专利名称：一种微生物发酵过程放大平台技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物发酵过程放大平台技术，该技术在发酵过程中选取标志性代谢物来反映微生物的生长状态以及发酵培养基的状况，并通过控制标志代谢物变化并结合流体力学计算设计改进搅拌反应器尺寸和结构，提高气含率，对发酵条件进行优化，并将发酵过程进行放大。
背景技术：
高密度发酵过程中由于许多营养物在高浓度下对细胞有抑制作用，为了解决高浓度底物抑制，分批补料发酵已经广泛地利用于各种微生物的高浓度发酵。如日本在1992 年的研究中，使用发酵菌株为抗1，2，4_三氮唑的酿酒酵母KY6186，通过在线监测发酵液中溶解氧和乙醇的体积分数，运用前馈/反馈控制系统确定葡萄糖的流加速率，使葡萄糖和乙醇同时被利用。在120吨发酵罐中，60小时发酵结束时GSH产量为2360 mg厂1，产率为39. 33 mg L-1 h-1，比指数流加方式提高了 40%，胞内GSH质量分数达到3. 7%[Sakato K, Tanaka H(Kyowa Hakko Kogyo Co. , Ltd·)· Advanced control of glutathione fermentation process (谷胱甘肽发酵过程的先进控制)· Biotechnol Bioeng. 1992 Oct 20 ； 40 (8) :904-12]。武薇等采用分批补加葡萄糖，控制在20 g/L 25 g/L的方式进行马链球菌(Str印tococcms equi )在发酵生产透明质酸(HA)，HA的产量达到5. 6 g/L，平均分子量达到1. 78X106U,较分批发酵时HA产量提高90%，分子量提高46%[武薇.透明质酸补糖分批发酵工艺研究.食品研究与开发.2008]。陈坚等对产朊假丝酵母高密度培养合成谷胱甘肽过程进行研究，在恒定速度(5. 5 g · L-I · h-Ι)流加葡萄糖基础上，发酵45 h细胞干重最高达到73 g · L-1，此时向发酵罐中一次性添加L-半胱氨酸，最终GSH产量和胞内GSH含量分别达到了 1458mg L-I和2.沈％。[张文燕，堵国成，陈坚.流加发酵及添加L-半胱氨酸对产朊假丝酵母高密度培养合成谷胱甘肽的影响.应用与环境生物学报.2007]。You Jian !^ng以酿酒酵母ZJUSl为生产菌株进行葡萄糖流加策略研究，发现为了得到较高的生物量采用指数流加策略(设定指数？？为0. 13)，经过60小时发酵SAM、 GSH 和细胞干重分别达到 8. 77、0. 81 和 105 g L-I [Lin Jian Ping, Tian Jun, You Jian Feng. An effective strategy for the co-production of S-adenosyl-L-methionine and glutathione by fed-batch fermentation. Biochemical Engineering Journal. 2004]。中国专利ZL200310116833. 6中，公开了乙醇反馈控制流加的酵母高密度发酵方法及其应用，该方法通过浓度监测仪在线监测发酵液中的乙醇浓度，并应用于酵母细胞的高密度发酵。此外，发酵液中溶解氧含量是影响好氧微生物高浓度发酵的另一个关键因素。尤其是在发酵过程后期，发酵液粘度很大，细胞的耗氧量又极大，发酵液中各物理参数的改变均不能对溶氧产生较大的改观，细胞生长缓慢。顾小华采用计算流体力学(CFD)技术深入研究了搅拌对菌体生长HA合成的影响，通过改变搅拌桨组合方式的手段有效地解决了物料混合时间和反应器内部剪切速率之间的矛盾，最终HA分子量提高23.9%。