一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法

专利名称：一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种来源于垫状卷柏的海藻 糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法。
背景技术：
垫状卷柏(Selaginella pulvinata Maxim)为卷柏科卷柏属植物，俗称“九死还魂 草”。它一般多生长在荒山秃岭及干旱的岩石缝中，极耐干旱，也耐寒。在天气干旱的时候， 小枝就卷起来，缩成一团，以保住体内的水分。一旦得到雨水，气温升高，卷缩的小枝会平展 开来。有研究表明垫状卷柏这类复苏植物体内含有大量的应激代谢物-海藻糖。海藻糖又称酵母糖，是由两个吡喃环葡萄糖分子通过α-1，1糖苷键连结而成的 非还原性糖，其理化性质十分稳定，能够在高温、高寒、高盐和干燥失水等恶劣条件下对生 物细胞起到保护作用。海藻糖作为渗透调节物质通过渗透调节来维持高的细胞质渗透压， 保证在干旱胁迫下细胞的正常生理功能；在缺水情况下，可以保持细胞膜的液体流动相，防 止细胞膜通透性增加，出现融合现象；可以替代水分子通过氢键作用参与肽链折叠，维持在 缺水情况下蛋白质的空间结构和功能。在生物体内，海藻糖的生物合成过程为先由海藻糖-6-磷酸合成酶 (trehalose-6-phosphate synthase, TPS)催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDP)和 6-磷酸葡 萄糖反应生成6-磷酸海藻糖，再在海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP)的作用下脱磷酸，最终生成海藻糖。其中，海藻糖_6_磷酸合成酶是该合 成途径中的一个关键酶；不同生物体内的海藻糖-6-磷酸合成酶具有各自不同的特点，如 在编码基因和结构等方面即存在着明显的差异。目前人们研究海藻糖的主要策略之一，是通过对海藻糖上述合成途径相关基因的 克隆与表达研究，增强其合成途径的代谢，从而实现海藻糖在生物体内的富集。其中海藻 糖-6-磷酸合成酶(TPS)成为主要关注对象之一，许多科学家在此方面进行了不懈的努力。 但目前，人们对大肠杆菌和真菌等体内TPS基因的研究与利用相对较多，对植物体内TPS基 因的开发研究还非常有限。

发明内容
本发明的主要目的就是针对现有技术对植物体内海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS) 基因开发研究的局限性，提供一种来源于植物垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶的基因序 列，以期待应用于其它转基因作物中使之具有相应的优良的抗旱耐盐等性能。本发明的另一个目的是提供一种上述基因序列的克隆方法。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下
一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，该序列具有如SEQ ID NO. 1 所述的核苷酸序列。
其所对应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。上述核苷酸序列，可通过包括下述步骤的方法，从植物垫状卷柏叶片中提取总 RNA、设计引物、进行PCR扩增、测序等克隆得到
(1)总RNA的提取和纯化
可采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物垫状卷柏叶片中提取得到纯化的 垫状卷柏叶片总RNA ；
常用的RNA提取方法很多，如试剂盒法(Trizol法)、热硼酸法、异硫氰酸胍法、苯酚法、 十二烷基硫磺酸钠法、十六烷基三甲基溴化铵法、及各种改进方法等，均可用于垫状卷柏叶 片总RNA的提取；本发明中可优选Trizol法。纯化主要是为了去除总RNA中的DNA污染，获得纯化的垫状卷柏叶片总RNA，以满 足后续对目的基因的表达进行定量检测等需要。常用的RNA纯化方法包括DNA酶消化法 (简称D法)、酸酚变性法(简称S法)、EDTA法(简称E法)等；本发明中可优选DNA酶 消化法。(2)中间片段的克隆
A、中间片段cDNA第一链的合成
以上述步骤(1)纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以oligod (T) 18 :5’ -GCTGTC AACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T) 18-3，为反转录弓丨物，进行cDNA第一链合成，得到的 cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的cDNA模板；
B、PCR扩增
以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为cDNA模板，利用下述上游引物jfl和 下游引物jxl，进行PCR扩增
jfl: 5’ -TGGTCGTAAGGTTATGTTGGG-3’， jxl: 5’ -TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3’ ；
扩增得到垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到 中间片段序列。本步骤中，扩增体系可优选为 TaqPlusPCR Master Mix 10 μ L ， cDNA 模板1 yL，
2X 引物(jxl/jfl) 0.5 yL , ddH208 yL ο扩增程序可优选为 94°C，5min ；
94°C, 30 s，55°C，45 s，72°C，l min 30 s (30 个循环)； 72°C，8 min ；4°C保温。(3) 3，端的克隆
根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成用于扩增3’端的特异性上游引物 Sl和通用性下游引物AP2，分别为
Si: 5' -GCCATCAGAGAAAGCGGTTACT-3’， AP2: 5' -TACGTACGGCATG ACAGTG-3'；以前述步骤(2)A中得到的cDNA第一链为模板，利用上游引物Sl和下游引物AP2进行 PCR扩增；扩增得到完整的3’端，通过克隆测序，得到3’端序列。
本步骤中，扩增体系可优选为 TaqPlusPCR Master Mix 10 μ L ，扩增程序可优选为 94°C，3 min ；
94°C, 30 s;55°C，45 s;72°C，l min 30 s (33 个循环) 72°C，8 min ；12°C保温。(4)、5，端的克隆
C、合成5，端的cDNA第一链
以上述步骤(1)纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以下述特异性下游引物jxl和 5’端接头上游引物SMARTIIA Oligo为反转录引物，进行反转录 jxl: 5’ - TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3，，
SMARTIIA Oligo 5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3，； 合成得到反转录产物5’端的cDNA第一链；
D、第一段PCR扩增
根据上述步骤(2 )得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物A2和同源上游引 物Cl
A2: 5，-TCTTTTCATTTTGACAGGCGAC-3，， Cl 5' -ATCGGATGGCCTGGTGTCTATG-3，；
以前述步骤C所得反转录产物5’端的cDNA第一链为cDNA模板，利用特异性下游引物 A2和同源上游引物Cl，进行5’端第一段PCR扩增；
扩增得到的产物为cDNA 5’端第一段，通过克隆测序，得到5’端第一段的序列。本步骤中，扩增体系可优选为 TaqPlusPCR Master Mix 12 μ L ， cDNA 模板2 yL， 2X 引物(A2/C1) 0. 5 μ L， ddH20 5 yL ο扩增程序可优选为 94°C，3 min ；
94 °C, 30 s ；65 °C, 45 s;72°C，l min 30 s (2 个循环)； 每两个循环递减2V ；
