专利名称：microRNA生物标志物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属 于生物技术和医学领域，涉及一种分析血清/血浆样本中microRNA的稳 定性、并发现一组microRNA生物标志物及其在肝癌患者检测中的应用。本发明提供的生物 标志物、检测方法和检测试剂盒具备早期筛查和诊断肝癌的能力。
背景技术：
microRNAs (miRNAs)是一类非编码的长度为17 25nt的小RNA分子。它具有高 度保守性、时序性和组织特异性，在细胞生长和发育的调节过程中起多种作用。约50%的已 知人类miRNA基因定位于和肿瘤相关的染色体区域，而不断累积的研究成果也已充分证实 miRNA的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。血液是医学诊断中最常用的样本来源。当前对于血液的临床分析集中在一些蛋 白因子中，因核酸获得困难且含量少、质量不高而很少涉及核酸。近年来有研究发现，血液 中的外源RNA与细胞内RNA相比，很少存在核糖体RNA，多数为< 30nt、独立于细胞之外的 miRNA分子，它在人体中普遍存在。人体组织、血液及各种体液，包括汗液、尿液、泪液、羊水 等都存在小RNA。通常，血液中的miRNA与未成熟的胶原蛋白等形成颗粒存在，因而具有良 好的抗RNase降解能力，有较高的稳定性，因此可作为新的分子生物学标志。目前，对miRNA 稳定性研究仅局限于存放时间、温度及反复冻融等，对血清RNA的稳定性研究未见系统化 分析报道。作为生物检测样本，血清具有取材方便，无创伤性，并可连续体外检测的优点，由 于血清中miRNA特殊的稳定性，因此使基于miRNA定性和定量检测技术寻找癌症特异性的 血清miRNA作为分子标记物的方法比传统的蛋白分子标记方法将更加有效，进而可以克服 分子标记在抗体制备和定量分析上发展所遇到的瓶颈。因此，开发一种可辅助肝癌早期筛 查和诊断的血清miRNA作为生物标记物，具有广泛的科研价值和临床应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种miRNA生物标志物及其用途。为了解决上述技术问题，本发明提供一种microRNA (miRNA)生物标志物为 miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 中的任意 1 个miR-21 :uagcuuaucagacugauguugamiR-25 cauugcacuugucucggucugamiR-29c :uagcaccauuugaaaucgguuamiR-93 caaagugcuguucgugcagguagmiR-198 gguccagaggggagauagguucmiR-221 agcuacauugucugcuggguuucmiR-222 :agcuacaucuggcuacugggu。本发明还同时提供了上述miRNA生物标志物的用途用于制备具有肝癌检测能力的试剂盒。本发明还同时提供了一种具有肝癌检测能力的试剂盒，该试剂盒由反转录系统、 扩增系统和引物系统组成；所述反转录系统由M-MLV反转录酶、反转录体系5 XM-MLV缓冲液和RNase抑制剂 组成；所述扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成，其包括real-time PCRMaster Mix 禾口 50XROX reference引物系统由 miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 中的 任意1个的茎环(茎环结构)引物和扩增引物组成miR-21 莲环引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAACA TC-3，miR-25 莲环引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAGAC CG-3，miR-29c 莲环引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTAACC GAT-3'miR-93 莲环引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACCTACCT GC-3，miR-198 莲环引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAACC TAT-3'miR-221 莲环引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAAAC CCA-3'miR-222 莲环引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACACCCA
G-3，miR-21 PCR 正向引物5，miR-21 PCR 反向引物5，miR-25 PCR 正向引物5，miR-25 PCR 反向引物5，miR_29c PCR 正向引物5miR_29c PCR 反向引物5miR-93 PCR 正向引物5，miR-93 PCR 反向引物5，miR-198 PCR 正向引物5miR-198 PCR 反向引物5miR-221 PCR 正向引物5miR-221 PCR 反向引物5miR-222 PCR 正向引物5miR-222 PCR 反向引物518S rRNA PCR 正向引物5，-AAGACGGACCAGAGCGAA-3‘
-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGATG-3‘ -CCAGTCGAGGGTCCGAGGTATT-3’ -GGCGGCATTGCACTTGTCTCG-3’ -GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3’ ‘-CCCCGCCTAGCACCATTTGAAAT-3， ’ -CAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3‘ -CGCCCAAAGTGCTGTTCGTG-3’ -GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3’ ‘-GGGGGTCCAGAGGGGAGATAGGT-3‘ ’ -AGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3’ ’ -GCGAGCTACATTGTCTGCTGGGTT-3‘ ’ -GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3’ ’ -GACGCAGCTACATCTGGCTACTGG-3‘ ’ -AGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3’
18S rRNA PCR 反向引物5，-GGCGGGTCATGGGAAT-3，。本发明还同时提供一种对miRNA稳定性分析的方法，对血清/血浆样本进行一系 列条件的处理，包括以下步骤1)血清/血浆样本不同温度下处理3h :-80°C、-20°C、4°C、室温(10 25°C )和 37 °C ；2)室温下血清/血浆样本不同存放时间的处理0、l、3、6、12、24h ；3) 370C RNaseA不同时间条件消化血清/血浆样本的处理0、3、6、12h ；4) 370C DNase I不同时间条件消化血清/血浆样本的处理0、3、6、12h ；5)血清/血浆样本经不同反复冻融次数的处理0、2、5、7、10次；6)37°C血清/血浆样本经不同pH值溶液的处理对照、pH = 1、6、9、13 ；7)血清/血浆样本经RT-qPCR方法进行血清/血浆RNA稳定性分析。由该系统方法得到miRNA是稳定的，具有成为标志物的潜力。在本发明中，具有肝癌检测能力的试剂盒的使用步骤如下1)获取来源于被检测个体的生物样本；2)利用特异性的检测技术检测样本中生物标志物的表达；3)判定被检测个体是否患有肝癌。上述步骤1)中的生物样本为以下任意一种分离的被检测个体的血清或血浆，或 者为分离的被检测个体的肝组织，或者为分离的被检测个体的唾液、汗液、尿液、泪液、羊水 或其它体液。上述步骤2)中的生物标志物的检测是对分离的血清或血浆进行直接检测，或者 对血清或血浆中纯化的RNA样本进行检测。特异性的检测技术为实时荧光定量PCR技术， 该实时荧光定量PCR技术为茎环引物法或TaqMan探针法。本发明的目的之一在于通过一系列苛刻条件(不同温度、不同存放时间、RNase A、 DNase I、不同反复冻融次数和不同pH值溶液)处理血清，进而分析血清中miRNA的稳定性。本发明的目的之二，针对现有肝肿瘤标志物敏感性和特异性不能满足临床诊断的 需要，本发明提出一组稳定的、高效率检测肝癌的血清标志物及其在辅助肝癌早期筛查与 临床诊断中的应用。本发明所述的肿瘤血清标志物，由miR-21、miR_25、miR_29c、miR-93、miR-198、 miR-221 和 miR-222 组成。本发明通过实验方法得出以下结论，确定了血清中miRNA的稳定性，从而发现了 7 条miRNA可作为肝癌早期筛查与临床诊断的血清学生物标记物；具体如下1. miRNA在血清中的特异性表达如图1所示，经过RT-PCR定性检测及PCR产物序列测定和分析表明，在肝癌细胞 系Huh-7总RNA (图1-A)，肝癌组织总RNA (图1-B)，血清总RNA (图1-C)和血清(图1-D) 中均检测到目标miRNA的特异性表达，说明18S rRNA、miR-21、miR-25、miR_29c、miR-93、 miR-198、miR-221和miR-222等8种RNA在肝癌细胞系、肝癌组织及血清中均存在，为后续
