专利名称：猴副流感病毒5型的rt-pcr检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中病毒的检测方法，特别是涉及猴副流感病毒5型 (SV5)的RT-PCR检测方法及试剂盒。
背景技术：
猴副流感病毒5 型(Simian parainfluenza virus 5,SV5)是 1956 年首次由 Hull 等人从猴肾细胞培养物中分离得到，随后在人、犬等动物体内也相继分离到该病毒，在分类 上SV5属于副粘病毒科，副粘病毒属，同属的其它成员包括人副流感病毒1-4型、腮腺炎病 毒、新城疫病毒、仙台病毒等。SV5在猴群中常以隐性感染的方式存在，多无临床症状，另外在豚鼠、地鼠、犬、母 牛、山羊和绵羊血清中也含有高低度的SV5病毒抗体，在豚鼠中抗体阳性率达到20%，在地 鼠群中抗体阳性率达到43%，表明存在SV5病毒或相关病毒的感染。SV5广泛存在于亚洲 和非洲的猴群中，尤以恒河猴最为常见。在马来西亚和柬埔寨等国家的猴群中，SV5的分离 率高达30-33%，抗体阳性率高达70-80%。目前我国尚未见猴感染SV5的报道，SV5也可 以感染人，但未见有临床症状报道。对于SV5在其它动物群中的发生情况尚不清楚。SV5核酸型为单股RNA，病毒粒子呈圆形，直径150-250nm，内含呈螺旋型对称的核 蛋白，直径15-18nm，外围以脂蛋白囊膜，囊膜上含有纤突，为病毒的血凝素和神经氨酸酶部 分。SV5可在猴、人、狒狒、牛、犬、仓鼠和豚鼠等多种动物的原代肾细胞以及BHK-21，Ver0等 细胞上增殖，其中以原代猴肾细胞最为易感，并可产生嗜酸性胞浆内包涵体。SV5引起的细 胞病变多为形成多个核聚集在一起的多核核包体细胞，并呈环形空泡，有些细胞呈梭形。SV5与人副流感病毒1-4型均有抗原交叉反应，与SV-41、腮腺炎病毒(mumps)、麻 疹病毒(measles)也有交叉反应。病毒可存在于猴的组织器官中(尤其是肾脏)，因此常常 造成猴源细胞培养物的污染。用SV5经鼻腔人工感染恒河猴，3d后即可从咽拭子中发现病 毒，7d后从肺及气管中也可分离到病毒，但感染后无任何症状表现。实验条件下感染豚鼠不 能引起明显的疾病，但可刺激机体产生抗体。经鼻内感染仓鼠非常易感，可以产生脑炎等症 状。SV5是单链、负义的不分节段的RNA病毒，它区别于其它副粘病毒家族病毒的一 个重要特征就是其有一套最小的病毒基因组，全长15246nt，由3'端引导序列(55nt) 和5'末端序列(31nt)以及七段连续性的基因组成。它们分别是L基因(6804nt，编 码聚合酶蛋白large polymerase protein)，HN基因(1789nt，编码血凝-神经氨酸酶 hemagglutinin-neuraminidase), SH 基因(292nt,编码小疏水性蛋白 smalIhydrophobic protein), F基因(1873nt，编码融合蛋白fusion protein), M基因(1371nt，编码膜基 M胃白，matrix protein), P (1298nt，H石马胃白，phosphoprotein), NP (1725nt，编码病毒核衣壳蛋白neucleocapsid protein)。其中P基因3'端有一小段基 因又可编码V蛋白，这一小段基因又称为V基因(669nt)。V蛋白(222个残基)和P蛋白 (392个残基)N末端164个氨基酸残基相同，但C末端不同。SV5在基因组结构上和仙台病毒(SeV)、口炎病毒(VSV)等病毒一个重要的区别就是SV5基因组各个基因间结合部是具 有高度可变性的，而SeV、VSV等病毒则相当保守。最近研究表明，SV5各个基因间结合部在 调控聚合酶功能和衰减方面是有差别的。NP蛋白是核衣壳蛋白的主要组成部分，分两个主要区域一是氨基酸区域，它与 病毒RNA直接结合；另一个是羧基端区域，裸露于装配后的核衣壳表面，存在有对蛋白酶敏 感的结合位点。P蛋白、V蛋白、L蛋白属于辅助核衣壳蛋白，是与RNA复制和转录的酶促反 应过程相关的主要辅助性蛋白，这些辅助蛋白相互协同才能发挥作用，P蛋白和V蛋白能互 相作用形成为病毒复制和转录的多聚酶复合物。