专利名称：Tev蛋白酶突变体及编码基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种烟草蚀斑病毒(TEV)蛋白酶突变体，该突变体的编码基因以及制备该突变体的方法。
背景技术：
在大肠杆菌中进行蛋白重组表达时，很多蛋白质不是表达量不高就是可溶性很 低。要使得目的蛋白的表达量上升或可溶性提高，也可将目的蛋白和一些特定的蛋白标签 融合表达，在基因水平上对目标蛋白进行改造，产生含有蛋白标签的重组蛋白。目前用到的 蛋白标签有很多，包括常用的麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein，MBP)，谷胱甘肽 转移酶(glutathione S-transferase，GST)，硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)，小泛素相关 修饰物(small ubiquitin-related modifier, SUMO)等。这些蛋白标签可以使重组蛋白 的表达量上升，可溶性显著提高，为目的蛋白的表达、纯化提供了便利。然而这些在N-端或 C-端的融合标签可能对目的蛋白的结构和活性产生一定的影响。因此在研究蛋白质或酶的 结构或功能时常需要将这些标签在纯化完成后除去。虽然化学和酶学方法都能够将蛋白标签切除，但是，化学法专一性不高，而且，切 割条件不够温和，常常会导致目的蛋白不可逆失活。只有使用酶学方法，才能达到较高的特 异性，因此切除蛋白标签常用的方法是在标签与目的蛋白之间引入一段蛋白酶酶切序列， 使用特异的蛋白酶将蛋白标签切除。以往选用的蛋白酶主要包括凝血酶(Thrombin)，凝血 因子Xa (Factor Xa)，肠激酶(Enterokinase)等，其中凝血因子Xa和肠激酶切割时，不会在 目的蛋白的N-端留下多余的氨基酸残基，有利于天然蛋白结构和功能的研究。但据文献报 道这些蛋白酶都存在着酶切位点不专一，酶切时常常会导致目的蛋白降解等缺点。而TEV 蛋白酶由于它高度的序列识别专一性，得到人们越来越多的重视。TEV 蛋白酶(tobacco etch virus protease)是烟草蚀斑病毒 NIa 蛋白中 27kD 的催化区域，可以特异地识别蛋白序Glu-Xaa-Xaa-Tyr-Xaa-Gln-Gly/Ser (最常用序列为 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly)，并在最后两个氨基酸残基Gln (Pl)与Gly (Pl ‘)之间切 开，其序列专一性远比Thrombin、Factor Xa,Enterokinase等蛋白酶高。虽然TEV蛋白对目 的蛋白切割后，会在目的蛋白的N-端留下一个氨基酸残基，但是酶切位点的PΓ位置，并 非专一性的是Gly或Ser，Pl ‘位置除Pro非常明显地影响TEV蛋白酶的切割效果外，其它 氨基酸不会明显影响TEV蛋白酶对的融合蛋白的切割，通过延长切割时间或增加TEV蛋白 酶的浓度，都会使得大部分的融合蛋白得以切割。因此，通过设计可以在酶切后得到N-端 不含有多余氨基酸残基的天然氨基酸。同时，TEV蛋白酶能够耐受多种常见的蛋白酶抑制 齐U，而且TEV蛋白酶的切割效率即使在4°C时也较高，因此TEV蛋白酶在蛋白质研究中得到 广泛的应用。但是TEV蛋白酶自身的表达和纯化存在一定的缺陷。首先，天然的TEV蛋白酶会发 生分子内自水解，在表达和纯化天然TEV蛋白酶的过程中，它会不断由于其它TEV蛋白酶的 碰撞而发生构象变化，将其自身的特定位点切开，从而使完整的蛋白酶被截短，活性大大降低。生化和结构学研究表明这一特定的切割位点离酶活性中心相当近。为克服这一困难， Lucast等人得到了 S219N突变体，其稳定性得到很大的提高，但是S219N突变体在表达时和 原始TEV蛋白酶一样，可溶性并不高，有大约95%的蛋白是以包涵体的形式存在于沉淀中。 Kapust等人使用基因工程点突变了天然TEV蛋白酶的基因序列，得到S219V这一稳定性较 高并且酶活性也有稍微提高的突变体，其稳定性比S219N要高出约100倍。