实验提供基础。2. miRNA的稳定性研究如图2 图4所示，细胞系、组织样本提取得到的总RNA/血清直接用于不同温度下处理 3h :-80°C、-20°C、4°C、室温和 37°C (A)；不同存放时间处理0、1、3、6、12、24h(B)； 37°C RNase A不同时间消化处理0、3、6、12h (C) ；37°C DNase I不同时间消化处理0、3、6、 12h(D)；不同反复冻融次数处理0、2、5、7、10次(E) ；37°C不同pH值溶液的处理对照、pH =1、6、9、13(F)后，各miRNA的表达较对照相比差别不大，但mRNA(18S rRNA)显著降低。 miRNA在各种介质的各种苛刻条件下都是稳定的，由此说明miRNA具有成为肿瘤标志物的 潜力。3. miRNA在血清中的个体差异性分析及性别相关性分析如图5 所示 ，miR-21、miR-25、miR_29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 共 7条miRNA表达水平的Ct值分布较集中(图5-A)。各miRNA表达水平经Pearson相关性 分析得到R值接近1，ρ < 0. 05 (图5-B)。该结果说明Pearson相关性分析结果可靠，且 miRNA的表达在个体间相关性好，个体差异性很小。血清中miRNA的性别相关性分析，R2 = 0. 0953 (图5-C)表明，肝癌特异的miRNA的表达与性别无关。4.临床肝癌血清样本的检测分析如图6所示，经临床肝癌血清样本和正常血清样本各10例的RT-qPCR分析作图 可得，miR-21 (图 6-A)、miR-25 (图 6_B)、miR_29c (图 6_C)、miR-93 (图 6_D)、miR-198 (图 6-E) ,miR-221 (图6-F)和miR-222 (图6-G) 7条miRNA肝癌血清样本中检测所得的Ct值显 著低于正常血清样本的Ct值，从而推得该7条miRNA在肝癌血清样本中的表达显著高于正 常血清样本。也即该7条miRNA可特异性检测肝癌，是肝癌肿瘤标志物。本发明人经过广泛而深入的研究，首次系统分析血清中miRNA的稳定性；首次鉴 别和分离了与肝癌相关的血清miRNA，在此基础上完成了本发明；首次通过miRNA实时定量 PCR 技术在血清中对 miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 的表 达水平进行检测，进一步分析这些miRNA在血清中检测的个体差异性与相别相关性，并以 临床肝癌血清样本为材料，提供了针对肝癌血清miRNA检测的试剂盒。所提供的试剂盒专 门针对于血清miRNA的检测分析，结果准确可靠。本发明的有益效果(1)本发明系统化分析了血清中miRNA的稳定性，为其成为新 的血清来源肿瘤标志物提供基础；(2)由于血清具有取材方便，无创伤性，并可连续体外检 测的优点，因此从血清中寻找生物标志物可以将肝癌的早期筛查和诊断提高至一个新的水 平，进而提高治愈率和降低死亡率；(3)通过实时荧光定量PCR技术对肝癌临床样本的血清 水平miRNA的检测，定量准确，相对于芯片技术或者分子杂交技术(NorthernBlot)，该方法 简便快速且经济实用；(4)该肿瘤标志物可与其他分子指标相结合，为肝癌筛查，诊断，治 疗与预后提供新的综合性试剂盒，方便临床应用。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图 1 :RT-PCR 定性检测 18S rRNA、miR-21、miR-25、miR_29c、miR-93、miR-198、 miR-221和miR-222在肝癌细胞系Huh-7总RNA(图1_A)、组织总RNA(图1_B)、血清总 RNA(图1-C)及血清(图1-D)中的特异性表达。图2 肝癌Huh-7细胞系中miRNA的稳定性分析；A表示肝癌Huh-7细胞系提取得到的总RNA分别在_80°C、_20°C、4°C、室温和37°C下处理3h后各基因的扩增情况，即相对表达量；B表示肝癌Huh-7细胞系提取得到的总RNA在室温下分别放置0、1、3、6、12、24h后