V蛋白能在包衣壳作用前使NP蛋白保持 可溶性，以防止NP蛋白水解，V蛋白还能在病毒RNA合成前阻止NP蛋白与P蛋白形成异聚 体。聚合酶L蛋白对病毒复制的作用之一就是能在一段基因转录即将结束而下一段基因转 录尚未开始时终止该基因段的转录，并在该基因相应的mRNA3'端加上polyA尾并对其5' 末端进行修饰。而L蛋白的合成又受到转录酶通过M-F基因间隔效率的精密调控，因为一 旦转录酶通过M-F基因间隔效率提高则会将导致下游L基因的过量表达，这将会引发病毒 生长缺陷，这一点对于病毒粒子的优化生长是非常重要的。HN蛋白、F蛋白、M蛋白和SH蛋白都属于病毒的囊膜糖蛋白，HN蛋白介导病毒与 细胞的附着，具有凝血素和神经氨酸酶活性；F蛋白为融合蛋白，它能促进病毒囊膜与宿主 细胞表面脂蛋白膜融合；M蛋白存在于病毒囊膜的内层，是一种相对较小的非糖基化蛋白， 它于病毒粒子装配过程中参与囊膜形成，介导核衣壳与囊膜之间的识别，以维持病毒粒子 结构的完整性；SH蛋白(5.012KD，44个氨基酸)为一小疏水性蛋白，具体功能尚不清楚，可 能对双层脂膜有亲和性。由于SV5病毒在猴群中多呈隐性感染，感染猴但不发病，会对猴源细胞生产的生 物制品造成污染，虽然目前国内尚未见有猴感染SV5的报道，但在实验动物和生物制品的 质量控制中建立一套完整的SV5病原以及抗体检测手段是非常必要的。目前对于SV5病毒 感染的特异性诊断方法主要还是病毒的分离和鉴定，具体可分为以下两大类检测方法(一 )抗原检测组织培养观察细胞病变，血凝试验、血吸附试验，电镜检查细胞 培养物中的病毒颗粒。(二)抗体检测分离的病毒可用标准抗血清做血凝抑制、血细胞吸附抑制、血清 中和试验、免疫荧光试验和ELISA等方法加以鉴定。常规检测SV5抗体，一般以ELISA方法 较为特异灵敏，在出现阳性结果时可选用另一种方法进行验证，或者用ELISA-阻断实验进 行验证。但这些方法仍然存在特异性及灵敏度等方面的局限性。
发明内容
针对以上问题，发明人通过对SV5病毒的核酸检测进行研究，提出一种RT-PCR方 法，并期望以其操作简便，特异性及灵敏度较高，易于推广等优点，为将其运用于病毒的早 期诊断中提供解决方案。因此，本发明一个目的是提供用于对SV5病毒进行RT-PCR检测的引物。本发明所提供的引物，是以SV5的M基因段核酸为检测对象设计的，用以定量检测 样品中SV5病毒的核酸拷贝数。
具体来讲，所述引物的上游引物具有序列表中SEQ ID NO :1的核苷酸序列，下游引 物具有序列表中SEQ ID NO 2的核苷酸序列。本发明的第二个目的是提供一种特异性和灵敏度较高的SV5病毒的RT-PCR检测方法。本发明所提供检测方法，是以本发明的引物进行的RT-PCR检测方法。具体来讲，所述RT-PCR检测方法可包括以下步骤1)样本RNA的提取2) RNA的逆转录3)PCR检测以步骤2)获得的病毒RNA的逆转录产物为模板，在上述引物对的引 导下进行PCR扩增，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，若能扩增出317bp的目的片段， 则检测结果呈SV5阳性，反之呈SV5阴性，以对SV5进行定性检测。在上述RT-PCR检测方法中，所述步骤1)中的样本可以是动物源性的生物制品、血 液、离体组织或细胞培养物等。步骤2)中是在合适的反应体系中，通过逆转录酶的催化，以RNA为模板 合成DNA链(cDNA)的过程；所述25ul逆转录反应体系为去Rnase的dH20 7 μ 1, 5 Xbuffer(Promega AMV Reverse Transcriptasse, catalog#M5108)5 μ 1, dNTP(浓度 2. 5πιΜ)4μ 1，随机引物(浓度 500μ g/mL)0. 5μ 1，RNA (浓度 0. 25 μ g/μ 1) 8 μ 1，AMV (浓度 lOu/μ 1)0. 5μ 1 ；所述逆转录反应条件为:37°C 90min，72°C 15min，4°C 5min。