其次，TEV蛋白酶表达产量不高，溶解度也非常低。大约只有5%的TEV蛋白酶 存在于细胞破碎液的上清中，产量为12. 5mg/L。Van denBerg等人通过基因改组(DNA shuffling)、易错PCR(error-prone PCR)发现了一种可以将产量提高到54mg/L的突变体 TEVsh，其溶解度比S219N有很大提高，但仍有大量TEV蛋白酶以不可溶的形式存在于沉淀 中，并且酶活性变化不大。Lei Fang等人将TEV蛋白酶和分子伴侣分别克隆入两个不同的 载体，在低温下进行共表达，使TEV蛋白酶产量提高到65mg/L，而且酶活性得到一定程度的 保留。Cabrita，L. D.等人使用PoPMuSiC软件设计，对TEV蛋白酶单点突变体进行稳定性分 析，筛选出了五个突变体，它们的可溶性和酶活性相对于野生型TEV蛋白酶都得到提升，同 时还得到一个双突变体，其可溶性及酶活性相对于单突变体有显著提高。Blommel，P. G等 人将TEV蛋白酶与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合表达，吴旭东等人将TEV蛋白酶与超折叠绿 色荧光蛋白(sfGFP)融合表达，融合蛋白的表达量都得到了明显的提高。Kraft等人通过荧 光底物，发展出一套能够实用的方法，它可以有效地检测TEV蛋白酶在体内的表达与折叠， 为TEV蛋白酶的进一步研究提供了一种快捷有效的方法。
发明内容
本发明针对以上提及的TEV蛋白酶自身不足，提供了一种可溶性和酶活性均较原 始TEV蛋白酶得到显著提高的突变体，以及该突变体的编码基因和制备该突变体的方法。本发明是能过以下技术方案实现的本发明的第一目的是提供一种TEV蛋白酶突变体，与原始TEV蛋白酶相比，第17 位由丝氨酸(Ser)取代苏氨酸(Thr)，第56位由缬氨酸(Val)取代亮氨酸(Leu)，第68位由 天冬氨酸(Asp)取代天冬酰胺(Asn)，第77位由缬氨酸(Val)取代异亮氨酸(lie)，第135 位由甘氨酸(Gly)取代丝氨酸(Ser)。所述TEV蛋白酶突变体具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。本发明的第二目的是提供编码TEV蛋白酶突变体的基因，其核苷酸序列如序列表 中序列ι所示。本发明的第三目的是提供一种含有前述基因的表达载体pET28b。本发明的第四目的是提供一种含有前述基因和前述载体的宿主细胞大肠杆菌 Rosetta(DE3)感受态。本发明第五目的是TEV蛋白酶突变体在大肠杆菌中进行蛋白重组表达的应用。本发明的制备原理为体外定点突变(site-directed mutagenesis)技术是研究 蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是改造/优化基因常用的手段，其原理 是设计两对5'端邻接，3'端方向相反的引物，用以导入变异点。本发明的有益效果为采用定点突变技术改造TEV蛋白酶基因，特异性的改变TEV 蛋白酶中的五个氨基酸残基，以获得可溶性和酶活性更高的TEV蛋白酶的突变体，强化其在大肠杆菌中蛋白重组表达的应用。