各基因的扩增情况，即相对表达量；C表示肝癌Huh-7细 胞系提取得到的总RNA在37°C时，经RNase A分别消化0、3、 6、12h后各基因的扩增情况，即相对表达量；D表示肝癌Huh-7细胞系提取得到的总RNA在37°C时，经DNase I分别消化0、3、 6、12h后各基因的扩增情况，即相对表达量；E表示肝癌Huh-7细胞系提取得到的总RNA分别经反复冻融处理0、2、5、7、10次后 各基因的扩增情况，即相对表达量；F表示肝癌Huh-7细胞系提取得到的总RNA在37°C时，分别经不同pH值溶液的处 理对照、PH = 1、6、9、13后各基因的扩增情况，即相对表达量。 图3 肝癌组织中miRNA的稳定性分析；A表示肝癌组织提取得到的总RNA分别在_80°C、-20°C、4°C、室温和37°C下处理 3h后各基因的扩增情况，即相对表达量；B表示肝癌组织提取得到的总RNA在室温下分别放置0、l、3、6、12、24h后各基因的 扩增情况，即相对表达量；C表示肝癌组织提取得到的总RNA在37°C时，经RNase A分别消化0、3、6、12h后 各基因的扩增情况，即相对表达量；D表示肝癌组织提取得到的总RNA在37°C时，经DNase I分别消化0、3、6、12h后 各基因的扩增情况，即相对表达量；E表示肝癌组织提取得到的总RNA分别经反复冻融处理0、2、5、7、10次后各基因的 扩增情况，即相对表达量；F表示肝癌组织提取得到的总RNA在37°C时，分别经不同pH值溶液的处理对照、 pH = 1、6、9、13后各基因的扩增情况，即相对表达量。图4 血清中miRNA的稳定性分析；A表示血清样本分别在-80°C、-20°C、4°C、室温和37°C下处理3h后各基因的扩增 情况，即相对表达量；B表示血清样本在室温下分别放置0、l、3、6、12、24h后各基因的扩增情况，即相对
表达量；C表示血清样本在37°C时，经RNaseA分别消化0、3、6、12h后各基因的扩增情况， 即相对表达量；D表示血清样本在37°C时，经DNase I分别消化0、3、6、12h后各基因的扩增情况， 即相对表达量；E表示血清样本分别经反复冻融处理0、2、5、7、10次后各基因的扩增情况，即相对
表达量；F表示血清样本在37°C时，分别经不同pH值溶液的处理对照、pH = 1、6、9、13后
各基因的扩增情况，即相对表达量。图5 血清中miRNA的个体差异性分析和性别相关性分析；A表示血清中miRNA的Ct值分布；
B表示血清中miRNA的Pearson相关性分析；C表示血清中miRNA的性别相关性分析。图6 :7条miRNA在肝癌血清/正常血清样本中的Ct值比较分析；A表示miR-21在肝癌血清/正常血清样本中扩增后的Ct值；B表示miR-25在肝癌血清/正常血清样本中扩增后的Ct值；C表示miR-29c在肝癌血清/正常血清样本中扩增后的Ct值；
D表示miR-93在肝癌血清/正常血清样本中扩增后的Ct值；E表示miR-198在肝癌血清/正常血清样本中扩增后的Ct值；F表示miR-221在肝癌血清/正常血清样本中扩增后的Ct值；G表示miR-222在肝癌血清/正常血清样本中扩增后的Ct值。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面通过实施例对本发明进行更 加详细的说明。实施例1生物标志物及检测引物和探针本发明提供了一组miRNA 生物标志物，包含 miR-21、miR-25、miR_29c、miR-93、 miR-198、miR-221和miR-222。该组生物标志物的具体序列如下miR-21 :uagcuuaucagacugauguuga(SEQ ID NO 1)miR-25 :cauugcacuugucucggucuga(SEQ ID NO :2)miR_29c :uagcaccauuugaaaucgguua(SEQ ID NO :3)miR-93 :caaagugcuguucgugcagguag(SEQ ID NO :4)miR-198 :gguccagaggggagauagguuc(SEQ ID NO :5)miR-221 :agcuacauugucugcuggguuuc(SEQ ID NO :6)miR-222 :agcuacaucuggcuacugggu(SEQ ID NO :7)茎环引物法用茎环引物法检测miRNA的表达，需要针对miRNA的具体序列涉及特 异性茎环引物、及PCR引物。在PCR扩增过程中，用SYBR-green显色实时定量地检测目标 miRNA的扩增情况。茎环引物和相应的PCR扩增引物的具体信息如下miR-21 莲环引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAACA TC-3，(SEQ ID NO 8)miR-25 莲环引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAGAC CG-3，(SEQ ID NO 9)miR-29c 莲环引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTAACC GAT-3，(SEQ ID NO 10)miR-93 莲环引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACCTACCT GC-3，(SEQ ID NO 11)miR-198 莲环引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAACC TAT-3，(SEQ ID NO 12)miR-221 莲环引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAAAC CCA-3，(SEQ ID NO 13)