94°C, 30 s;55°C，45 s;72°C，l min 30 s (25 个循环)； 72°C，8 min ；12°C保温。Ε、第二段PCR扩增
根据前述步骤D所得cDNA 5’端第一段的序列，设计并合成特异性下游引物Α5和5’
cDNA模板
2X 引物(S1/AP2)
ddH90
2 μ L， 0. 5 μ L，
7 μ ο端通用性上游引物P3:
A5: 5' -GCGGTCTTCTTGACGCAATCCAATGTAG-3’， P3: 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3‘；
以前述步骤C所得反转录产物5’端的cDNA第一链为cDNA模板，利用特异性下游引物 A5和5’端通用性上游引物P3，进行5’端第二段PCR扩增
扩增得到的产物为cDNA 5’端第二段，通过克隆测序，得到5’端第二段序列。本步骤中，扩增体系可优选为 TaqPlusPCR Master Mix 10 μ L ， cDNA 模板1.5 μ L， 2Χ 引物(Α5/Ρ3) 0. 5 μ L， ddH20 7. 5 μ L。扩增程序可优选为
94°C, 30 s;72°C，2 min (5 个循环)； 94°C, 30 s;70°C，30 s;72°C，2 min (5 个循环)； 94°C, 30 s ；68°C, 30 s;72°C，2 min (25 个循环)； 12°C保温。(5) ORF的克隆和拼接
将上述步骤(2)所得中间片段序列、步骤(3)所得3’端序列、和步骤(4)所得5’端第 一段序列和第二段序列进行拼接，得到的cDNA全长作为0RF(0pen Reading Frame，开放阅 读框)扩增的cDNA模板；
以下述上游引物0RF4和下游引物0RF5进行PCR扩增
ORF 4:5，-CCCAAGCTT(Hind III)CCTCGAG(Xho I )ATGCCTACTCCGTATTCCAATAC -3，， 0RF5: 5， -CGC GGATCC (BamH I )ATTAATTATCGACAGCGACAACC-3，； 扩增得到的产物为完整开放阅读框，即垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因，通过 克隆测序，即得其基因序列。本步骤中，扩增体系可优选为
2 X GC Buffer I (含 Mg+)10 μ L，
2Χ 引物(0RF4/0RF5)0.5 yL ,
cDNA 模板1 yL，
dNTP Mixture3. 2 μ L，
TaKaRa LA Taq0. 2 μ L，
ddH204.6 yL。扩增程序可优选为 94°C，5 min ；
94 °C, 30 s ；57°C, 1 min 30 s;72°C，2 min (10 个循环)； 94 °C, 30 s ;72°C,2 min 30 s (25 个循环)； 72°C，8 min ；12°C保温。与现有技术相比，本发明的有益效果是
本发明来源于植物垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)的基因序列是一种新的TPS基因序列，使人们对TPS基因的研究对象从大肠杆菌和真菌等微生物及少数有限的植 物体进一步扩展到垫状卷柏等多种植物体。并且，根据该TPS基因在垫状卷柏植物体内催化合成的海藻糖所表现出的优良的 抗旱、耐盐等性能可以预料如果将其通过转基因技术导入玉米等其他植物的基因中，将可 培育出具有相应的优良的抗旱、耐盐等性能的植物新品种。


图1为SpTPSl基因中间片段电泳检测结果图， 图2为SpTPSl基因3’端电泳检测结果图，
图3为SpTPSl基因5’第一段电泳检测结果图，
图4为SpTPSl基因5’第二段电泳检测结果图，
图5为SpTPSl基因电泳检测结果图，
图6是表达载体pTU+SpTPSl示意图，
图7是再生植株(转spTPSl基因Tl代株系)PCR检测结果图，
图8是再生植株(转spTPSl基因Tl代株系)的Southern杂交检测结果图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上 述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括 在本发明的范围内。在下述各实施例中，将垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶简称为SpTPSl。通过各 实施例，最终得到来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶核苷酸序列(如SEQ ID NO. 1所 述)及其所对应的氨基酸序列(如SEQ ID NO. 2所述)。实施例1
本实施例为垫状卷柏叶片总RNA的提取和纯化，包括下述步骤 (1)取垫状卷柏幼嫩叶片放入液氮预冷过的研钵，立即加入液氮，尽可能的研磨碎样 品，趁液氮尚未挥发将样品按每管0.1 g分装入用液氮预冷过的1.5 mL离心管中，立即向 每管加入1 mL Trizol (Invitrogen公司)，剧烈振荡后，室温放置5 min。(2)4°C、12000 r/min离心2 min，将上清液转入新的无RNase的离心管中。(3)向每管加入0. 1 mL 5 mol/L的NaCl，混合均勻，再向每管加入0. 3 mL氯仿， 剧烈振荡15 s后，室温放置3 min, 4°C >12000 r/min离心15 min，在尽可能不吸入中间层 的情况下，吸出上清液转入另一干净的1.5 mL离心管中。(4)向每管加入与所得上清液相等体积的异丙醇，轻轻混勻后，室温放置10 min, 40C、12000 r/min离心10 min,小心倒掉管中液体，保留沉淀，加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀。(5)4°C、7500 r/min离心5 min，小心倒掉管中液体，保留沉淀，再加入1 mL 75% 乙醇洗涤沉淀，4°C、7500 r/min离心5 min,所得沉淀即为垫状卷柏叶片总RNA，_20°C保存。实施例2
本实施例为分7757基因中间片段的克隆，方法如下以上述实施例1所得纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以oligod (T) 18:5’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T) 18_3，为反转录引物，按照 Takara 公司的 PrimeScript Reverse Transcriptase说明书进行cDNA第一链合成，扩增体系总体积为 20 口！^；得到中间片段的⑶嫩第一链。先通过比对5个已知的海藻糖-6-磷酸合成酶氨基酸序列复活卷柏TPSl (.Selaginella lepidophylla TPSl U96736. 1) ； TPSl {Solanum lycopersicum TPSl Ε. F151131. 1)；拟南芥 TPSl Urabidopsis thalianaTPSl NM106505. 4)；小立豌藓 TPSl (.Physcomitrella patens subsp TPSl XMOO1778453)；甘蔗 TPSl QSaccharum hybrid cultivar TPSl EU761244)，确定出中间位置的保守区域，再以复活卷柏7757为询问序列在 NCBI进行核苷酸比对，结合比对情况，得到一对兼并引物
jfl: 5’ -TGGTCGTAAGGTTATGTTGGG -3’ ； j χ 1 5 ’ -TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3’。以前述中间片段的cDNA第一链为cDNA模板，以设计的引物jfl和jxl进行垫状 卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因cDNA中间片段的扩增。扩增体系为TaqPlusPCR Master Mix10 μ L cDNA 模板 1 μ L
2X 引物(jxl/jfl)0· 5 μ L
ddH208 μ L
扩增程序为94°C，5min ；
94°C, 30 s，55°C，45 s，72°C，l min 30 s (30 个循环)； 72°C，8 min ；4°C保温。取所得扩增产物10 μ L经1%非变性琼脂糖凝胶80 V电泳40 min, EB染色后紫 外线检测扩增片段，结果如图1所示。扩增得到的产物为SpTPSl基因cDNA中间片段，通过包括下述步骤的方法克隆测 序，得到的中间片段序列如SEQ ID NO. 3所述:
①目的片段的回收与纯化
将扩增出来的特异条带用干净刀片在紫外光下快而准确的从琼脂糖中挖出，置于1. 5 mL离心管中，用凝胶回收试剂盒(北京天根公司)回收胶中的DNA片段；
②连接反应
将回收的DNA片段克隆于TaKaRa公司的pMD18_T载体中。连接反应采用连接试剂盒 (Takara公司)，扩增体系总体积10 μ L，16°C连接过夜；
③感受态细胞的制备
I、从LB平板上挑取新活化的五coliDH5a单菌落，接种于3-5 mL LB液体培养基 中，37°C、225 r/min振荡培养12 h左右，直至对数生长后期；将该菌悬液以1 100-1 50的 比例接种于100 mL LB液体培养基中，37°C振荡培养2-3 h至0D600 = 0. 35-0. 5左右；
II、将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4°C下3000 r/min离心10 min ；
III、弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10 mL轻轻悬浮细胞，冰上放置 15-30 min 后，4°C下 3000 r/min 离心 10 min ；
IV、弃去上清，加入4mL预冷含15%甘油的0.05 mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；
V、将感受态细胞分装成200 μ L的小份，贮存于-80°C可保存半年；
④质粒DNA的转化
I、从-80°C冰箱中取出一管大肠杆菌感受态细胞ft饭α，置于冰上融化；
II、在无菌条件下加入10μ L连接反应液，轻轻涡旋混勻后，在冰上放置30 min ；
III、42°C水浴热击90s，不要摇动，之后迅速放入冰浴冷却2-3 min ；
IV、加入700μ L无Amp的LB液体培养基，混勻后，37°C、100 r/min摇床振摇培养，温 育 45 min ；
V、取100μ L已转化的菌液涂于一个LB/Amp的培养平板上，正面朝上放置30 min，待 菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住，然后倒转培养皿，37°C避光培养16-24 h ；随后筛 选阳性菌落；
⑤重组菌落的鉴定与保存
从外观上看，一般白色且圆的菌落为阳性，准确鉴定还需要以下的步骤
I、在过夜培养的平板上用灭菌的牙签挑取几个白色菌落，分别点种于盛有含0.1 g/L Amp的LB液体培养基的1. 5 mL离心管中，37°C、100 r/min振摇培养过夜；
II、取10μ L的菌悬液于1.5 mL离心管中，加入90 PLddH2O,煮沸10 min，离心，取 上清液2 μ L作为模板，用引物jfl/jxl进行PCR扩增，PCR扩增体系和扩增条件均同前，用 1%的非变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；如果产物为目的条带时，此重组菌落为阳性克 隆，否则为阴性；同时设不加菌悬液的阴性对照；
III、取已经鉴定的阳性克隆的菌落悬浮液750μ L，加入250 μ L的灭菌甘油，混勻后， 用液氮速冻，置于-80°C冰箱中保存备用；
IV、最后送英骏生物技术公司测序，所得序列在NCBI的Blastn进行比对分析，验证克 隆片段是否正确。实施例3
本实施例为SpTPSl基因3’端的克隆，方法如下
根据上述中间片段的测序结果，设计合成1个特异性上游引物
Si: 5' -GCCATCAGAGAAAGCGGTTACT-3’ ，
另外设计合成1个3’端通用性下游引物
AP2: 5' -TACGTACGGCATGACAGTG-3‘；
以前述实施例2得到的中间片段cDNA第一链为模板，利用上游引物Sl和下游引物AP2 进行PCR扩增； 扩增体系为
TaqPlusPCR Master Mix 10 μ L ， cDNA 模板2 yL，
2X 引物(S1/AP2)0. 5 μ L，
ddH207 μ ο扩增程序为 94°C，3 min ；
94°C, 30 s;55°C，45 s;72°C，l min 30 s (33 个循环)72°C，8 min ；12°C保温。取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。扩增得到的产物为SpTPSl基因3’端，通过克隆测序，得到的3’端序列如SEQ ID NO. 4所述。克隆测序参照前述中间片段的测序方法，将电泳检测后的产物经胶回收试剂盒回 收，再将回收的产物克隆到PMD18-T载体上，转化E. coli DH5a感受态细胞，以S1/AP2为 引物，经菌液PCR验证后，用质粒小提试剂盒提取质粒(北京天根生化科技有限公司)，并将 菌液送英骏生物技术公司测序。所得序列在NCBI的Blastn进行比对分析，验证克隆片段 是否正确。实施例4
本实施例为SpTPSl基因5’端的克隆，包括下述步骤
(1)、5，端的cDNA第一链合成
以上述实施例1所得纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以下述特异性下游引物jxl 和5，端接头上游引物SMARTIIA Oligo为反转录引物，采用MMLV Reverse Transcriptase (大连宝生物公司)进行反转录，反转录扩增体系总体积为10 μ L jxl: 5’ -TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3’，
SMARTIIA Oligo 5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3，； 合成得到反转录产物5’端的cDNA第一链；
(2)、第一段PCR扩增
根据上述步骤(2 )得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物A2 A2: 5，-TCTTTTCATTTTGACAGGCGAC-3，，
再根据设计中间片段的5个已知的6-磷酸海藻糖合成酶序列的比对(同上)，在靠近5’ 端处寻找同源区段，设计并合成同源上游引物Cl Cl 5' -ATCGGATGGCCTGGTGTCTATG-3，；
以前述步骤(1)所得反转录产物5’端的cDNA第一链为cDNA模板，利用特异性下游引 物A2和同源上游引物Cl，进行5’端第一段PCR扩增； 扩增体系为
TaqPlusPCR Master Mix 12 μ L ， cDNA 模板2 yL，
2X 引物(A2/C1)0. 5 μ L，
ddH205 yL ο扩增程序为 94°C，3 min ；
94 °C, 30 s ；65 °C, 45 s;72°C，l min 30 s (2 个循环)； 每两个循环递减2V ；
94°C, 30 s;55°C，45 s;72°C，l min 30 s (25 个循环)； 72°C，8 min ；12°C保温。取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。扩增得到的产物为分7757基因5’端第一段，通过克隆测序，得到的5’端第一段序列如SEQ ID NO. 5所述。克隆测序参照前述中间片段的测序方法，将电泳检测后的产物经胶回收试剂盒回 收，再将回收的产物克隆到PMD18-T载体上，转化E. coli DH5 α感受态细胞，以A2/C1为 引物，经菌液PCR验证后，提取质粒，并将菌液送英骏生物技术公司测序。所得序列在NCBI 的Blastn进行比对分析，验证克隆片段是否正确。(3)、第二段 PCR 扩增
根据前述步骤(2 )所得cDNA 5 ’端第一段的序列，设计并合成特异性下游引物Α5 Α5: 5' -GCGGTCTTCTTGACGCAATCCAATGTAG-3’，
另外根据5’端反转录接头引物设计合成1个5’端通用性上游引物Ρ3 Ρ3: 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3‘；
以前述步骤(1)所得反转录产物5’端的cDNA第一链为cDNA模板，利用特异性下游引 物Α5和5’端通用性上游引物Ρ3，进行5’端第二段PCR扩增 扩增体系为
TaqPlusPCR Master Mix 10 μ L ， cDNA 模板1.5 μ L，
2Χ 引物(Α5/Ρ3)0. 5 μ L，
ddH207. 5 μ L。扩增程序为