图1为TEV蛋白酶突变体TEVq (五突变体)与TEV蛋白酶TEVf三突变体可溶性比 较。图2为GSTcys融合蛋白及TEV蛋白酶作用示意图。图3为TEVf与TEVq酶活性比较。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。实施例1利用定点突变得到TEV蛋白酶突变体 设计定点突变引物，以含有烟草蚀斑病毒蛋白酶基因的载体(pET-TEV)为模板进 行PCR扩增，反应条件为94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 6. 5min，循环30次。PCR产物经DpnI 消化后，琼脂糖凝胶电泳。切胶纯化，对已经纯化的PCR产物进行末端平滑及5'磷酸 (P)化处理，再用高效连接试剂Ligation Solution I进行自身连接，转化大肠杆菌DH5a感 受态细胞，提取突变体质粒DNA。同时将五突变体命名为TEVq,三突变体命名为TEVf。实施例2突变体基因测序及序列比对将通过上述方法得到的突变体克隆DH5a送上海生工生物工程技术服务有限公司 测序，测序结果输入BioEdit软件，比较突变前后基因碱基序列和蛋白质氨基酸序列的差
已结果显示，突变体蛋白与原始TEV蛋白酶共五处发生突变。突变体的DNA碱基及 氨基酸序列改变情况如下碱基变化为第50位由G(鸟嘌呤)替代C(胞嘧啶)，第166位由G(鸟嘌呤)替 代T (胸腺嘧啶)，第202位由G (鸟嘌呤)替代A (腺嘌呤)，第229位由G (鸟嘌呤)替代 A(腺嘌呤)，第403位由G(鸟嘌呤)替代T (胸腺嘧啶)，第404位由G(鸟嘌呤)替代C(胞 嘧啶)。相应地，氨基酸变化为第17位由丝氨酸(S，Ser)取代苏氨酸(T，Thr)，第56位 由缬氨酸(V，Val)取代亮氨酸(L，Leu)，第68位由天冬氨酸(D，Asp)取代天冬酰胺(N， Asn)，第77位由缬氨酸(V，Val)取代异亮氨酸(I，He)，第135位由甘氨酸(G，Gly)取代 丝氨酸(S，Ser)。实施例3 TEVq蛋白酶与TEVf蛋白酶可溶性及表达量比较将PET-TEVq和pET_TEVF重组质粒转化大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态。1、小量诱导表达，比较TEVq蛋白酶突变体与TEVf蛋白酶可溶性的变化(1)挑取单菌落接种于5mL LB培养基(含硫酸卡那霉素25mg/mL，氯霉素25mg/ mL)中，在37°C恒温摇床中220r/min振荡培养过夜；(2)加入IPTG(终浓度为1. Ommol/L)，在20°C恒温摇床220r/min诱导表达20h。(3)用1. 5mL道夫管收集菌体，洗涤并将菌体重新悬浮于0. SmL裂解缓冲液中。(4)重悬液经超声破碎后离心，取上清120 μ L力卩30 μ L5 X SDS-PAGE上样缓冲液制 备蛋白电泳样品(上清)。
(5)将破碎后的沉淀经裂解缓冲液洗涤后，重新溶解于0. 8mL 8mol/L尿素溶液，再次离心后取上清120 μ L加30 μ L 5 X SDS-PAGE上样缓冲液制备蛋白电泳样品(沉淀)。(6) 12% SDS-PAGE电泳分析蛋白表达结果。考马斯亮蓝R-250染色。SDS-PAGE电泳检测结果显示，TEV蛋白酶突变前后可溶性有明显改变，TEVq蛋白 酶突变体的可溶性得到提高。2、大量诱导表达并纯化，比较TEVq蛋白酶突变体与TEVf蛋白酶表达量的变化(1)挑取单菌落接种于5mL LB培养基中，在37°C恒温摇床中220r/min振荡培养 过夜。(2)以1 100转接到IL LB培养基中培养到OD6tltl = 0.6左右。(3)加入IPTG(终浓度为1. Ommol/L)，在20°C恒温摇床诱导表达20h。(4)收集菌体，重新悬浮于30mL Lysis Buffer中，重悬液经超声破碎后离心， Ni-NTA柱纯化。(5)先用Lysis Buffer平衡Ni-NTA层析柱，然后将上步得到的细胞破碎上清液加 入Ni-NTA层析柱中，控制流速在lmL/min。(6)等上清液流完后，以Lysis Buffer冲洗，再用Washing buffer洗去杂蛋白。(7)最后用Elution Buffer洗脱目的蛋白，收集目的蛋白约30mL。(8) Elution Buffer 洗脱完后，用 Lysis Buffer 平衡 Ni-NTA 柱，备用。(9)用Bradford法分别测定TEVq蛋白酶与TEVf蛋白酶的蛋白浓度，计算各自的