miR-222 莲环引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACACCCAG-3，(SEQ ID NO: 14)miR-21 PCR 正向引物5，-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGATG-3，(SEQ ID NO 15)miR-21 PCR 反向引物5，-CCAGTCGAGGGTCCGAGGTATT-3，(SEQ ID NO 16)miR-25 PCR 正向引物5，-GGCGGCATTGCACTTGTCTCG-3，(SEQ ID NO 17)miR-25 PCR 反向引物5，-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3，(SEQ ID NO 18)miR-29c PCR 正向引物5，-CCCCGCCTAGCACCATTTGAAAT-3，(SEQ ID NO 19)miR-29c PCR 反向引物5，-CAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3，(SEQ ID NO 20)miR-93 PCR 正向引物5，-CGCCCAAAGTGCTGTTCGTG-3，(SEQ ID NO 21)miR-93 PCR 反向引物5，-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3，(SEQ ID NO 22)miR-198 PCR 正向引物5，-GGGGGTCCAGAGGGGAGATAGGT-3，(SEQ ID NO 23)miR-198 PCR 反向引物5，-AGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3，(SEQ ID NO 24)miR-221 PCR 正向引物5，-GCGAGCTACATTGTCTGCTGGGTT-3，(SEQ ID NO 25)miR-221 PCR 反向引物5，-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3，(SEQ ID NO 26)miR-222 PCR 正向引物5，-GACGCAGCTACATCTGGCTACTGG-3，(SEQ ID NO 27)miR-222 PCR 反向引物5，-AGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3，(SEQ ID NO 28)18S rRNA PCR 正向引物5，-AAGACGGACCAGAGCGAA-3，(SEQ ID NO 29)18S rRNA PCR 反向引物5，-GGCGGGTCATGGGAAT-3，(SEQ ID NO 30)实施例2实验材料及实验试剂本发明中使用肝癌细胞系Huh-7、肝癌组织及22例临床正常血清样本(其中包括 男性、女性各11例)、10例临床肝癌血清样本。上述均为离体组织。实验试剂均为常用的分子生物学试剂，主要有=Trizol试剂，氯仿，异丙醇，乙醇， DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂等常规生化试剂均购于上海生工公司。M-MLV反转录酶与 RNase抑制剂、反转录用dNTP混合物(各10mM，RNase-free)均购自TaKaRa公司。荧光定 量PCR试剂盒为TOYOBO产品。实施例3茎环引物法检测肝癌细胞系、组织及血清中miRNA的表达l、cDNA 合成在4个无RNaseWO. 2mL PCR管中分别加入IOOng肝癌Huh_7细胞系总RNA、IOOng 肝癌组织总RNA、40ng血清提取得到的RNA、13 μ L血清，上述若总体积不足13 μ L则加DEPC 水补至总体积13 μ L，然后70°C变性8min后迅速置于冰上3min，再依次加入0. 5 μ LRNase 抑制剂(40U/ μ L)，1 μ L dNTP 混合物(各 10mM，RNase-free)，4 μ L 5 X M-MLV 缓冲液， 1 μ L实施例1所告知的茎环引物(2 μ Μ)和0. 