[顾小华.采用计算流体力学技术研究搅拌对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响.生物工程学报.2009]。目前发酵过程放大技术主要包括有发酵罐几何相似准则放大，借鉴化学工程的因次分析法，时间常数法。单位体积功率，混合时间等参数值相似准则；准数规则放大(工业放大)，根据氧传递系数、线速度等相等放大；英国尼洛教授提出的基于N-S方程计算流体力学放大和多尺度参数和计算流体力学放大(华东理工大学)，即将发酵过程宏观物理学参数与生物生理特性参数如RQ、OUR、CER等关联进行放大，其参数是包括温度、溶氧、pH、发酵尾气中CO2和&的浓度变化来指导发酵过程放大，只是考虑了反应器对发酵过程的影响，未考虑微生物发酵过程分子水平代谢变化，放大仍部分依靠经验。综上所述，在微生物发酵生产中所涉及的指数/恒速流加或控制一定浓度的底物流加方式以及应用经验/准数规则对反应器放大等，没有考虑微生物生长特性，存在与微生物生长状态不匹配等问题。所以，在微生物发酵生产方面需要一种能够及时反馈微生物生长状态的、控制标志代谢物、简单易行的底物流加方法，并将其与数学计算方法有效地相结合，进行发酵条件优化和并将发酵过程进行放大的技术。
发明内容
本发明提供一种微生物发酵过程放大平台技术，该技术在发酵过程中选取标志性代谢物来反映微生物的生长状态和发酵培养基的状况，并通过控制标志代谢物变化，并结合流体力学计算设计改进搅拌反应器尺寸和结构，提高气含率，并使标志代谢物浓度下降；对发酵条件进行优化，并将发酵过程进行放大。本发明是通过以下技术方案实现的
一种微生物发酵过程放大平台技术，该技术在发酵过程中选取标志性代谢物来反映微生物的生长状态和发酵培养基的状况，并通过控制标志代谢物变化，并结合流体力学计算设计改进搅拌反应器尺寸和结构，提高气含率，并使标志代谢物浓度下降；对发酵条件进行优化，并将发酵过程进行放大。该技术应用于酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽、谷胱甘肽和麦角固醇联产、S-腺苷-L-蛋氨酸；兽疫链球菌发酵生产透明质酸。所述的标志性代谢物为乙醇、甘油、乳酸、乙酸。该技术使酵母好氧高密度发酵乙醇浓度小于0. 5%，使细菌发酵生产透明质酸标志代谢物乳酸浓度小于3%。对所述标志性代谢物进行监测，所述的监测方法为在线自动检测及离线半自动快速检测，并通过调节底物的流加速度控制所述的标志性代谢物浓度或使其以一定趋势变化。在所述的发酵过程中，酵母体系的流加糖量为
自开始发酵起自开始发酵起8 16小时，(Γ18 g/L/h;16l4小时，18 24 g/L/h ； 2Γ33小时，8 16 g/L/h ；自流加开始，使酵母好氧高密度发酵乙醇浓度小于0. 5%。在所述的发酵过程中，细菌体系的补糖量为
自开始发酵起自开始发酵起10 15小时，8 15 g/L/h; 19 22小时，10 20 g/L/h ； 16 18小时，15 25 g/L/h ;23 25小时，9 18 g/L/h ；自流加开始，使使细菌发酵生产透明质酸标志代谢物乳酸浓度小于3%。在发酵过程中，通过流体力学计算设计改进搅拌桨及反应器的尺寸和结构在酵母体系中的发酵过程中，通过流体力学计算设计改进的搅拌桨及反应器的尺寸和结构为
如图1所示，所述的反应器为发酵罐1，该发酵罐1包括上层搅拌桨2、下层搅拌桨3、布气器4、罐底5 ；所述的上层搅拌桨2和所述的下层搅拌桨3均带有圆盘6 ； 所述的上层搅拌桨和下层搅拌桨均为六斜叶涡轮桨，均带有圆盘； 所述的布气器主要采用圆管式布气器，上表面开孔，直径与搅拌桨桨径相同； 搅拌桨桨径Dj与罐内径Dn之比的范围为
