专利名称：文蛤溶菌酶基因及其编码蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学，具体的说是一种文蛤溶菌酶基因及其编码蛋白和应用。
背景技术：
溶菌酶能够催化水解细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰葡聚糖和N-乙酰胞壁酸之间的 β-1，4-糖苷键，从而导致细胞的裂解，达到杀菌的目的。已发现的溶菌酶分为不同的型，在 动物中存在C型(鸡卵清溶菌酶)、G型(鹅卵清溶菌酶)和I型(无脊椎动物型)，其分 布非常广泛。溶菌酶在生物体免疫防御体系中发挥作用，尤其对于缺少获得性免疫的贝类， 在抵御外来细菌入侵时有着举足轻重的作用。另外，也有报道指出溶菌酶可以作为贝类的 一种消化酶，通过分解滤食到的细菌，贝类可以得到自身所需的营养。随着海水养殖行业的发展，养殖环境的污染、养殖病害频发等问题备受人们关注， 传统的利用抗生素控制的办法受到了越来越多的质疑，而且也不适用于开放的海水养殖环 境，开发新的有效的免疫增强剂就成为亟待解决的问题。来源于水产动物本身的溶菌酶作 为一种天然无毒的酶制剂，为这一问题的解决带来了曙光，可以作为备选的新型免疫增强 剂。由于人体细胞没有细胞壁成分，溶菌酶对人体没有毒副作用，对环境的压力也远小于 抗生素。另外，溶菌酶作为一种天然的免疫增强剂、防腐剂、抗菌剂，已经广泛地被应用到食 品、医药卫生和饲料行业中，例如奶粉添加剂、水产品保鲜防腐剂、饲料添加剂、去除原生质 层，等等。其应用前景非常广泛。文蛤是一种在沿海和滩涂地区广泛分布的双壳贝类(Wang et al.，1993)。在我国 沿海，文蛤作为一种重要的经济贝类而被广泛养殖(Liu et al.，2006)。目前，还没有从文 蛤中获得溶菌酶基因的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种文蛤溶菌酶基因及其编码蛋白和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为文蛤I型溶菌酶基因，其是从文蛤中克隆得到的溶菌酶的cDNA序列，该序列全长 552bp，其中完整阅读框441bp，5'非编码区15bp，3，非翻译区96bp，有多聚赖氨酸加尾信 号(AATAA)和多聚赖氨酸尾巴。该基因在文蛤防御中发挥着重要作用，具体为序列表SEQ ID NO. 1中碱基序列所示。所得溶菌酶基因利用PGEX-4T-1表达载体在大肠杆菌BL21中重 组表达了该蛋白，表达产物具有抑菌活性。其编码的蛋白具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，完整编码蛋白含有146个氨 基酸，其中编码序列的1-15个氨基酸为信号肽序列，成熟肽包括131个氨基酸，其中含有14 个半胱氨酸，预测分子量为14. 6kDa。成熟肽具有典型的失稳酶超家族结构域(Destabilase superfamily)。本发明利用构建cDNA文库，采用RACE技术以及体外重组表达技术，克隆到溶菌 酶基因cDNA全长序列。通过PCR技术，扩增编码溶菌酶成熟肽的基因片断并将其克隆到PGEX-4T-1表达载体中，在大肠杆菌中重组表达了该蛋白。重组产物经过GSTrap FF亲和柱 纯化以及凝血酶切掉GST融合蛋白后，获得了溶菌酶重组蛋白，经检测此重组蛋白具有较 高的抑菌活性，能起到天然蛋白的功能，具有大规模生产的可能，可以弥补天然蛋白量低以 致难以满足需要的局限。
图1为本发明实施例纯化的文蛤溶菌酶重组蛋白，其中M 蛋白marker ;1 带有 GST标签的文蛤溶菌酶重组蛋白；2 用凝血酶切下的GST标签蛋白；3 切掉GST标签的文蛤 溶菌酶重组蛋白。图2为本发明实施例获得文蛤溶菌酶重组蛋白对藤黄微球菌(革兰氏阳性菌)的 抑菌效果图。图3为本发明实施例获得文蛤溶菌酶重组蛋白对铜绿假单胞菌(革兰氏阴性菌) 的抑菌效果图。
