专利名称：魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离方法
技术领域：
本发明涉及一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法，属于植物病害防治技 术领域。本发明所述的魔芋软腐病病原菌是由软腐欧式杆菌(Pectobacterium Species) 侵染引起。
背景技术：
魔芋是单子叶多年生草本植物，主要分布在东南亚和非洲。魔芋球茎中富含的葡 苷聚糖使其在食品、医药、化工和农业中具有广泛的应用。随着魔芋加工产业对原料需求 日益旺盛，种植面积不断扩大，而软腐病的发生也越来越严重，已成为魔芋产业发展主要障 碍。目前，农业生产中对软腐病的防治主要有农业防治与化学防治。农业防治效果并 不显著，同时可调控性较差。因此，化学防治是目前应用最为普遍和广泛的防治方法，但是 化学药剂的毒副作用，往往带来环境污染和生态破坏。寻找新的防治途径和方法来解决软 腐病的危害成为迫在眉睫的事。生物防治在病害防治方面开辟了新天地，同时符合环境保护、绿色食品生产和农 业可持续发展的方针。生物防治技术就是把自然状态下，病原微生物存在拮抗作用或竞争 关系的极少量微生物，通过人工筛选培养、繁殖后，再用到作物上，增大拮抗菌的种群量。或 是将拮抗菌中起作用的有效成分分离出来，以工业化大批量生产，作为农药使用，达到防治 病害的目的。前者称微生物农药，后者为农药抗菌素。近几年，不少研究者开始尝试开发生 物制剂来防治魔芋软腐病。如云南大学姬广海等人采用解淀粉芽孢杆菌C3及其发酵液制 成针对魔芋软腐病的生物制剂(ZL200510048755)；取得了高于46. 7%的防效及其一定的 增产作用，但该方法由于存在制备技术要求高以及生物安全性有待考证，植株一旦感病一 样很难控制等多方面原因，尚未得到广泛的应用。关于魔芋软腐病菌生物防治的报道极少，仅周盈等从魔芋愈伤组织继代培养中出 现的细菌中筛选到了一株能抑制魔芋软腐病病原菌生长的枯草芽孢杆菌。但植物各个生长 阶段的内生菌数量和种类各有不同，且筛选高效和活性稳定的拮抗菌株是保证生物防治获 得成功的先决条件。自然界中微生物种类及其丰富，如何快速有效的获得魔芋软腐病病原 菌拮抗菌的报道尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法。利用 一物降一物的自然规律，通过分离感染软腐病魔芋组织的细菌，缩小拮抗菌的筛选范围。本 发明具有操作简便、方法易行、能快速有效的筛选出抗魔芋软腐病病原菌拮抗菌，同时为其 他作物拮抗菌快速筛选提供了思路。为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法，其步骤是
A、标样选择选取具有典型软腐病症状的魔芋组织，在发病扩展前沿病健交界处， 切割0. 5-1. 5cm组织块；B、组织消毒将组织块用自来水冲洗，选用75% (体积比)酒精消毒60-90S，然后 用无菌水冲洗2-4次，在放有吸水纸的托盘上用手术刀在无菌操作台上切成0. 5X0. 5cm左 右的组织块，接到营养琼脂培养基上；C、细菌的获得将组织块周边长出的菌采用平板划线分离法进行分离，24-28°C培 养箱中培养48-72h后观察，根据菌落形态、颜色等细菌培养性状，挑选单菌落，然后将细菌 纯培养保存；D、软腐病病原菌的筛选将获得的纯培养细菌接种到欧文氏菌具有特色的结晶紫 聚果胶选择性培养基(CVP)上，24-28°C培养箱中培养48-72h后观察，菌体凹陷生长的为软 腐病病原菌；E、采用点接法进行拮抗菌的初筛将营养肉汤培养基过夜培养的浓度为 IX IO8CfuAil的魔芋软腐病病原菌菌悬液0. Iml涂布于营养琼脂培养基平板上，然后在每 个平板上用无菌牙签均勻接种四个从魔芋软腐病病建交接处分离到的非软腐病病原菌，每 个接菌平板平行做三份。本实验步骤重复三次。30°C恒温培养箱中培养24h后测定其抑菌 圈直径；F、采用牛津杯法进行拮抗菌的复筛将初筛的拮抗菌株在营养肉汤培养基中 200r/min, 30°C培养2d，发酵液6000g离心20min，上清液用0. 22 μ m微孔滤膜过滤，经营养 琼脂培养基培养无菌落生成，视为无菌滤液。取过夜培养的浓度为IX 108CfU/ml魔芋软腐 病病原菌菌悬液0. Iml均勻涂于营养琼脂培养基上，在每个平板上摆放四个牛津杯，然后 在每个牛津杯中加入0. 2ml的供试拮抗菌无菌滤液。每个平板牛津杯加入拮抗菌无菌滤液 的处理平行做三份，以上实验步骤重复三次。30°C恒温培养箱中培养24h后测定其抑菌圈 直径。本方法的有益效果利用一物降一物的自然规律，通过分离感染软腐病魔芋组织 的细菌，缩小拮抗菌的筛选范围，利用该方法在分离到的20余份非软腐病病原菌中有9个 是拮抗菌，通过拮抗菌的热稳定性、抑菌范围等指标，筛选出了 2株具有应用潜力的魔芋软 腐病病原菌拮抗菌(一株为芽孢杆菌，一株为荧光假单胞杆菌)。土壤微生物及其丰富，细 菌占土壤微生物总量的70% _90%，要从土壤中筛选到病原菌的拮抗菌，一般要挑选上百 种细菌，具有一定的盲目性。用该方法分离的魔芋软腐病病原菌拮抗菌，操作简单，简单易 行，成本低。该方法除用于分离魔芋软腐病病原菌的拮抗菌外，还可广泛用于分离其他作物 病害拮抗菌。