规格为5L的发酵罐0. 25-0. 35 ；规格为200L的发酵罐0. 25-0. 35 ；规格为32KL的发酵罐0. 25-0. 35 ；
圆盘直径Dl与搅拌桨桨径Dj之比的范围为
规格为5L的发酵罐0. 5-0. 7 ；规格为200L的发酵罐0. 5-0. 7 ；规格为32KL的发酵罐0. 5-0. 7 ；
涡轮桨距底面距离h2与搅拌桨桨径Dj之比的范围为
规格为5L的发酵罐0. 9-1. 1 ；规格为200L的发酵罐0. 9-1. 1 ；规格为32KL的发酵罐0. 9-1. 1 ；
上下两层搅拌器间距hi与搅拌桨桨径Dj之比的范围为
规格为5L的发酵罐0. 9-1. 5 ；规格为200L的发酵罐1. 5-2. 5 ；规格为32KL的发酵罐1. 5-2. 5 ；
布气器与罐底的距离h3的范围为
规格为5L的发酵罐20-40mm ；规格为200L的发酵罐30-60mm ；规格为32KL的发酵罐500-700mm。在酵母体系中的发酵过程中，通过流体力学计算设计改进的搅拌桨及反应器的尺寸和结构为
如图ι所示，所述的反应器为发酵罐1，该发酵罐1包括上层搅拌桨2、下层搅拌桨3、布气器4、罐底5 ；所述的上层搅拌桨2和所述的下层搅拌桨3均带有圆盘6 ；
采用复合搅拌桨，所述的上层搅拌桨为六斜叶涡轮桨，带有圆盘；所述的下层搅拌桨为六斜叶推进式搅拌桨，带有圆盘；
所述的布气器主要采用圆管式布气器，上表面开孔，直径与搅拌桨桨径相同； 搅拌桨桨径Dj与罐内径Dn之比的范围为
规格为5L的发酵罐0. 25-0. 35 ；规格为30KL的发酵罐0. 25-0. 35 ； 圆盘直径Dl与搅拌桨桨径Dj之比的范围为 规格为5L的发酵罐0. 5-0. 7 ；规格为30KL的发酵罐0. 5-0. 7 ； 涡轮桨距底面距离h2与搅拌桨桨径Dj之比的范围为 规格为5L的发酵罐0. 9-1. 1 ；规格为30KL的发酵罐0. 9-1. 1 ； 上下两层搅拌器间距hi与搅拌桨桨径Dj之比的范围为 规格为5L的发酵罐1. 5-2. 5 ；规格为30KL的发酵罐1. 5-2. 5 ； 布气器与罐底的距离h3的范围为
规格为5L的发酵罐20-40mm ；规格为30L的发酵罐500-700mm。在细菌体系的发酵过程中，通过流体力学计算设计改进的搅拌桨及反应器的尺寸和结构为
如图2所示，所述的反应器为发酵罐1，该发酵罐1包括上层搅拌桨2、下层搅拌桨3、布气器4、罐底5 ；所述的下层搅拌桨3带有圆盘6 ；
采用复合搅拌器，所述的搅拌桨的桨型为所述的上层搅拌桨为四叶变截面旋桨式搅拌器，不带圆盘；所述的下层搅拌桨为六箭叶涡轮式搅拌器，带有圆盘； 布气器主要采用圆管式布气器，上表面开孔，直径与搅拌桨桨径相同； 搅拌桨桨径Dj与罐内径Dn之比的范围为
规格为5L的发酵罐0. 25-0. 35 ；规格为30L的发酵罐0. 25-0. 35 ；规格为2KL的发酵罐0. 25-0. 35 ；
圆盘直径Dl与搅拌桨桨径Dj之比的范围为 规格为5L的发酵罐0. 5-0. 7 ；规格为30L的发酵罐0. 5-0 0. 5-0. 7 ；
涡轮桨距底面距离h2与搅拌桨桨径Dj之比的范围为 规格为5L的发酵罐0. 8-1. 1 ；规格为30L的发酵罐0. 8-1
0.9-1. 1 ；
上下两层搅拌器间距hi与搅拌桨桨径Dj之比的范围为 规格为5L的发酵罐1. 5-2. 5 ；规格为30L的发酵罐1. 5-2
1.5-2. 5 ；
