的限制性内切酶酶切是通过分离某种来源的基因组DNA 分子，然后用一种或几种限制性内切酶进行消化，从而产生一系列的DNA片段组合，目前最 常见的此类DNA分子是Lamda噬菌体的基因组DNAU DNA)，由其产生的DNA分子量标准有 XDNA/Hindlll，λ DNA/EcoRI+HindIII等，也可以是某种具有多个常见酶切位点质粒，如 pBR322DNA/AluI marker 和 pBR322DNA/BsuRI (HaeIII)marker，但是所用的内切酶都是不 常用的，因而成本较高。人工构建载体(质粒)的限制性内切酶酶切是通过一次性把所需 要的各种DNA片段克隆到高拷贝数的载体上，转入大肠杆菌，通过发酵培养和质粒DNA的分 离纯化，经过适当的酶切即可以获得大量的目标DNA片段。这种方法的优势在于通过大肠 杆菌的发酵扩增质粒获得目的DNA片段，其制备规模很容易放大(50升的发酵体系很容易 建立，而PCR扩增一般只能在小于500微升的体系内进行)，获得的DNA片段条带在凝胶上 条带锐利，过程重复性高。不存在PCR扩增再现性不好的缺点。但是由于DNA小片段分子量 小，电泳时条带相对于高分子量的DNA大片段非常弱，所以上述重组载体不适用于制备DNA 小片段。这是利用重组载体制备各种DNA marker体系中存在的明显缺陷。目前各种DNA 小片段的制备主要以PCR扩增的方法为主。2.通过PCR扩增制备DNA分子量标准由于PCR(Polymerase Chain Reaction)技术强大的DNA片段的扩增能力，同时由于目前Taq DNA聚合酶工程菌株的广为流传，目前利用PCR方法生产DNA分子量标准不存在 技术问题，成本主要是引物合成和dNTP的购置，其他PCR试剂如Taq DNA聚合酶，模板DNA， 反应Buffer等均可自制。由于生产效率低，浓度强度高，因而限制了其大规模的制备和应用。长期以来，分子生物学试剂与基因工程研究领域缺少作为PCR模板用的复合重组 载体设计方案和一种用于DL2000 DNA marker中DNA片段扩增的专用载体，以及与之相应 的制备体系；以克服普通PCR扩增产生DNA片段生产效率低，劳动强度高等缺陷；从而能够 快速、大规模的地生产DNA分子量标准DL2000中的DNA小片段。
发明内容
经过长期的实验室研究，本发明恰恰满足了上述需求，设计并重组构建了用作PCR 扩增的模板P1251，并建立了相应的DNAmarkerDL2000中DNA小片段的制备体系，恰恰满足 了上述需求；其目的在于提供了一种DL2000中DNA小片段PCR扩增的模板pl251。本发明的进一步目的在于提供一种利用上述模板P1251通过PCR扩增和酶切相 结合的方法制备DL2000中DNA小片段的体系。为了实现上述目的，本发明提供的制备用模板P1251是一种专门用于DNAmarker DL2000中DNA小片段制备用的PCR扩增模板；其图谱如附图1所示，其中含有3个重组DNA 片段(100bp、250bp、IOObp)，每条片段两端均有两个EcoRI酶切位点，三条重组DNA片段的 结构为:E100E250E100Eo本发明中DNA marker DL2000的PCR扩增模板pl251的构建方法，包括如下步骤分别以拟南芥基因组DNA为模板，利用PCR的方法扩增获得了如下DNA片段100E、 E250E、E100bp，其中100E的3，末端、ElOO的5，末端，以及250bp的两个末端带有EcoRI限 制性内切酶的位点。三种DNA片段经EcoRI酶切后，以一种“顺序连接”的方式进行连接， 然后以末端引物PF、PR对连接产物进行扩增，筛选获得100-250-100bp连接产物。同时为 其末端添加TA克隆中所需要的突出端A’(腺嘌呤核苷酸)；将上述连接产物TA克隆到克 隆载体pGEM-T easy中，即得到设计模板pl251。制备DL2000中所需的DNA小片段的制备体系为以pl251为模板，在其两端序列(100-250-100bp)两侧选择合适位点作为引物位 点，PCR 扩增可获得如下复合产物100/250/500- [l00-250-100| -100/250/-500/ 共九种 PCR 产物，经EcoRI酶切后，所得产物均为100、250或500bp，均可作为DL2000中的小片段。PCR 产物的组合可以调节100、250、500bp三种DNA片段之间的相对数量比例。本发明提供的PCR模板载体pl251是一种专门用于DL2000小片段制备用的PCR 扩增模板；通过灵活的引物位点选择，可以特异性的以复合体的形式扩增DNA小片段100、 250和500bp ；所获得的PCR产物经过EcoRI的酶切可以释放目标DNA片段。本发明的有益效果在于设计了一种PCR扩增模板pl251，其中含有由4个EcoRI酶切位点分隔的lOObp、 250bp、IOObp重组DNA片段；以pl251为PCR扩增模板能够以复合体的形式高效制备DL2000 中的DNA小片段片段(通过EcoRI酶切)。与传统的PCR扩增方法相比具有消耗少(如 dNTP、DNA聚合酶、引物、反应缓冲液、实验耗材等)、效率高(多片段的同时扩增)、省时省力等优点。
图1是制备DNA分子量标准DL2000小片段专用的重组PCR模板pl251的图谱。具体实施实例参照附图，本发明提供的pl251是一种专门用于DL2000中DNA小片段制备用的 PCR扩增模板；其中含有由4个EcoRI酶切位点分隔的100bp、250bp、IOObp重组DNA片段， 三条重组DNA片段的结构为E100E250E100E。其DL2000DNA小片段制备体系为以pl251为PCR扩增模板，在其核心序列(100-250-100bp)两侧选择合适位点作 为弓I物序列，扩增可以获得如下类型的PCR产物复合体100/250/500- |l00-250-100| -100/250/500，共 9 种 PCR 产物复合体；每种复合体经EcoRI完全酶切后，所得产物均为DNA marker DL2000中的DNA片段。
权利要求
基于PCR技术的用于DL2000中DNA小片段制备用的PCR扩增模板p1251，其特征在于其图谱中其中含有由4个EcoRI酶切位点分隔的100bp、250bp、100bp重组DNA片段，三条重组DNA片段的结构为E100E250E100E。
2.根据权利要求1所述的基于PCR技术通过模板P1251制备DL2000中DNA小片段的 体系，其特征在于以重组载体P1251为PCR模板，在其核心序列(100-250-100bp)两侧选 择合适位点作为引物序列，扩增可以获得如下类型的PCR产物复合体100/250/500-1100-250-IO^ -100/250/500，共 9 种复合体；每种复合体经 EcoRI 完全酶 切后，所得产物均为 DNA marker DL2000 中的 DNA 片段(100bp、250bp、500bp)。
全文摘要
基于PCR扩增的DL2000中DNA小片段制备模板p1251，其图谱中含有由4个EcoRI酶切位点分隔的100bp、250bp、100bp重组DNA片段，三条重组DNA片段的结构为E100E250E100E。以p1251为PCR扩增模板，在其核心序列(100-250-100bp)两侧选择合适位点作为引物序列，扩增可以获得如下类型的PCR产物复合体100/250/500--100/250/500，共9种PCR产物复合体；每种复合体经EcoRI完全酶切后，所得产物均为DNA marker DL2000中的DNA片段。
文档编号C12N15/10GK101880660SQ20101019781
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者叶春和, 叶春江, 谷劲松 申请人:济南大学