94°C, 30 s;72°C，2 min (5 个循环)； 94°C, 30 s;70°C，30 s;72°C，2 min (5 个循环)； 94 °C, 30 s ；68 °C, 30 s;72°C，2 min (25 个循环)； 12°C保温。取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。扩增得到的产物为分7757基因5’端第二段，通过克隆测序，得到的5’端第二段 序列如SEQ ID NO. 6所述。克隆测序参照前述中间片段的测序方法，将电泳检测后的产物经胶回收试剂盒回 收，再将回收的产物克隆到PMD18-T载体上，转化E. coli DH5a感受态细胞，经菌落PCR 验证后，送英骏生物技术公司测序。所得序列在NCBI的Blastn进行比对分析，验证克隆片 段是否正确。实施例5
本实施例为SpTPSl基因开放阅读框ORF克隆，方法如下
将上述实施例2所得中间片段序列、实施例3所得3’端序列、和实施例4所得5’端第 一段序列和第二段序列进行拼接，得到cDNA全长(作为ORF扩增的cDNA模板)，通过NCBI里 ORF finder工具分析开放阅读框，并根据表达载体的酶切位点的需要设计上游引物0RF4 和下游引物0RF5如下
ORF 4 5' -CCCAAGCTT(Hind III)CCTCGAG(Xho I )ATGCCTACTCCGTATTCCAATAC -3，， 0RF5: 5，-CGC GGATCC (BamH I ) ATTMTTATCGACAGCGACAACC-3，； 以拼接得到的cDNA全长作为ORF扩增的cDNA模板，以上游引物0RF4和下游引物0RF5 进行PCR扩增扩增体系为
2 X GC Buffer I (含 Mg+)
2X 引物(0RF4/0RF5)
cDNA模板
dNTP Mixture
TaKaRa LA Taq
ddH90
10 yL ,
0. 5 μ L， IyL, 3. 2 μ L， 0. 2 μ L，
4.6 yL。扩增程序为
94°C，5 min ；
94 °C, 30 s ；57°C, 1 min 30 s;72°C，2 min (10 个循环)； 94°C, 30 s;72°C，2 min 30 s (25 个循环)； 72°C，8 min ；12°C保温。取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。扩增得到的产物为完整开放阅读框，即垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因， 通过克隆测序，即得其基因序列，如SEQ ID NO. 1所述；其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所述。克隆测序参照前述中间片段的测序方法，将电泳检测后的产物经胶回收试剂盒回 收，再将回收的产物克隆到PMD18-T载体上，转化E. coli DH5 α感受态细胞，经菌液PCR 验证后，送英骏生物技术公司测序。所得序列在NCBI的Blastn进行比对分析。实施例6
由于基因在克隆、表达过程中具有诸多不确定性，最终得到的基因是否具有如预料 相应的功能也是不确定的；因此，本实施例中，为了研究所克隆的上述垫状卷柏的海藻 糖-6-磷酸合成酶基因(SpTPSl)是否具有某些特定的功能，发明人进行了深入研究，以便 进一步验证其功能，具体操作如下
(1)、构建植物表达载体，农杆菌介导转化玉米获得转基因再生植株 由单子叶植物组成型启动子Ubiquitin启动垫状卷柏海藻糖合成酶基因SpTPSl，以抗 除草剂基因Bar为选择标记，构建表达载体pTU+SpTPSl，如图6所示。图6中LB，植物表 达载体左边界(长度25bp，L25);RB，植物表达载体右边界(长度25bp，R25) ;bar，抗除草剂 选择标记基因；TEV enhancer,增强子，作用是增强bar基因的表达；2XPS，串联的两个35S 启动子，启动bar基因的表达；Ubiquitin，单子叶植物玉米泛素启动子；T-nos，胭脂碱合成 酶终止子；aadA，壮观霉素标记，用于表达载体转化大肠杆菌时作为筛选标记。以玉米自交系18-599的胚性愈伤组织为受体，农杆菌介导转化pTU+spTPSl，经过 除草剂筛选，分化得到再生植株。(2)、再生植株的分子鉴定
对再生植株进行目的基因PCR检测(目的基因的提取方法和检测方法同以上实施例中 SpTPSl基因的提取方法和检测方法)，得到一株阳性植株并到云南加代繁殖种子，收获38 个后代株系。转spTPSl基因的38个Tl代株系，部分株系PCR检测如图7所示，M为DNA分子 量标记DL2000, CK-为阴性对照；CK+为阳性质粒(pTU+spTPSl)对照，D6、C3、A6、E4、B5分别为转spTPSl基因Tl代不同株系，各转基因Tl代不同株系结果全为阳性。选择基因组DNA量足够的E4和A6两个株系，用能均勻将基因组DNA切割成几kb 左右大小的限制性内切酶Spe I和Apa I酶切E4和A6两个株系的基因组DNA，酶电泳分 离酶切产物后进行Southern杂交检测，如图8所示，1为Tl代转基因株系E4 {Spe I酶 切)，2为未转基因对照，3.为阳性对照(pTU+SpTPSl)，4为Tl代转基因株系E4 (如a I酶 切)，5为Tl代转基因株系A6 (^a I酶切);结果表明，SpTPSl基因以单拷贝形式整合到 了玉米基因组中。(3)、转spTPSl基因T2代株系的耐旱性鉴定
于2010年在新疆和四川等地分别设置鉴定点进行。据各鉴定点的田间调察，转基因植 株平均株高1.5 m，比对照降低0.8 m，株型紧凑。对鉴定材料进行干旱处理，高度降低、株 型紧凑的转基因植株叶片仍然保持舒展，而非转基因对照叶片严重卷曲、萎焉。转基因植株 初步表现出较强的耐旱性。
序列表 <110>四川农业大学
<120> 一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法
<160> 6
<210> 1
<211> 2790
<212> DNA
<213>来源于垫状卷柏(Selaginella pulvinata Maxim)的海藻糖_6_磷酸合成酶基 因的核苷酸序列
〈400〉 1atgcctactccgtattccaatacgaattcctcaagcgctcccttagtgcctctcaatctc60aatctgccgccttcgttagcgtcttccagagtcgagcgccttgtccgagagcggcaactg120aggaggaatgacgaccagcctgaatcggtgcaagaatcgcacgaacaggtacaagatcat180acgcaggagcagccggattcacccttgacgccggatcgtcagcagcggctgctcgttgta240gcgaatcggttgccggtttccgccacgcgcaagggcgacgatcaatggagcttggaagtg300agcgctggcggcctcgtctctgcgcttcttggtgtgaagcagttccaggtagtatggatc360ggccggcccggtgtctatgtccaggacgagctcggcaagcaatcgcttgccaaggcgctt420gaggaaaagggatttgtgggtgtgttgctagacgaggaaacagtggatcaatattacaat480ggctactgcaacaatgtcttgtggcctctctttcactacattggattgcgtcaagaagac540CgCCtggCCgcgactcgaagtcttcaatcacaattcggcgcctacaagcgtgcaaacagg600ctgtttgcagatgccgtcattaaacactaccaagaaggcgatttcgtttggacacatgat660tatcacctcatggtcctgcctagctatctcaaggagcacgacccacgaatgaaagtcgga720tggttcctgcacactccatttccttcatctgaaatatatagaacactgcctctccgctca780gaattgcttcagggtgtccttggtgcagatttggttggtttccacacgtacgactatgcc840aggcattttgttagcgcctgtacaaggatattgggtctggaagggactcccgagggagtg900gaagatcaagggaaaataacgcgtgttgccgcgtttcctgtcgggatagattctgaaagg960tgcatccaggctgttgaaacagatgcagtgaagaagcatatagaagaactcagtgccaga1020tttgctggccgtaaggtgatgttgggagtggataggcttgatccaattaagggcatacca1080caaaagctactcgcatttgagaagtttttggaggaaaatccacattggcgtgacaaggtg1140attctggtccagattgcggttcccacaagacaagatgtgctggaatatcaaaagctcgca1200agccaggtgcatgaaatcgtgggtcgcatcaacggtcgttacggttctcttacgactgta1260cccatccaccatctcgaccgttcgatgaaatttcctgagctctgtgctttgtacaccatt1320actgatgtgttgcttgtaacatccttacgggatggtatgaacctcgttagctacgagttt1380gtcgcctgtcaaaatgaaaagaagggagctctcgtattaagtgagttcgcaggtgctgca1440caatcactaggtgcaggctcaattttggtaaacccatggaacattattgaaaccgctaat1500gctattggagaagcacttaacatgcccgaggaagaacgtgaagagcgtcatagacttaac1560ttcatgcacgttacaccccatagtgctcaggtctgggcggagacattcaccagtgaattg1620aatgactcaatactggaggcggagctgcgtactttgcatattcctccacaactgccatca1680gacaaagtggttactaagttcgccgagtcgaagaatcggctaatgattctgggtttcaat1740tctgcactaactgcaccagtggaagctccacgtggaagagctcctgaccagattagagaa1800atgaagattcgcctacatccaaacttggaagaagtgttcaatgttctttgcagtgatcca1860agaaccactatagtcattcttagtgggagtgaacgtgctgttttggatgaggcatttgga1920gagtttgatatgtggttggcagcagagaatggaatgtttcttcgtcacacacaaggagag1980tggatgacaaccatgcctgagcacctaaacatggattgggtagagagtgtacagttggta2040tttgattatttctgtgagagaacgcctcgttcgtttgtggaagcccgtggaacttcattg2100gtgtggaattacaagtatgcagatgtggaatttgggagagtacaagcacgggatatgcta2160cagcatctttggacaggaccgatttccaatgcagctgtggatgttgttcaaggtgggagg2220tctgtagaagttcgccctgttggagtctcaaagggctctgcaattgatcggattcttggg2280gagattgtacatagcaagcacatggttactcctattgatttcgttatgtgtattggtcat2340ttcttgagcaaggatgaagatatatacacattctttgagccagagctcccatttttagag2400agcggaaattcaagtgcaaaggttctagacaagagattaggttccaagggatctggcaaa2460ttaggtggatcaaggctcaaatcttatcctccaatgtctcctgacagggtggtgcgcaag2520attgatgatgagcggctgattgaagacgctggtagatgggaaggctcgtcagtgcttgat2580ctcaagggtg3.3.3.3. 3. ctcttgtgctgtggggactatgaagcgttcattagcacga2640tactgtttgaattcttctgacgaagtacttacattcttgagctcacttgctgcggcttca2700gaatcttttcctcaaaagaggagcgattcctttaagaggaatggtggatggcatagccca2760actccaagggttgtcgctgtcgataattaa2790
<210> 2 <211> 929 <212> PRT
<213>来源于垫状卷柏(Selaginella pulvinata Maxim)的海藻糖_6_磷酸合成酶基 因的氨基酸序列 <400> 2
Met Pro Thr Pro Tyr Ser Asn Thr Asn Ser Ser Ser Ala Pro Leu Val 151015Pro
Arg
Ser
Pro
65
Ala
Ser
Lys
Asp
Phe 145 Gly
Arg
Gly
His
Val 225 Trp
Pro
Gly
Arg
Lys 305 Cys
Leu Asn Leu
Val
35
Gln
Ser
Arg
Glu
Phe 115 Leu
Gly
Cys
Glu
Tyr 195 Gln
Pro
Leu
Arg
His 275 Leu
Val 50 Asp
Asn
Leu
Gln
Glu 130 Val
Tyr
Gln
Ala
Tyr 210 Leu
Phe
Leu
Phe
lie 290
lie Thr lie Gln
Leu 20 Arg
Glu
Pro
Leu
Val 100 Gln
Gly
Val
Asn
Asp 180 Lys
Glu
Ser
His
Ser 260 Thr
Gly
Arg
Ala
Asn
Glu
Ser
Leu
Pro
85
Ser
Val
Lys
Leu
Asn 165 Arg
Arg
Gly
Tyr
Thr 245 Glu
Tyr
Leu
Val
Val
Leu
Arg
His
Thr
70
Val
Ala
Val
Gln
Leu 150 Val
Leu
Ala
Asp
Leu 230 Pro
Leu
Asp
Glu
Pro Pro Gln
Glu 55 Pro
Ser
Gly
Trp
Ser 135 Asp
Leu
Ala
Asn
Phe 215 Lys
Phe
Leu
Tyr
Gly 295 Ala Ala 310
Glu Thr
Leu
40
Gln
Asp
Ala
Gly
lie 120 Leu
Glu
Trp
Ala
Arg 200 Val
Glu
Pro
Gln
Ala 280 Thr
Phe
Asp
Ser
25
Arg
Val
Arg
Thr
Leu 105 Gly
Ala
Glu
Pro
Thr 185 Leu
Trp
His
Ser
Gly 265 Arg
Pro
Pro
Ala
Leu
Arg
Gln
Gln
Arg
90
Val
Arg
Lys
Thr
Leu 170 Arg
Phe
Thr
Asp
Ser 250 Val
His
Glu
Val
Val
Ala
Asn
Asp
Gln
75
Lys
Ser
Pro
Ala
Val 155 Phe
Ser
Ala
His
Pro 235 Glu
Leu
Phe
Gly
Ser Ser Asp
His 60 Arg
Gly
Ala
Gly
Leu 140 Asp
His
Leu
Asp
Asp 220 Arg
lie
Gly
Val
Val 300 lie
Gly 315
Lys Lys
Asp
45
Thr
Leu
Asp
Leu
Val 125 Glu
Gln
Tyr
Gln
Ala 205 Tyr
Met
Tyr
Ala
Ser 285 Glu
Asp
His
Arg
30
Gln
Gln
Leu
Asp
Leu 110 Tyr
Glu
Tyr
lie
Ser 190 Val
His
Lys
Arg
Asp 270 Ala
Asp
Ser
lie
Val
Pro
Glu
Val
Gln
95
Gly
Val
Lys
Tyr
Gly 175 Gln
lie
Leu
Val
Thr 255 Leu
Cys
Gln
Glu
Glu
Glu
Glu
Gln
Val 80 Trp
Val
Gln
Gly
Asn 160 Leu
Phe
Lys
Met
Gly 240 Leu
Val
Thr
Gly
Arg 320 GluLeu Ser Ala Arg 340 Ile
Leu Asp
Phe
Ile 385 Ser
Leu 370 Ala
Asn 465 Gln
Glu
Arg
Ala
Leu 545 Asp
Leu
Val 625
Pro 355 Glu
Gln Leu Thr
Val Val His Thr
Glu Leu Cys 435 Asp
Leu Arg 450
Glu Lys
Thr Ala Glu
Gln 530 Glu
Lys Leu Gly Arg Ala