布气器与罐底的距离h3的范围为 规格为5L的发酵罐20-40mm ；规格为30L的发酵罐30-50mm ；规格为2KL的发酵罐 90-120mm。本发明相比现有技术的有益效果为
1.本发明将微生物生长状态与计算流体力学相结合，采用CFD方法模拟发酵罐中不同搅拌桨对发酵气含率和搅拌功率的影响，设计优化搅拌桨，指导发酵罐放大，操作简便， 自动化程度高；
2.本发明应用范围广泛，既可应用于酵母菌体系，也可以应用于细菌体系；
3.本发明应用于酿酒酵母生产谷胱甘肽，放大到32KL发酵罐，发酵50 h后谷胱甘肽产量达到2520 mg/L,生物量达到105 g/L ；
4.本发明应用于酿酒酵母生产麦角固醇和谷胱甘肽，发酵32h后，细胞干重，谷胱甘肽和麦角固醇产量分别达到110 g/L, 2200 mg/L, 1510 mg/L ；
5.本发明应用于养兽疫链球菌生产透明质酸，发酵2 后，透明质酸浓度达到6.5 g/ L,比未以乳酸为标志代谢物进行反馈补加时产量提高了 50% ；
6.本发明应用于酿酒酵母生产S-腺苷-L-蛋氨酸，发酵60h后S-腺苷蛋氨酸浓度达到15 g/L以上；
7.本发明应用于酿酒酵母生产S-腺苷-L-蛋氨酸和麦角固醇，最终S-腺苷蛋氨酸和麦角固醇产量分别为13.5 g/L和1600 mg/L。
图1 酵母体系中，改进的搅拌桨及反应器的结构示意图； 图2 细菌体系中，改进的搅拌桨及反应器的结构示意图。
.7 ；规格为2KL的发酵罐 .1 ；规格为2KL的发酵罐 .5 ；规格为2KL的发酵罐
具体实施例方式
实施例1
一种微生物发酵过程放大平台技术，该技术在发酵过程中选取标志性代谢物来反映微生物的生长状态和发酵培养基的状况，并通过控制标志代谢物变化，并结合流体力学计算设计改进搅拌反应器尺寸和结构，提高气含率，并使标志代谢物浓度下降；对发酵条件进行优化，并将发酵过程进行放大。该技术应用于酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽、谷胱甘肽和麦角固醇联产、S-腺苷-L-蛋氨酸；兽疫链球菌发酵生产透明质酸。所述的标志性代谢物为乙醇、甘油、乳酸、乙酸。对所述标志性代谢物进行监测，所述的监测方法为在线自动检测及离线半自动快速检测，并通过调节底物的流加速度控制所述的标志性代谢物浓度或使其以一定趋势变化。在所述的发酵过程中，酵母体系的流加糖量为
自开始发酵起自开始发酵起8 16小时， (Γ18 g/L/h ； 1614小时，1814 g/L/ h ；2Γ33小时，8 16 g/L/h ；自流加开始，使酵母好氧高密度发酵乙醇浓度小于0. 5%。在所述的发酵过程中，细菌体系的补糖量为
自开始发酵起自开始发酵起10 15小时，8 15 g/L/h; 19 22小时，10 20 g/L/h ； 16 18小时，15 25 g/L/h ;23 25小时，9 18 g/L/h ；自流加开始，使使细菌发酵生产透明质酸标志代谢物乳酸浓度小于3%。所述的标志性代谢物检测方法为开发所述的标志性代谢物相应的电极进行在线检测或离线半自动快速检测方法；
所述的标志代谢物控制方法为将上述标志性代谢物的浓度变化与产物、底物浓度相结合，并在发酵过程中控制上述标志代谢物以一定的方式变化来反馈底物流加策略； 底物流加方法为按照确定的标志代谢物反馈方法进行自动流加底物； 自动流加系统为FC-2002型乙醇浓度监控仪，购自上海苏泊信息技术有限公司； 本实施例分析了好氧微生物的代谢网络，通过理论计算研究了底物吸收速率和摄氧率变化对主要代谢物生成速率的影响，选取标志代谢物，研究标志性代谢物浓度对细胞生长和产物合成过程的影响，以及底物浓度的流加对标志代谢物浓度和产物合成的影响，建立了标志代谢物浓度反馈控制底物流加的模型，通过改变发酵液中维持的底物浓度，控制标志代谢物浓度，实现最终产物高产。