具体实施例方式下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。实施例1.一种克隆得到的文蛤溶菌酶基因，具有SEQ ID NO. 1所示的序列。本发明中的文蛤溶菌酶的cDNA序列克隆包括下列步骤a)文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化；b)文蛤cDNA文库构建；c)文蛤cDNA文库EST序列的大规模测定；d)文蛤EST序列的同源性分析及溶菌酶基因片段的筛选；e) RACE扩增获得文蛤溶菌酶的全序列以及全序列的验证。具体操作如下1.文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化利用Invitrogen公司的Trizol试剂从文 蛤幼虫中提取总RNA，利用QIAGENE公司的OligotexmRNA纯化试剂盒纯化mRNA。2.文蛤 cDNA 文库构建利用 Stratagene 公司 cDNA Synthesis Kit 和 ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene)进行 cDNA 的合成，双链 cDNA 经末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit对大于IOObp的酶切片段进行回收，与Invitrogen公司Uni-ZAP XR vector 载体连接，利用 Stratagene 公司的ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒进行文库包装，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株从Uni-ZAP XR Vector上体外切割pBluescript成为质粒文库。3.文蛤cDNA文库EST序列的大规模测定文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引 物T3在MegaBACElOOO测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*. abi，abd文 件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*. seq)和质量文件(*. seq. qual)，依据质量 文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数 据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13(准确率大于95% )且长度大于IOObp的序列作为EST数据，具体《基因表达序列标签(EST)数据分析手册》(胡松年 著，浙江大学出版社，2005年)。4.文蛤EST序列的同源性分析及溶菌酶基因片段的筛选将获得的全部有 效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获的Contigs与 Singletons在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析，结果显示在EST序列中发现了与菲 律宾給仔(Venerupis philippinarum)，紫贝台贝(Mytilusgalloprovincialis)禾口长牡贩 (Crassostrea gigas)溶菌酶相似性较高的序列，根据相似性分析结果确定了文蛤溶菌酶 基因的EST序列。5.文蛤溶菌酶基因cDNA全长序列的克隆根据与溶菌酶基因同源的EST序列设 计特异性引物Fl和R1，分别利用载体通用引物T3和T7进行3’和5’末端的扩增。