Glu 515 Val
Ala
Val
Phe
Glu 610
lie
Pro 595 Glu
325 Phe
Val 420 Ala
Gly
Lys Gly Ser Leu Gly
Ala 485 Ala
Asn 500
Arg His
Trp Glu Leu Val
Asn 580 Asp
Ala Gly
Lys Glu Asn Pro Pro Thr
Gly Arg lie
Glu 405 Pro
Arg 390 lie
His 375 Gln
Ala 470 Gly
lie
Arg Leu Ala Glu
Thr 565 Ser
Gln Val Phe Leu Ser Gly
Ala lie Arg Asn
Ser 630
Pro 360 Trp
Lys 345 Gln
Asp Val Gly
lie His His Leu Tyr Thr Met Asn
Leu 455 Leu
lie 440 Val
Leu 425 Thr
Thr 535 Arg Thr 550
Lys Phe
Asn 520 Phe
Glu 600
Leu
330 Val
Met Leu Gly
Arg Val Leu Arg
lie 410 Asp
Glu 395 Asn
Asp Ser Tyr
Arg Ser Met Val Leu Glu
Val Leu Ser Ser lie Leu Gly Glu
Glu 475 Asn
Phe 460 Phe
Val 490
Leu Asn Met Pro
Ala 505
Phe Met His Val
Thr Ser Glu
Leu His lie
Ala Glu Leu Thr
Ala 585 Met
Ser 570 Pro
Pro 555 Lys
Val Leu Cys 615
Glu Arg Ala Val
Val Lys lie Ser Asp
Leu 635
Leu 540 Pro
Asn
Glu
Arg
Pro 620 Asp
Leu 605 Arg
Val 350 Phe
Lys Leu Leu Ala 365
Asp Lys Val lie Leu
Val 380
Tyr Gln Gly Arg
Leu 445 Val
Thr 525 Asn
335 Asp
Glu
Val
Lys Leu Tyr
Lys 430 Val
Gly 415 Phe
Ala Ala Gly Pro Trp Asn
Glu 510
Pro
Gln Leu Pro Arg Leu Ala
Pro 590 His
Thr Glu Ala
Thr Phe
Arg
Lys
Gln
Ala 400
Ser
Pro
Thr Ser Cys Gln Ala
lie 495 Glu
Ala 480 lie
Glu
His Ser
Asp Ser lie
Met 575 Arg
Ser 560 lie
Gly Pro Asn lie
Gly 640
18Glu Phe
Thr Gln
Trp Val
Pro Arg 690 Lys Tyr 705
Gln His
Gln Gly
Ser Ala
Val Thr 770 Asp Glu 785
Ser Gly
Gly Ser
Ser Pro
Asp Ala 850 Asn Tyr 865
Tyr Cys Ala Ala Arg Asn
Asp
Gly
Glu 675
Ser
Ala
Leu
Gly
lie 755 Pro
Asp
Asn
Gly
Asp 835 Gly
Phe
Leu
Ala
Gly 915
Met
Glu 660
Ser
Phe
Asp
Trp
Arg 740 Asp
lie
lie
Ser
Lys 820 Arg
Arg
Ser
Asn
Ser 900 Gly
Trp 645 Trp
Val
Val
Val
Thr 725 Ser
Arg
Asp
Tyr
Ser 805 Leu
Val
Trp
Cys
Ser 885 Glu
Trp
Leu
Met
Gln
Glu
Glu 710 Gly
Val
lie
Phe
Thr 790 Ala
Gly
Val
Glu
Ala 870
Ser
Ser His
Ala
Thr
Leu
Ala 695 Phe
Pro
Glu
Leu
Val 775 Phe
Lys
Gly
Arg
Gly 855 Val
Asp
Phe
Ser
Ala
Thr
Val 680 Arg
Gly
lie
Val
Gly 760
Met
Phe
Val
Ser
Lys 840 Ser
Gly
Glu
Pro
Pro 920
Glu
Met 665 Phe
Gly
Arg
Ser
Arg 745 Glu
Cys
Glu
Leu
Arg 825 lie
Ser
Thr
Val
Gln 905 Thr
Asn 650 Pro
Asp
Thr
Val
Asn 730 Pro
lie
lie
Pro
Asp 810 Leu
Asp
Val
Met
Leu 890 Lys
Pro
Gly
Glu
Tyr
Ser
Gln 715 Ala
Val
Val
Gly
Glu 795
Lys
Lys
Asp
Leu
Lys 875 Thr
Arg
Arg
Met
His
Phe
Leu 700 Ala
Ala
Gly
His
His 780 Leu
Arg
Ser
Glu
Asp 860 Arg
Phe
Ser
Val
Phe
Leu
Cys 685 Val
Arg
Val
Val
Ser 765 Phe
Pro
Leu
Tyr
Arg 845 Leu
Ser
Leu
Asp
Val 925
Leu
Asn 670 Glu
Trp
Asp
Asp
Ser 750 Lys
Leu
Phe
Gly
Pro 830 Leu
Lys
Leu
Ser
Ser 910 Ala
Arg 655 Met
Arg
Asn
Met
Val 735 Lys
His
Ser
Leu
Ser 815 Pro
lie
Gly
Ala
Ser 895 Phe
Val
His
Asp
Thr
Tyr
Leu 720 Val
Gly
Met
Lys
Glu 800
Lys
Met
Glu
Glu
Arg 880 Leu
Lys
Asp
Asn
<210> 3 <211> 979<212> DNA
<213>来源于垫状卷柏(Selaginella pulvinata Maxim)的海藻糖_6_磷酸合成酶基 因的中间片段核苷酸序列 <400> 3
ttggtcgtaaggttatgttgggagtggataggcttgatccaattaagggcataccacaaa60agctactcgcatttgagaaatttttggaggaaaatccacattggcgtgacaaggtgattc120ttgtccagattgcggttcccacaagacaagatgtgctggaatatcaaaagctcgcaagcc180aggtgcatgagatcgtgggtcgcatcaacggtcgttacggttctcttacgactgtaccca240tccaccatctcgaccgttcgatgaaatttcttgagctctgtgctttgtacgccattactg300atgtgttgcttgtaacatccttacgggatggtatgaacctcgttagttacgaatttgtcg360cctgtcaaaatgaaaagaagggagctctcgtattaagtgagttcgcaggtgctgcacaat420cactaggtgcaggctcaattctggtaaacccatggaacattattgaaaccgctaatgcta480ttggagaagcacttaacatgcccgaggaagaacgtgaagaacgtcatagacttaacttca540tgcacgttacaactcatagtgctcaggtctgggcggagacattcaccagtgaattgaatg600actcaatattggaggcggagctgcgtactttgcatattcctccacaactgccatcagaga660aagcggttactaagtttgccgagtcgaagaatcggctaatgattctgggtttcaattctg720cactaactgcaccagtggaagctccacgtggaagagctcctgaccagattagagaaatga780agattcgcctacatccaaacttgaaagaagtgttcaatgttctttgcagtgatccaagaa840ccactatagtcattcttagtgggagtgaacgtgctgtattggatgaggcatttggagagt900ttgatatgtggttggcagcagagaatggaatgttccttcgtcacacacaaggagagtgga960tgacaacaatgcccgaaca979