表达量。大量诱导表达并用Ni-NTA柱纯化后，用Bradford法分别测定TEVq蛋白酶与TEVf 蛋白酶的蛋白浓度，计算各自的表达量。计算结果显示每升菌液中蛋白酶表达量分别为 165mg(TEVq蛋白酶)和108mg(TEVf蛋白酶)。TEVq蛋白酶的表达量明显高于TEVf蛋白酶。实施例4 TEVq蛋白酶突变体与TEVf蛋白酶酶活性比较TEV蛋白酶的酶活性通过其切割含有TEV蛋白酶识别序列的底物来测定，我们以 融合蛋白GST-Cys为底物。酶切反应在30°C恒温水浴锅进行，TEV蛋白酶与GST-Cys融合 蛋白比例为1 10。(1)吸取等体积的融合蛋白GST-Cys溶液(200 μ L)于两个2mL道夫管中，分别标
注①和②。(2)分别加入等量的TEV蛋白酶TEVF蛋白酶(16 μ L)，TEVq蛋白酶(12 μ L)。(3)补充 50mM Tris-HCl 缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8. 0,0. 5mMEDTA, ImM DTT)至 1600 μ L0(4)在30°C恒温水浴锅中进行酶切反应(5)每隔20min分别取出120 μ L制备蛋白电泳样品。(6)等量上样，12% SDS-PAGE分析酶切结果。电泳结果显示TEVq蛋白酶突变体2h后几乎已经将GST-Cys融合蛋白切割完全，而 TEVf蛋白酶要达到同样的效果需要3h。所以TEVq蛋白酶突变体不仅可溶性得到提高，而且 酶活性也有了很大的改善。
权利要求
TEV蛋白酶突变体，其特征在于与原始TEV蛋白酶相比，第17位由丝氨酸(Ser)取代苏氨酸(Thr)，第56位由缬氨酸(Val)取代亮氨酸(Leu)，第68位由天冬氨酸(Asp)取代天冬酰胺(Asn)，第77位由缬氨酸(Val)取代异亮氨酸(Ile)，第135位由甘氨酸(Gly)取代丝氨酸(Ser)。
2.根据权利要求1所述的TEV蛋白酶突变体，其特征在于所述突变体具有序列表中序 列2所示的氨基酸序列。
3.编码如权利要求1所述的TEV蛋白酶突变体的基因，其核苷酸序列如序列表中序列 1所示。
4.一种含有如权利要求3所述基因的表达载体，其特征在于所述表达载体为pET28b。
5.一种含有权利要求3所述基因和权利要求4所述载体的宿主细胞，其特征在于所述 宿主细胞为大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态。
6.权利要求1所述的TEV蛋白酶突变体在大肠杆菌中进行蛋白重组表达的应用。
全文摘要
本发明涉及一种TEV蛋白酶突变体，与原始TEV蛋白酶相比，第17位由丝氨酸(Ser)取代苏氨酸(Thr)，第56位由缬氨酸(Val)取代亮氨酸(Leu)，第68位由天冬氨酸(Asp)取代天冬酰胺(Asn)，第77位由缬氨酸(Val)取代异亮氨酸(Ile)，第135位由甘氨酸(Gly)取代丝氨酸(Ser)。本发明还提供了突变体的编码基因及其含有编码基因的表达载体和宿主细胞以及突变体在大肠杆菌中进行蛋白重组表达的应用。采用定点突变技术改造TEV蛋白酶基因，特异性的改变TEV蛋白酶中的五个氨基酸残基，获得的TEV蛋白酶的突变体可溶性和酶活性均得到显著的提高。
文档编号C12N15/70GK101864407SQ20101020470
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者亓振国, 范军 申请人:安徽农业大学