步骤3)是以病毒RNA的逆转录产物为模板，在合适的反应体系中，用本发明的特 异引物与病毒基因组cDNA相应位置互补结合，经过DNA的变性(基因组双链解成单链)、退 火(引物与模板结合)、延伸(从引物3'端合成新链)3个阶段的循环重复，目的片段被放 大，再通过琼脂糖凝胶电泳进行SV5病毒的定性检测。所述20ul PCR 反应体系可包括10 X buffer (TaKaRa Taq Hot Start VersionDR007A)2y 1，dNTP(浓度 2·5πιΜ)1·6μ 1，dH20 12. 9 μ 1，上游引物(浓度 10μΜ)1μ 1，下游引物(浓度 10μΜ)1μ l，cDNA(浓度 50ng/y 1)1μ l，Hs Taq 酶(浓度 5u/ μ 1)0. 5 μ 1。所述PCR 反应条件可为先 94°C 5min ；然后 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin,共 35 个循环；最后72 °C 5min。本发明的第三个目的是提供一种用于对SV5病毒进行RT-PCR检测的试剂盒。本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对SV5病毒进行RT-PCR检测的引物。本发明提供了一种SV5病毒的RT-PCR检测方法。该方法是以SV5基因组中M基 因核酸为检测对象的灵敏度和特异性都较好的检测方法。本发明具有以下优点1.首次建立了 SV5的RT-PCR检测方法，用该检测方法可以对细胞培养物、血液、动 物组织和动物源性生物制品进行高灵敏的检测。2.本检测方法与SV5的其它常规检测方法如病毒的分离培养鉴定、琼脂糖扩散实 验和ELISA相比，具有相当高的灵敏度。3.本检测方法与SV5的其它常规检测方法，如病毒的分离培养鉴定、琼脂糖扩散 实验和竞争ELISA相比，具有相当高的特异性。4.本检测方法与其它常规检测方法，如病毒的分离培养鉴定、琼脂糖扩散实验和竞争ELISA相比，具有操作程序简单易用的特点，能够实现程序化，适合大面积推广和应用。5.本检测方法检测的对象是SV5病毒的核酸，与其它检测病毒抗体的方法相比， 在检测不存在病毒抗体的样本(如动物源性生物制品)方面有较大优势。综上所述，本发明在动物源性生物制品或相关原材料及动物中SV5的检测领域中 具有较大的实际意义，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为用本发明的引物对SV5细胞培养物进行的RT-PCR检测结果图2为本发明RT-PCR检测方法的敏感性分析结果图3为本发明RT-PCR检测方法的敏感性分析结果
具体实施例方式下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所 述的条件，或按照制造厂商建议的条件。所用引物均由上海英骏公司合成，所有序列测定工 作均由上海生工完成。实施例1、用于对SV5病毒进行RT-PCR检测的引物的设计及RT-PCR检测一、用于对SV5病毒进行RT-PCR检测的引物的设计根据SV5的M基因(序列表中SEQ ID No 3)为模板设计引物，该引物的PCR产物 大小为317bp，引物序列如下上游引物MF:5' -TGAGTGGCAGGAATACTGGATG-3 ‘(序列表中 SEQ ID No 1)下游引物MR:5' -AGCGGCGATGCTTAGATGAAAT-3 ‘(序列表中 SEQ ID No :2)二、SV5 病毒的 RT-PCR 检测用本发明的方法对SV5病毒毒种(编号1 16)进行RT-PCR检测，具体方法包 括以下步骤1、SV5感染的细胞培养物中RNA的提取1. 1取SV5冻存培养液0. 5mL,加入0. 5mL冰冷的Trizol Reagent (购自 Invitrogen)，震荡混勻10s，室温放置lOmin。1. 2加入0. 2mL氯仿，剧烈震荡2 3min,室温静置IOmin,4°C>12000rpm离心 15min。1. 3吸取上清于新离心管中，加等体积冰冷的异丙醇，混勻，室温静置10min，4°C、 12000rpm 离心 15min。1. 4弃上清，用75%乙醇(预冷于-20°C ) ImL洗涤RNA沉淀一次后，4°C、8000rpm 离心7min。1. 5弃上清，倒置，室温干燥lOmin。1. 6 加入 20 μ 1 去 Rnase 水溶解 RNA，55 60°C水浴助溶 IOmin0用紫外分光光度仪测定所提取的RNA浓度，经测定，所提取的RNA浓度为