PCR产 物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(Promega，USA)进行PCR产物的回 收和纯化，再与PMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，然后转化大肠杆菌感受态 细胞ToplO，挑选阳性克隆用载体引物M13-47和M13-48进行测序，所得结果经BioEdit软 件拼接，得到文蛤溶菌酶全长序列见SEQ ID NO. 1。所使用的引物序列如下Fl 5’ GCA ACA TGG ACG AGG GAA CGC TT 3'Rl :5，CCA CAG TCA GTC CAG TAT GGT TCC 3，T3 5' ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA 3'T7 :5， TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3，6.文蛤溶菌酶基因cDNA全长的验证在测序拼接的溶菌酶全长序列上设计一对 引物F2和R2以cDNA为模板进行全长的验证。测序以及分析同5.。所使用的引物序列如 下F2 5' ACC GGC ATG ATC AGT TTA ATT G 3'R2 5' AGG AAT GTT ATG TTT ATA CCA T 3'3’ RACE扩增所用反应体系及反应条件25 μ 1反应体系，包含
灭菌超纯水17. 25 μ 1
cDNA文库模板1 μ 1
IOXbuffer2. 5μ 1
MgCl2 (25mM)1. 5μ 1
dNTP(IOmM)0. 5μ 1
Fl(IOyM)1 μ 1
Τ7(10μΜ)1 μ 1
Taq DNA Polymerase(5u/μ 1)0. 25 μ 1
扩增所用PCR反应程序941变性41^11，1个循环；94°C变性50s，57. 5°C退火50s，72°C延伸Imin, 35个循环；72°C延伸IOmin, 1个循环。
5’ RACE扩增所用反应体系及反应条件
25 μ 1反应体系，包含
灭菌超纯水17. 25 μ 1
cDNA文库模板1 μ 1
IOXbuffer2. 5μ 1
MgCl2 (25mM)1. 5μ 1
dNTP(IOmM)0. 5μ 1
引物 Rl (10 μ Μ)1 μ 1
引物 Τ3 (10 μ Μ)1 μ 1
Taq DNA Polymerase(5u/'μ 1)0. 25 μ 1
扩增所用PCR反应程序94°C变性4min，1个循环；94°C变性50s，54°C退火50s，72°C延伸lmin, 35个循环；72°C延伸IOmin, 1个循环；4°C保温。
全长验证的PCR反应体系和反应条件为
25 μ 1反应体系，包含
灭菌超纯水17. 25 μ 1
cDNA文库模板1 μ 1
IOXbuffer2. 5μ 1
MgCl2 (25mM)1. 5μ 1
dNTP(IOmM)0. 5μ 1
引物 F2 (10 μ Μ)1 μ 1
引物 R2 (10 μ Μ)1 μ 1
Taq DNA Polymerase(5u/'μ 1)0. 25 μ 1
扩增所用PCR反应程序941变性41^11，1个循环；94°C变性50s，47. 5°C退火50s，
72°C延伸lmin, 35个循环；72°C延伸IOmin, 1个循环。实施例2.文蛤溶菌酶重组蛋白的获得具体操作如下根据SEQ ID NO. 2对应的cDNA序列，设计含有限制性内切酶BamH I和Sa II酶 切位点的特异性引物LYBamH I-F和LYSal I-R，通过PCR技术扩增编码溶菌酶成熟肽的基 因片段，然后通过酶切将其克隆到PGEX-4T-1表达载体中，转化大肠杆菌BL21，测序确认表 达框正确后，接种阳性克隆到含有氨苄青霉素(100mg/ml)的LB培养基中，37°C振荡培养至 0. D. 600 = 0. 4-0. 6，加入IPTG至终浓度为ImM诱导4小时后离心收集菌体。菌体在冰浴条 件下用超声波200W处理30-60分钟(每次1秒，间隔1秒)。