同时根据不同发酵特性，设计发酵反应器改进搅拌桨和空气分布器结构，提高搅拌效率，提高气含率，使得发酵副产物浓度下降，达到产物高产的目的，从而满足高密度和高粘度发酵过程优化和放大。并应用这种基于标志代谢物反馈控制底物浓度和计算流体力学相结合的方式进行发酵过程的优化放大。本实施例可以以酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽、谷胱甘肽与麦角固醇联产、S-腺苷-L-蛋氨酸及兽疫链球菌高粘度发酵生产透明质酸等发酵过程为研究对象，选取一种或几种可以及时在线检测或快速检测的代谢物作为标志性代谢物来反应系统内发酵状态并对发酵过程尤其是底物流加过程进行优化，在此基础上将微生物生长状态与计算流体力学相结合，采用CFD方法模拟发酵罐中不同搅拌桨对发酵气含率和搅拌功率的影响，设计优化搅拌桨，指导发酵罐放大。
实施例2
本实施例在实施例1的基础上详细说明通过流体力学计算设计对反应器的改进。从理论上讲，计算流体力学应用于搅拌设计改善发酵的基本过程如下
A.分析发酵过程，获得发酵对搅拌的基本要求及参数。首先对发酵过程进行分析，得到发酵过程对搅拌的基本要求，如气含率，混合时间，剪切力等。然后通过实验获得发酵过程中发酵液的理化参数，如粘度，温度，导热系数等。确定发酵罐体积，选定可能的搅拌器，确定其他内构件(如布气器等)，并满足其他要求，从而最终确定计算域。B.进行发酵罐计算域内的计算流体动力学计算。a.建立控制方程对于一般的流体流动，可根据流体动力学的分析直接写出其控制方程。流体流动受物理守恒定律的控制，控制方程包括质量守恒定律、动量守恒定律、能量守恒定律。(注公式出处《计算流体动力学分析》王福军著)
采用常规的直角坐标下连续性方程、动量方程及湍流能量方程，其通用表达式如下式。
权利要求
1.一种微生物发酵过程放大平台技术，其特征在于该技术在发酵过程中选取标志性代谢物来反映微生物的生长状态和发酵培养基的状况，并通过控制标志代谢物变化，并结合流体力学计算设计改进搅拌反应器尺寸和结构，提高气含率，并使标志代谢物浓度下降； 对发酵条件进行优化，并将发酵过程进行放大。
2.根据权利要求1所述的微生物发酵过程放大平台技术，其特征在于该技术应用于酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽、谷胱甘肽和麦角固醇联产、S-腺苷-L-蛋氨酸；兽疫链球菌发酵生产透明质酸。
3.根据权利要求1或2所述的微生物发酵过程放大平台技术，其特征在于其特征在于所述的标志性代谢物为乙醇、甘油、乳酸、乙酸。
4.根据权利要求3所述的微生物发酵过程放大平台技术，其特征在于该技术使酵母好氧高密度发酵乙醇浓度小于0. 5%，使细菌发酵生产透明质酸标志代谢物乳酸浓度小于3%。
5.根据权利要求1或2所述的微生物发酵过程放大平台技术，其特征在于对所述标志性代谢物进行监测，所述的监测方法为在线自动检测及离线半自动快速检测，并通过调节底物的流加速度控制所述的标志性代谢物浓度或使其以一定趋势变化。
6.根据权利要求5所述的微生物发酵过程放大平台技术，其特征在于 在所述的发酵过程中，酵母体系的流加糖量为自开始发酵起8 16小时， 0 18 g/L/h ； 1614小时，18l4g/L/h ；24 33小时，8 16 g/L/h ；自流加开始，使酵母好氧高密度发酵乙醇浓度小于0. 5%。