60. 2095mg/mLo2、SV5病毒RNA的逆转录以步骤1获得的SV5病毒RNA为模板逆转录合成其cDNA，PCR反应体系如下(在 0. 2mL无Rnase的PCR薄壁管中依次加入下列试剂)去 Rnase 的 dH207 μ 15Xbuffer(Promega AMV5μ 1Reverse Transcriptasse,catalog# Μ5108)dNTP (浓度 2. 5mM)4 μ 1random primer (浓度0. 5 μ 1500 μ g/mL)RNA (浓度 0· 25 μ g/ μ 1)8 μ 1AMV (浓度 IOu/ μ 1)0. 5 μ 1总计25 μ 1逆转录反应条件为37°C90min，72°C 15min，4°C 5min。3、SV5毒种的PCR扩增以步骤2合成的cDNA为模板，在引物MF和MR的引导下进行PCR扩增，PCR反应 体系如下(在0.2mL PCR薄壁管中依次加入下列试剂)IOXbuffer(TaKaRa Taq Hot 2μ 1Start Version DR007A)dNTP (浓度 2. 5mM)1· 6 μ 1dH2012. 9μ 1上游引物(浓度10 μ Μ)1 μ 1下游引物(浓度10 μ Μ)1 μ 1cDNA (浓度 50ng/ μ 1)1 μ 1Hs Taq 酶(浓度 5u/ μ 1)0. 5 μ 1总计20 μ 1PCR 反应条件为先 94°C 5min ；然后 94°C 30s,58°C 30s, 72°C lmin，共 35 个循环； 最后 72 °C 5min。4、结果观察反应结束后，取5μ 1 PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测(缓冲液为ΤΑΕ， 100伏30分钟)，在凝胶成像系统下观察并记录结果。结果如图1所示(Μ :250bp Marker ；1 16 :SV5病毒毒种的RT-PCR产物)，不同 批次的毒种，SV5含量不同，有的含量很少甚至没有，毒种1 5、7 9、11、14 15均检出 了 M基因(紫外灯下可见317bp的目的条带)，PCR产物送上海生工测序，结果与NCBI上的 序列(NC 002578序列表中的SEQ ID No 4)进行比对，符合率为99%。试验一、本发明SV5病毒的RT-PCR检测方法的敏感性分析将实施例1步骤二得到的SV5病毒RNA分别做ICT1 10_9系列稀释，用本发明的 方法分别进行RT-PCR扩增。
检测结果如图2所示(M :250bp Marker ；1 :SV5病毒原液；2 10 ICT1 1(Γ9 稀释)，可见该方法具有较高的灵敏度，能检测的最大稀释倍数为10_4，对应的RNA浓度为 0. 21ng/y 1。试验二、本发明SV5病毒的RT-PCR检测方法的特异性分析用与SV5亲缘关系较近的几种病毒做对照仙台病毒(SV)、淋巴细胞脉络丛脑膜 炎病毒(LCM)、犬瘟热病毒(CDV)、腮腺炎病毒(EPV)和麻疹病毒(MV)，用本发明的方法同时 进行RT-PCR检测，反应体系及反应条件与实施例1相同。检测结果如图3所示(M =IOObp Marker ；1 7 :SV5、仙台病毒(SeV)、淋巴细胞脉 络丛脑炎病毒(LCM)、犬感染病毒(CDV)、腮腺炎病毒(EPV)、麻疹病毒(MV) ,Vero细胞)，唯 有SV5病毒扩增出了 317bp的目的条带，而其它毒种都未见此特异性条带，说明本发明SV5 病毒的RT-PCR检测方法具有很好的特异性。 实施例2、SV5病毒的RT-PCR检测试剂盒 将用于对SV5病毒进行RT-PCR检测的弓丨物Ml (10 μ M) 100 μ 1以及 Μ2 (10 μΜ)100 μ 1、Invitrogen TRIzol cat logl5596_018 50mL、Promega AMV ReverseTranscriptasse, catalog#M5108、 TaKaRa Taq Hot Start Version DR007A、 SV5DNA10 μ 1、DEPC水lmL、dd水ImL共同包装，得到SV5病毒的RT-PCR检测试剂盒。