离心去掉上清，沉淀(含有 重组蛋白包涵体)用Buffer A洗3次，Buffer B洗3次，然后加入10_20ml Buffer C在 37度摇床中震荡20-30min，溶解沉淀，将其转移到透析袋中，4度条件下，在梯度尿素透析 液(透析液中分别含4M，2M，0M尿素)中透析，使重组蛋白复性。利用GE公司的GSTrap FF 亲和柱纯化重组产物。最后用凝血酶切掉重组产物中带有的GST融合蛋白标签，得到文蛤 溶菌酶的重组蛋白，参见图1。利用Bio-Rad公司试剂盒采用Bradford检测原理测得文蛤 溶菌酶重组蛋白溶液的浓度为0. 2-0. 3μ g/μ 1。扩增所使用的引物序列如下LYBamH I-F 5 ’ AGCGGATCCGCCAGCGTAGAGAAGAGAG 3 ’LYSal I-R :5’ CGCGTCGACTTAATGAACATTACTGCATC 3’反应条件为94°C预变性5分钟；然后进行35循环包含94°C变性30秒，60°C退火 30秒，72°C延伸30秒；最后72°C延伸10分钟。反应体系与实施例1中各PCR反应体系中 的组成及含量相同，区别之处仅是引物的设计不同。所用的溶液的组成
Buffer A :50mM Tris_HCl，5mM EDTA，0. 1% TritonX-100 ；Buffer B :50mM Tris_HCl，5mM EDTA, 2M 尿素；Buffer C : IOOmM Tris-HCl, IOmM DTT，8M 尿素；透析液100mMTris_HCl，5mM EDTA，5mM 半胱氨酸。实施例3.文蛤溶菌酶重组蛋白的体外抑菌实验通过检测对藤黄微球菌(革兰氏阳性菌)和铜绿假单胞菌(革兰氏阴性菌)的抑 菌圈的大小来检测重组蛋白的溶菌活性。具体操作如下采用经典的牛津杯抑菌实验步骤。将藤黄微球菌和铜绿假单胞菌分别加入未溶的 固体培养基混勻后倒平板，菌体浓度控制在IO5-IO6CFU/μ 1培养基。待培养基凝固之后，在 平板表面放上6个牛津杯。牛津杯中所加溶液如下1号牛津杯100 μ 1浓度为0. 3 μ g/ μ 1的溶菌酶(商品化的鸡蛋清溶菌酶)2号牛津杯100 μ 1浓度为0. 3 μ g/ μ 1的溶菌酶(商品化的鸡蛋清溶菌酶)，并且其中含有40mM的EDTA · 2Na3号牛津杯100 μ 1切掉GST的溶菌酶重组蛋白(浓度约为0. 2-0. 3 μ g/ μ 1)4号牛津杯100 μ 1切掉GST的溶菌酶重组蛋白(浓度约为0. 2-0. 3 μ g/ μ 1)，并且其中含有40mM的EDTA · 2Na5号牛津杯200 μ 1切掉GST的溶菌酶重组蛋白(浓度约为0. 2-0. 3 μ g/ul)6号牛津杯(阴性对照)纯化蛋白时用的洗脱液，即溶菌酶重组蛋白的溶解液加好样品之后，将平板放入37度培养箱24小时，用游标卡尺测量抑菌圈的直径(d)。如附图2所示，藤黄微球菌(革兰氏阳性菌)各抑菌圈的直径大小如下1 号牛津杯d = 26. Omm2 号牛津杯d = 36. Omm3 号牛津杯d = 21. Omm4 号牛津杯d = 34. 5mm5 号牛津杯d = 22. 5mm6号牛津杯无抑菌圈如附图3所示，铜绿假单胞菌(革兰氏阴性菌)各抑菌圈的直径大小如下1 号牛津杯d = 11. Omm2 号牛津杯d = 17. Omm3 号牛津杯d = 13. 2mm4 号牛津杯d = 19. Omm5 号牛津杯d = 15. 2mm6号牛津杯无抑菌圈抑菌结果说明1.文蛤溶菌酶重组蛋白对革兰氏阳性菌藤黄微球菌具有显著的抑菌效果。2.文蛤溶菌酶重组蛋白对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌具有一定的抑菌效果，低于 对藤黄微球菌的抑菌效果。