<210> 4 <211> 1255 <212> DNA
<213>来源于垫状卷柏(Selaginella pulvinata Maxim)的海藻糖_6_磷酸合成酶基 因的3'端核苷酸序列 <400> 4
tgccatcagagaaagcggttactaagttcgccgagtcgaagaatcggctaatgattctgg60gtttcaattctgcactaactgcaccagtggaagctccacgtggaagagctcctgaccaga120ttagagaaatgaagattcgcctacatccaaacttggaagaagtgttcaatgttctttgca180gtgatccaagaaccactatagtcattcttagtgggagtgaacgtgctgttttggatgagg240catttggagagtttgatatgtggttggcagcagagaatggaatgtttcttcgtcacacac300aaggagagtggatgacaaccatgcctgagcacctaaacatggattgggtagagagtgtac360agttggtatttgattatttctgtgagagaacgcctcgttcgtttgtggaagc ccgtgaaa420cttcattggtgtggaattacaagtatgcagatgtggaatttgggagagtacaagcacggg480atatgctacagcatctttggacaggaccgatttccaatgcagctgtggatgttgttcaag540gtgggaggtctgtagaagttcgccctgttggagtctcaaagggctctgcaattgatcgga600ttcttggggagattgtacatagcaagcacatggttactcctattgatttcgttatgtgta660ttggtcatttcttgagcaaggatgaagatatatacacattctttgagccagagctcccat720ttttagagagcggaaattcaagtgcaaaggttctagacaagagattaggttccaagggat780ctggcaaattaggtggatcaaggctcaaatcttatcctccaatgtctcctgacagggtgg840tgcgcaagattgatgatgagcggctgattgaagacgctggtagatgggaaggctcgtcag900tgcttgatctcaagggtgaaaattatttctcttgtgctgtggggactatgaagcgttcat960tagcacgatactgtttgaattcttctgacgaagtacttacatttttgagctcacttgctg1020cggcttcagaatcttttcctcaaaagaggagcgattcctttaagaggaatggtggatggc1080atagcccaactccaagggttgtcgctgtcggaaaggaaaggcgtggtacg1140cttgtggctgaacaccaagaagacaaaggtacacctaaatgtgtaatgtgtgcttattta1200ttcttttattcgaaaagaagtgtacattcagttgagctaa1255
<210> 5 <211> 1045 <212> DNA
<213>来源于垫状卷柏(Selaginella pulvinata Maxim)的海藻糖_6_磷酸合成酶基 因的5'端第一段核苷酸序列 <400> 5
atcggatggcctggtgtctatgtccaggacgagctcggcaagcaatcgcttgccaaggcg60cttgaggaaaagggatttgtgggtgtgttgctagacgaggaaacagtggatcaatattac120aatggctactgcaacaatgtcttgtggcctctctttcactacattggattgcgtcaagaa180gaccgcctggccgcgactcgaagtcttcaatcacaattcggcgcctacaagcgtgcaaac240aggctgtttgcagatgccgtcattaaacactaccaagaaggcgatttcgtttggacacat300gattatcacctcatggtcctgcctagctatctcaaggagcacgacccacgaatgaaagtc360ggatggttcctgcacactccatttccttcatctgaaatatatagaacactgcctctccgc420tcagaattgcttcagggtgtccttggtgcagatttggttggtttccacacgtacgactat480gccaggcattttgttagcgcctgtacaaggatattgggtctggaagggactcccgaggga540gtggaagatcaagggaaaataacgcgtgttgccgcgtttcctgtcgggatagattctgaa600aggtgcatccaggctgttgaaacagatgcagtgaagaagcatatagaagaactcagtgcc660agatttgctggccgtaaggtgatgttgggagtggataggcttgatccaattaagggcata720ccacaaaagctactcgcatttgagaagtttttggaggaaaatccacattggcgtgacaag780gtgattctggtccagattgcggttcccacaagacaagatgtgctggaatatcaaaagctc840gcaagccaggtgcatgaaatcgtgggtcgcatcaacggtcgttacggttctcttacgact900gtacccatccaccatctcgaccgttcgatgaaatttcctgagctctgtgctttgtacgcc960attactgatgtgttgcttgtaacatccttacgggatggtatgaacctcgttagctacgag1020tttgtcgcctgtcaaaatgaaaaga1045
<210> 6 <211> 575 <212> DNA
<213>来源于垫状卷柏(Selaginella pulvinata Maxim)的海藻糖_6_磷酸合成酶基 因的5'端第二段核苷酸序列 <400> 6agcagtggta aggtttgcct cttcacatgc aatctcaatc caactgagga gatcatacgc gttgtagcga gaagtgagcg tggatcggct gcgcttgagg
tcaacgcaga gtacgcgggg ctctccactt acctagtaag ctactccgta ttccaatacg tgccgccttc gttagcgtct ggaatgacga ccagcctgaa aggagcagcc ggattcatcc atcggttgcc ggtttccgcc ctggcggcct cgtctctgcg ggcccggtgt ctatgtccag aaaagggatt tgtgggtgtg
atatatgagt tttattttag
tggttggttt CCCgtgtgtt
aattcctcaa gcgctccctt tccagagtcg agcgccttgt tcggtgcaag aatcgcacga ttggcgccgg atcgtcagca acgcgcaagg gcgacgatca cttcttggtg tgaagcagtt gacgagctcg gcaagcaatc ttgca
0￡1￡1￡10 ￡Ι ￡1￡160cgtctgccgt120agtgcctctc180ccgagagcgg240acaggtacaa300gcggctgctc360atggagcttg420ccaggtagta480gcttgccaag54057权利要求
一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，该序列具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的序列，其特征在于所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所述。