权利要求
用于对SV5病毒进行RT-PCR检测的引物，是以SV5的M基因段核酸为检测对象设计的，用以定量检测样品中SV5病毒的核酸拷贝数。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于所述引物的上游引物具有序列表中SEQ ID NO 1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO 2的核苷酸序列。
3.一种SV5病毒的RT-PCR检测方法，是以权利要求1或2所述引物进行的RT-PCR检 测方法。
4.根据权利要求1所述的RT-PCR检测方法，其特征在于所述检测方法包括以下步骤1)样本RNA的提取2)RNA的逆转录3)PCR检测以步骤2)获得的病毒RNA的逆转录产物为模板，在上述引物对的引导下 进行PCR扩增，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，若能扩增出317bp的目的片段，则检 测结果呈SV5阳性，反之呈SV5阴性。
5.根据权利要求4所述的RT-PCR检测方法，其特征在于所述步骤1)中的样本可以 是动物源性的生物制品、血液、离体组织或细胞培养物。
6.根据权利要求4所述的RT-PCR检测方法，其特征在于所述步骤2)中的25ul逆转 录反 本系为去 Rnase 白勺 dH20 7 μ 1, 5 X buffer (Promega AMV ReverseTranscriptasse, catalog#M5108)5y 1, dNTP (浓度 2. 5mM)4yl，随机引物(浓度 500g/mL) 0. 5 μ 1，RNA(浓 度 0. 25 μ g/μ 1)8 μ 1，AMV(浓度 lOu/μ 1)0. 5μ 1 ；逆转录反应条件为37 °C 90min, 72°C 15min,4°C 5min。
7.根据权利要求4所述的RT-PCR检测方法，其特征在于所述步骤3)中的20ulPCR 反应体系包括10 X buffer (TaKaRa Taq Hot Start Version DR007A) 2 μ 1, dNTP (浓度 2. 5mM)1.6y 1, dH20 12. 9 μ 1，上游引物(浓度 10 μ Μ) 1 μ 1，下游引物(浓度 10μΜ)1μ 1， cDNA (浓度 50ng/μ 1) 1 μ 1, Hs Taq 酶(浓度 5u/μ 1)0. 5 μ 1。
8.根据权利要求4所述的RT-PCR检测方法，其特征在于所述步骤3)中的PCR反应 条件为先 94°C 5min ；然后 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，共 35 个循环；最后 72°C 5min。
9.一种用于对SV5病毒进行RT-PCR检测的试剂盒，包括权利要求1或2所述用于对 SV5病毒进行RT-PCR检测的引物。
全文摘要
本发明公开了一种SV5病毒的RT-PCR检测方法及试剂盒。该引物是以SV5的M基因段核酸为检测对象设计的，用以定量检测样品中SV5病毒的核酸拷贝数。所述检测方法包括以下步骤1)样本RNA的提取2)RNA的逆转录3)PCR检测以步骤2)获得的病毒RNA的逆转录产物为模板，在上述引物对的引导下进行PCR扩增，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，若能扩增出317bp的目的片段，则检测结果呈SV5阳性，反之呈SV5阴性。本发明在动物源性生物制品或相关原材料及动物中SV5的检测领域中具有较大的实际意义，应用前景广阔。
文档编号C12Q1/70GK101880732SQ20101022141
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者冯育芳, 李晓波, 贺争鸣 申请人:中国药品生物制品检定所