5 μ L M-MLV反转录酶(200U/ μ L)，使总体积 至20 μ L，混勻后稍离心，在PCR仪中进行cDNA第一链合成，反应参数设置为16°C 15min, 42°C 60min 和 85°C 5min。得模板 cDNA。即，本发明的7个茎环引物和18S rRNA分别各对应肝癌Huh-7细胞系总RNA、或肝 癌组织总RNA、或血清提取得到的RNA、或血清，因此对应的有32个模板cDNA。2、将cDNA产物进行PCR扩增反应在0. 2mL PCR管中依次加入2 μ L IOXPCR反应缓冲液，1. 6 μ L dNTP混合物(各 IOmM)，0. 1 μ LTaq DNA聚合酶(5U/μ L)，对应的PCR正向和反向引物(10 μ Μ)各0.4 μ L，0. 8 μ L模板cDNA (步骤1所得)和去离子水14. 7 μ L，总体积为20 μ L。混勻后稍离心在 PCR仪中进行扩增反应。反应参数为94°C 3min，循环条件为94°C 15s，60°C 30s, 72°C lmin， 共35个循环。反应结束后取4yL反应液，进行12% DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结果 如图1所示。图1中的M代表20bp DNA Ladder。根据该图，可得知经过RT-PCR定性检测 及PCR产物序列测定和分析表明，在肝癌细胞系Huh-7总RNA (图1-A)，肝癌组织总RNA (图 1-B)，血清总RNA (图1-C)和血清(图1-D)中均检测到目标miRNA的特异性表达，说明18S rRNA、miR-21、miR-25、miR_29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 等 8 中 RNA 在肝癌 细胞系、肝癌组织及血清中均存在，为后续实验提供基础。 3、将cDNA进行荧光定量PCR在新的0. 2mL PCR 反应管中依次加入 10 μ L real-time PCR Master Μ χ,Ο. 4μ L 50 X ROXreference，相应的PCR正向和反向引物(10 μ Μ)各0. 4 μ L，2 μ L模板cDNA (步骤 1所得)和6. 8μ L去离子水。混勻后进行PCR反应，反应条件为95°C lmin，循环条件为 950C 15s和60°C lmin，共40个循环。通过该反应可得该8条基因在不同样本中的表达量， 进而进行后续分析。4、数据处理荧光定量PCR定量检测miRNA的相对表达变化量时，表达量倍数的变化用公 式RQ = ”Cr ,其中ACt = CTtreatfflent-CTcontrolo统计学分析采用SPSS16. O统计分析软件， Excel2003等数据分析工具，当相对标准误(STDEV) < 0. 5，ρ值彡0. 05时，认为结果在统 计学上有显著性差异。如图2-5所示，分析内容包括该8条基因在系统稳定性处理前后表 达量的比较；miRNA在血清中表达的个体差异性分析和性别相关性分析。该结果说明miRNA 在肝癌细胞系、组织及血清中稳定存在，可作为肝癌的生物标志物。根据图2，可得知肝癌Huh-7细胞系提取得到的总RNA经系统处理后，各miRNA的 表达量较对照相比差别不大，但18S rRNA的表达量较对照相比显著降低。根据图3，可得知肝癌组织提取得到的总RNA经系统处理后，各miRNA的表达量 较对照相比差别不大，但18S rRNA的表达量较对照相比显著降低。根据图4，可得知血清样本经系统处理后，各miRNA的表达量较对照相比差别不 大，但18S rRNA的表达量较对照相比显著降低。根据图5，可得知血清中miRNA扩增所得的Ct值分布较集中，该7条本发明的 miRNA在血清中表达的个体差异性小且与性别不相关。因此，我们得出以下结论miRNA在肝癌细胞系、组织及血清中稳定存在，在血清 中表达的个体差异性小且与性别不相关，可作为肝癌的生物标志物。实施例4利用本发明提供的试剂盒检测样本中miRNA的表达一种用于筛查和诊断肝癌病人疗效与预后的试剂盒，扩增系统和引物系统组成。 其中，反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成；扩增系统由含Taq 酶的miRNA表达定量检测混合液组成；引物系统由miR-21、miR-25、miR_29c、miR-93、 miR-198、miR-221和miR-222的茎环结构引物和扩增引物组成；具体为反转录系统由M-MLV反转录酶、反转录体系5XM-MLV缓冲液和RNase抑制剂组 成；
扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成，包括real-time PCR MasterMix 禾口 50XROX reference ；引物系统由 miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 的莲 环结构引物和扩增引物组成，同实施例1中的引物序列。该实施例中，分别以10个健康人和10个肝癌患者的血清为样本，分别用7种不同 的microRNA生物标志物进行试验，从而获得图6所述的结果。具体如下l、cDNA 合成