3.—种权利要求1所述的来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列的克隆方 法，包括下述主要步骤(1)总RNA的提取和纯化采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物垫状卷柏叶片中提取得到纯化的垫 状卷柏叶片总RNA ；(2)中间片段的克隆A、中间片段cDNA第一链的合成以上述步骤(1)纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以oligod (T) 18 :5’ -GCTGTC AACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T) 18-3，为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的 cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的cDNA模板；B、PCR扩增以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为cDNA模板，利用下述上游引物jfl和 下游引物jxl，进行PCR扩增jfl: 5’ -TGGTCGTAAGGTTATGTTGGG-3’， jxl: 5’ -TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3’ ；扩增得到垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到 中间片段序列；(3)3，端的克隆以前述步骤(2)A中得到的cDNA第一链为模板，利用下述上游引物Sl和下游引物AP2 进行PCR扩增Si: 5' -GCCATCAGAGAAAGCGGTTACT-3’，AP2: 5' -TACGTACGGCATG ACAGTG-3'；扩增得到完整的3’端，通过克隆测序，得到3’端序列；(4)、5’端的克隆C、合成5，端的cDNA第一链以上述步骤(1)纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以下述下游引物jxl和上游引 物SMARTIIA Oligo为反转录引物，进行反转录 jxl: 5’ - TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3，，SMARTIIA Oligo 5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3，； 合成得到反转录产物5’端的cDNA第一链；D、第一段PCR扩增以前述步骤C所得反转录产物5’端的cDNA第一链为cDNA模板，利用下述下游引物A2 和同源上游引物Cl，进行5’端第一段PCR扩增 A2: 5，-TCTTTTCATTTTGACAGGCGAC-3，， Cl 5' -ATCGGATGGCCTGGTGTCTATG-3，；扩增得到的产物为cDNA 5’端第一段，通过克隆测序，得到5’端第一段的序列； E、第二段PCR扩增以前述步骤C所得反转录产物5’端的cDNA第一链为cDNA模板，利用下述下游引物A5 和上游引物P3，进行5’端第二段PCR扩增；A5: 5' -GCGGTCTTCTTGACGCAATCCAATGTAG-3’， P3: 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3‘；扩增得到的产物为cDNA 5’端第二段，通过克隆测序，得到5’端第二段序列； (5) ORF的克隆和拼接将上述步骤(2)所得中间片段序列、步骤(3)所得3’端序列、和步骤(4)所得5’端第 一段序列和第二段序列进行拼接，得到的cDNA全长作为ORF扩增的cDNA模板； 以下述上游引物0RF4和下游引物0RF5进行PCR扩增ORF 4 5' -CCCAAGCTT(Hind III)CCTCGAG(Xho I )ATGCCTACTCCGTATTCCAATAC -3，， 0RF5: 5， -CGC GGATCC (BamH I )ATTAATTATCGACAGCGACAACC-3，； 扩增得到的产物为完整开放阅读框，即垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因，通过 克隆测序，即得其基因序列。
4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(1)中，采用的RNA提取 方法为Trizol法；纯化方法为DNA酶消化法。
5.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(2)中进行PCR扩增时， 扩增体系为TaqPlusPCR Master Mix 10 μ L ， cDNA 模板1 yL，2X 引物jxl/jfl0.5 yL ,ddH208 yL ；扩增程序为 94°C，5min ；94°C, 30 s，55°C，45 s，72°C，l min 30 s ;30 个循环； 72°C，8 min ；4°C保温。
6.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(3)中进行PCR扩增时， 扩增体系为TaqPlusPCR Master Mix 10 μ L ， cDNA 模板2 yL，2X 引物S1/AP20. 5 μ L，ddH207 μ ；扩增程序为 94°C，3 min ；94°C, 30 s;55°C，45 s;72°C，l min 30 s ;33 个循环； 72°C，8 min ； 12°C保温。
7.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(4)中进行第一段PCR扩 增时，扩增体系可优选为 TaqPlusPCR Master Mix 12 μ L , cDNA 模板2 yL ,·2Χ 引物:A2/C10. 5 μ L，ddH205 yL ；扩增程序可优选为 94°C，3 min ；·94°C, 30 s;65°C，45 s;72°C，l min 30 s ；2 个循环； 每两个循环递减2°C ；··94°C, 30 s;55°C，45 s;72°C，l min 30 s ；25 个循环； 72°C，8 min ； 12°C保温。
8.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(4)中进行第二段PCR扩 增时，扩增体系为TaqPlusPCR Master Mix 10 μ L , cDNA 模板1.5 μ L，·2Χ 引物:Α5/Ρ30. 5 μ L，ddH207. 5 μ L ；扩增程序为·94°C, 30 s ;72°C，2 min ;5 个循环; 94°C, 30 s;70°C，30 s;72°C，2 min ；5 个循环； 94°C, 30 s ；68°C, 30 s;72°C，2 min ；25 个循环； 12°C保温。
9.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(5)中进行PCR扩增时， 扩增体系为·2 XGC Buffer I、含 Mg+10 μ L，·2X 引物0RF4/0RF50. 5 μ L，cDNA 模板IyL,dNTP Mixture3. 2 μ L，TaKaRa LA Taq0. 2 μ L，ddH204.6 yL ；扩增程序为 94°C，5 min ；·94°C, 30 s ；57°C, 1 min 30 s;72°C，2 min ； 10 个循环； 94°C, 30 s ；72°C，2 min 30 s ；25 个循环； 72°C，8 min ； 12°C保温。
全文摘要
本发明公开了一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，该序列具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。该序列是一种新的TPS基因序列，使人们对TPS基因的研究对象从大肠杆菌和真菌等微生物及少数有限的植物体进一步扩展到垫状卷柏等多种植物体。并且，根据该TPS基因在垫状卷柏植物体内催化合成的海藻糖所表现出的优良的抗旱、耐盐等性能可以预料如果将其通过转基因技术导入玉米等其他植物的基因中，将可培育出具有相应的优良的抗旱、耐盐等性能的植物新品种。本发明还公开了一种上述来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列的克隆方法。
文档编号C12N15/52GK101886086SQ20101021866
公开日2010年11月17日 申请日期2010年7月7日 优先权日2009年7月8日
发明者付凤玲, 李晚忱, 林荆, 牟禹, 蒋伟 申请人:四川农业大学