7.根据权利要求5所述的微生物发酵过程放大平台技术，其特征在于 在所述的发酵过程中，细菌体系的补糖量为自开始发酵起:10 15小时，8 15 g/L/h ； 19 22小时，10 20 g/L/h ； 16 18小时，15 25 g/L/h ；23^25小时，9 18 g/L/h ；自流加开始，使使细菌发酵生产透明质酸标志代谢物乳酸浓度小于3%。
8.根据权利要求1所述的微生物发酵过程放大平台技术，其特征在于在酵母体系中的发酵过程中，通过流体力学计算设计改进的搅拌桨及反应器的尺寸和结构为上层搅拌桨和下层搅拌桨均为六斜叶涡轮桨，均带有圆盘； 布气器直径与搅拌桨桨径相同； 搅拌桨桨径Dj与罐内径Dn之比的范围为0. 25-0. 35 ； 圆盘直径Dl与搅拌桨桨径Dj之比的范围为0. 5-0. 7 ； 涡轮桨距底面距离h2与搅拌桨桨径Dj之比的范围为0. 9-1. 1 ； 上下两层搅拌器间距hi与搅拌桨桨径Dj之比的范围为0. 9-2. 5 ； 布气器与罐底的距离h3的范围为20-700mm。
9.根据权利要求1所述的微生物发酵过程放大平台技术，其特征在于在酵母体系的发酵过程中，通过流体力学计算设计改进的搅拌桨及反应器的尺寸和结构为采用复合搅拌桨，所述的搅拌桨的桨型为上层搅拌桨为六斜叶涡轮桨，带有圆盘；下层搅拌桨为六斜叶推进式搅拌桨，带有圆盘； 布气器直径与搅拌桨桨径相同； 搅拌桨桨径Dj与罐内径Dn之比的范围为0. 25-0. 35 ；圆盘直径Dl与搅拌桨桨径Dj之比的范围为0. 5-0. 7 ； 涡轮桨距底面距离h2与搅拌桨桨径Dj之比的范围为0. 9-1. 1 ； 上下两层搅拌器间距hi与搅拌桨桨径Dj之比的范围为1. 5-2. 5 ； 布气器与罐底的距离h3的范围为20—700mm。
10.根据权利要求1所述的微生物发酵过程放大平台技术，其特征在于在细菌体系的发酵过程中，通过流体力学计算设计改进的搅拌桨及反应器的尺寸和结构为采用复合搅拌器，所述的搅拌桨的桨型为上层搅拌桨为四叶变截面旋桨式搅拌器，不带圆盘；下层搅拌桨为六箭叶涡轮式搅拌器，带有圆盘； 布气器直径与搅拌桨桨径相同； 搅拌桨桨径Dj与罐内径Dn之比的范围为0. 25-0. 35 ； 圆盘直径Dl与搅拌桨桨径Dj之比的范围为0. 5-0. 7 ； 涡轮桨距底面距离h2与搅拌桨桨径Dj之比的范围为0. 8-1. 1 ； 上下两层搅拌器间距hi与搅拌桨桨径Dj之比的范围为1. 5-2. 5 ； 布气器与罐底的距离h3的范围为20-120mm。
全文摘要
本发明提供一种微生物发酵过程放大平台技术，该技术在发酵过程中选取标志性代谢物来反映微生物的生长状态和发酵培养基的状况，并通过控制标志代谢物变化，并结合流体力学计算设计改进搅拌反应器尺寸和结构，提高气含率，并使标志代谢物浓度下降；对发酵条件进行优化，并将发酵过程进行放大。该技术应用于酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽、谷胱甘肽和麦角固醇联产、S-腺苷-L-蛋氨酸；兽疫链球菌发酵生产透明质酸。所述的标志性代谢物为乙醇、甘油、乳酸、乙酸。该技术使酵母好氧高密度发酵乙醇浓度小于0.5%，使细菌发酵生产透明质酸标志代谢物乳酸浓度小于3%。本发明操作简便，自动化程度高；应用范围广泛，既可用于酵母菌体系，也可以用于细菌体系。
文档编号C12R1/46GK102286369SQ201010203090
公开日2011年12月21日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者叶华, 孙景峰, 张会丽, 王峥, 王苗苗, 谭天伟 申请人:北京化工大学