在无RNase的0. 2mL PCR管中加入13 μ L正常血清/肝癌血清，70°C变性8min后 迅速置于冰上3min，再依次加入0. 5 μ L RNase抑制剂(40U/ μ L)，1 μ L dNTP混合物(各 10mM,RNase-free) ,4μ L 5XM-MLV 缓冲液，1 μ L 特异的茎环引物(2 μ Μ)和 0. 5 μ L M-MLV 反转录酶(200U/ μ L)，使总体积至20 μ L，混勻后稍离心，在PCR仪中进行cDNA第一链合 成，反应参数设置为16°C 15min，42°C 60min和85°C 5min。得模板cDNA。2、将cDNA进行荧光定量PCR在新的0. 2mL PCR 反应管中依次加入 10 μ L real-time PCR Master Μ χ,Ο. 4μ L 50 X ROXreference, PCR 正向和反向引物(10 μ Μ)各 0· 4 μ L，2 μ L 模板 cDNA 和 6· 8 μ L 去 离子水。混勻后进行PCR反应，反应条件为95°C lmin，循环条件为95°C 15s和60°C lmin, 共40个循环。通过该反应可得该7条miRNA在不同正常血清/肝癌血清样本中的表达量， 进而进行后续分析。3、数据处理荧光定量PCR定量检测所得miRNA的Ct值，采用Excel 2003数据分析工具，当相 对标准误(STDEV) < 0. 5，时，认为结果可靠。如图6所示，可得7条miRNA在肝癌血清/正 常血清样本中的Ct值比较分析。结果说明该7条miRNA在肝癌血清中特异性表达，可作为 肝癌的生物标志物。根据图6，经临床肝癌血清样本和正常血清样本各10例的RT-qPCR分析得该7条 miRNA在肝癌血清样本中检测所得的Ct值显著低于正常血清样本的Ct值。从而推得该7条 miRNA在肝癌血清样本中的表达显著高于正常血清样本。也即该7条miRNA可特异性检测 肝癌，是肝癌肿瘤标志物。因此，我们得知，当检测样本所得的Ct值显著低于已知正常血清 样本的Ct值时，为肝癌患者；当检测样本所得的Ct值与已知正常血清样本的Ct值差别不大 时，为正常人。上述实施例是对本发明的解释说明，而非对本发明进行限制，在本发明的精神和 权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。如， 所述miRNA还可应用于肝癌患者的组织，唾液，尿液，血浆，泪液、羊水等体液的检测。显然， 本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一 种 microRNA 生物标志物，其特征是为 miR-21、miR-25、miR_29c、miR-93、 miR-198、miR-221 和 miR-222 中的任意 1 个miR-21 :uagcuuaucagacugauguuga miR-25 :cauugcacuugucucggucuga miR-29c :uagcaccauuugaaaucgguua miR-93 :caaagugcuguucgugcagguag miR-198 :gguccagaggggagauagguuc miR-221 :agcuacauugucugcuggguuuc miR-222 :agcuacaucuggcuacugggu0
2.如权利要求1所述的miRNA生物标志物的用途，其特征是用于制备具有肝癌检测 能力的试剂盒。
3.一种具有肝癌检测能力的试剂盒，其特征是该试剂盒由反转录系统、扩增系统和 引物系统组成；所述反转录系统由M-MLV反转录酶、反转录体系5XM-MLV缓冲液和RNase抑制剂组成；所述扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成，其包括real-time PCRMaster Mix 禾口 50XROX reference ；所述引物系统包括 miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 中 的任意1个的茎环引物和扩增引物miR-21 莲环引物5， -GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAACATC-3'miR-25 莲环引物5， -GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAGACCG-3'miR-29c 莲环引物5， -GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTAACCGAT-3'miR-93 