3.相比同样浓度的商品化鸡蛋清溶菌酶，文蛤溶菌酶重组蛋白具有相似的溶菌效 果，即所得的重组溶菌酶蛋白的活性很高，与天然鸡蛋清溶菌酶效果类似。4.加入一定量的EDTA *2Na有助于增强抑菌效果，尤其对于革兰氏阴性菌，因此如 果应用此重组溶菌酶作用革兰氏阴性菌，可以配合EDTA · 2Na使用，效果更佳。5.保持重组溶菌酶的浓度不变，只是加大量，并不能明显增强抑菌效果，抑菌效果 与重组溶菌酶的浓度有关。6.阴性对照没有抑菌圈形成，说明所显示的抑菌效果完全出于文蛤溶菌酶重组蛋 白的作用。实施例4.文蛤溶菌酶重组蛋白的溶菌活性定量利用南京建成生物有限公司生产的溶菌酶检测试剂盒，对所得的文蛤溶菌酶重组 蛋白的溶菌活性进行定量。其原理是利用溶菌酶能够溶解细菌细胞壁而使细菌裂解，从而 使细菌溶液的透光度增大，通过比较待测样品和标准溶菌酶溶液对细菌溶液透光度的影 响，来定量计算出待测样品中溶菌酶的浓度。详细方法参照其说明书中空白对照法进行测定。方法及结果如下样品包括空白(蒸馏水)、标准溶菌酶溶液(0.01yg/yl即0.2U/yl)、阴性对 照(纯化蛋白时用的洗脱液，即文蛤溶菌酶重组蛋白的溶解液，其中除了缓冲液成分以外， 还包括20mM的还原型谷胱甘肽和0. 02U/ μ 1的凝血酶)、切掉GST的文蛤溶菌酶重组蛋白 10倍稀释液。在500μ 1的以上样品中各加入5ml的微球菌菌液，37度水浴15分钟，之后 立即冰上放置3分钟，然后测在530nm下的吸光度，重复三次，取平均值。平均值如下0.D.530空白管0.04850标准管0.02500阴性对照管0.04525待测样品管0.02150根据说明书上的计算公式溶菌酶含量(μ g/μ 1)=(测定管透光度-空白管透光度)/(标准管透光度-空 白管透光度)X标准管浓度(0.01yg/yl即0. 2U/yl)X样本测试前稀释倍数得出文 蛤溶菌酶重组蛋白10倍稀释液所表现出的活性溶菌酶的浓度约为0.0115 μ g/μ 即 0. 2297872υ/μ 1，也就是说得到的文蛤溶菌酶重组蛋白原液的溶菌酶浓度约为0. 115 μ g/ μ 1 (2· 297872υ/μ 1)。浓度测定结果说明1.得到的文蛤溶菌酶重组蛋白是有活性的，且活性较高。浓度约为0. 2-0. 3 Ug/ μ ι的文蛤溶菌酶重组蛋白经试剂盒检测所得到的活性溶菌酶浓度约为ο. ι 5μ g/ui即 2. 297872U/y 1。2.阴性对照管的透光度(0.04525)与空白管的透光度(0.04850)相似，说明所得 到的溶菌酶活性全部来自于文蛤溶菌酶重组蛋白。
权利要求
一种文蛤溶菌酶基因，其特征在于文蛤溶菌酶基因的cDNA序列为序列表SEQ ID NO 1中所示的核苷酸序列。
2.一种按权利要求1所述的文蛤溶菌酶基因的编码蛋白，其特征在于所述文蛤溶菌 酶基因的cDNA序列所编码的蛋白为序列表SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列。
3.一种按权利要求1所述的文蛤溶菌酶基因的应用，其特征在于文蛤溶菌酶基因的 重组表达产物可作为杀菌剂及贝类生长的免疫增强剂。
全文摘要
本发明涉及分子生物学，具体的说是一种文蛤溶菌酶基因及其编码蛋白和应用。本发明利用cDNA文库和RACE技术从文蛤中扩增到文蛤溶菌酶的全cDNA序列552bp，其中完整阅读框441bp，5′非编码区15bp，3’非编码区96bp，完整编码蛋白含有146个氨基酸，其中编码序列的1-15为信号肽序列，成熟肽包括131个氨基酸，其中含有14个半胱氨酸。根据所得序列设计表达引物，扩增全长后经酶切连接到表达载体pGEX-4T-1中，之后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，经过IPTG诱导，然后经过GSTrap FF亲和柱纯化和凝血酶酶切GST后得到重组溶菌酶。本发明中的溶菌酶，具有广泛的医药、工业价值，具有广阔的应用前景，可作为杀菌剂、贝类生长的免疫增强剂及医药、饲料、食品等的添加剂等。
文档编号C12N9/36GK101921788SQ20101020125
公开日2010年12月22日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者刘保忠, 岳欣, 王鸿霞, 郇聘 申请人:中国科学院海洋研究所