莲环引物5’ -GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACCTACCTGC-3'miR-198 莲环引物5’ -GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAACCTAT-3'miR-221 莲环引物5’ -GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAAACCCA-3，miR-222 莲环引物5’ -GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACACCCAG-3， miR-21 PCR 正向引物5，-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGATG-3， miR-21 PCR 反向引物5，-CCAGTCGAGGGTCCGAGGTATT-3， miR-25 PCR 正向引物5，-GGCGGCATTGCACTTGTCTCG-3， miR-25 PCR 反向引物5，-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3， miR-29c PCR 正向引物5，-CCCCGCCTAGCACCATTTGAAAT-3， miR-29c PCR 反向引物5，-CAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3， miR-93 PCR 正向引物5，-CGCCCAAAGTGCTGTTCGTG-3，miR-93 PCR 反向引物5，-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3， miR-198 PCR 正向引物5，-GGGGGTCCAGAGGGGAGATAGGT-3， miR-198 PCR 反向引物5，-AGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3， miR-221 PCR 正向引物5，-GCGAGCTACATTGTCTGCTGGGTT-3， miR-221 PCR 反向引物5，-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3， miR-222 PCR 正向引物5，-GACGCAGCTACATCTGGCTACTGG-3， miR-222 PCR 反向引物5，-AGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3， 18S rRNA PCR 正向引物5，-AAGACGGACCAGAGCGAA-3， 18S rRNA PCR 反向引物5，-GGCGGGTCATGGGAAT-3，。
4. 一种对miRNA稳定性分析的方法，其特征在于，对血清/血浆样本进行一系列条件的 处理，包括以下步骤1)血清/血浆样本不同温度下处理3h:-80°C、-20°C、4°C、室温和37°C ；2)室温下血清/血浆样本不同存放时间的处理0、l、3、6、12、24h；3)370C RNaseA不同时间条件消化血清/血浆样本的处理0、3、6、12h ；4)370C DNase I不同时间条件消化血清/血浆样本的处理0、3、6、12h ；5)血清/血浆样本经不同反复冻融次数的处理0、2、5、7、10次；6)37°C血清/血浆样本经不同pH值溶液的处理对照、pH=1、6、9、13 ；7)血清/血浆样本经RT-qPCR方法进行血清/血浆RNA稳定性分析。
全文摘要
本发明公开了一种microRNA生物标志物，为miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221和miR-222中的任意1个，其序列对应为SEQ ID NO1～SEQ ID NO7。本发明还同时公开了上述miRNA生物标志物的用途用于制备具有肝癌检测能力的试剂盒。本发明还同时公开了一种具有肝癌检测能力的试剂盒，该试剂盒由反转录系统、扩增系统和引物系统组成；引物系统包括miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221和miR-222中的任意1个的茎环引物和扩增引物。本发明能用于肝癌筛查和诊断。
文档编号C12N15/11GK102002494SQ20101022024
公开日2011年4月6日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者丁先锋, 吕佳岚, 姚虎, 徐立坚, 朱恒怡, 李艳, 郭江峰 申请人:浙江理工大学