具体实施例方式实施例1 一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法，其步骤是A、标样选择选取具有典型软腐病症状的魔芋组织，在发病扩展前沿病健交界处， 切割0. 5-1. 5cm组织块；B、组织消毒将组织块用自来水冲洗，选用75% (体积比)酒精消毒60或70或 80或90s，然后用无菌水冲洗2或3或4次，在放有吸水纸的托盘上用手术刀在无菌操作台
4上切成0. 5X0. 5cm左右的组织块，接到营养琼脂培养基上；C、细菌的获得将组织块周边长出的菌采用平板划线分离法进行分离，24-28°C培 养箱中培养48或51或54或57或60或64或67或70或72h后观察，根据菌落形态、颜色 等细菌培养性状，挑选单菌落，然后将细菌纯培养保存；D、软腐病病原菌的筛选将获得的纯培养细菌接种到欧文氏菌具有特色的结晶紫 聚果胶选择性培养基(CVP)上，24或25或26或27或28°C培养箱中培养48或50或53或 56或59或61或63或66或69或72h后观察，菌体凹陷生长的为软腐病病原菌；E、采用点接法进行拮抗菌的初筛将营养肉汤培养基过夜培养的浓度为 IX IO8CfuAil的魔芋软腐病病原菌菌悬液0. Iml涂布于营养琼脂培养基平板上，然后在每 个平板上用无菌牙签均勻接种四个从魔芋软腐病病建交接处分离到的非软腐病病原菌。每 个接菌平板平行做三份。本实验步骤重复三次。30°C恒温培养箱中培养24h后测定其抑菌 圈直径；F、采用牛津杯法进行拮抗菌的复筛将初筛的拮抗菌株在营养肉汤培养基中 200r/min, 30°C培养2d，发酵液6000g离心20min，上清液用0. 22 μ m微孔滤膜过滤，经营养 琼脂培养基培养无菌落生成，视为无菌滤液。取过夜培养的浓度为IX 108CfU/ml魔芋软腐 病病原菌菌悬液0. Iml均勻涂于营养琼脂培养基上，在每个平板上摆放四个牛津杯，然后 在每个牛津杯中加入0. 2ml的供试拮抗菌无菌滤液，每个平板牛津杯加入拮抗菌无菌滤液 的处理平行做三份。本实验步骤重复三次。30°C恒温培养箱中培养24h后测定其抑菌圈直 径。所述的CVP培养基的配制将搅碎器预加热，在1 OOOml煮沸的蒸馏水，将以 下成分依次加入，用低速搅拌。10% (质量比)结晶紫的水溶液2.0ml、lmol/l氢氧 化钠(NaOH) 9. OmlU % (质量比)新鲜配制的氯化钙(CaCl2 · 2H20) 9ml、琼胶4g、硝酸(NaN03)2g>(Polygalacturonic acid sodiumsalt from citrus fruit) 18g加入，高速搅拌15s，分装三角瓶中于121°C灭菌15min后立即倒入培养皿(由于 聚果胶酸钠极易凝固，且加热不易溶解，所以必须趁热倒平板)，制成平板干燥后使用。所述的营养琼脂培养基的配方为牛肉膏3g、蛋白胨lO.Og、氯化钠5.0g、琼脂 20g、水1000ml。在烧杯中加水，称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和琼脂，加热(100°C )溶化后， 调节PH值至7. 0-7. 2。分装，121°C灭菌20min。所述的营养肉汤培养基的配方为牛肉膏3g、蛋白胨10.0g、氯化钠5. OgjK 1000ml。在烧杯中加水，称取牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，加热(100°C )溶化后，调节pH值至 7.0-7.2。分装，121°C灭菌 20min。
权利要求
一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法，其步骤是A、标样选择选取软腐病症状的魔芋组织，在发病扩展前沿病健交界处，切割0.5 1.5cm组织块；B、组织消毒将组织块用自来水冲洗，选用75％体积比酒精消毒60 90s，然后用无菌水冲洗2 4次，在放有吸水纸的托盘上用手术刀在无菌操作台上切成0.5×0.5cm的组织块，接到营养琼脂培养基上；C、细菌的获得将组织块周边长出的菌采用平板划线分离法进行分离，24 28℃培养箱中培养48 72h后观察，根据菌落形态、颜色细菌培养性状，挑选单菌落，然后将细菌纯培养保存；D、软腐病病原菌的筛选将获得的纯培养细菌接种到欧文氏菌具有特色的结晶紫聚果胶选择性培养基上，24 28℃培养箱中培养48 72h后观察，菌体凹陷生长的为软腐病病原菌；E、采用点接法进行拮抗菌的初筛将营养肉汤培养基过夜培养的浓度为1×108cfu/ml的魔芋软腐病病原菌菌悬液0.1ml涂布于营养琼脂培养基平板上，然后在每个平板上用无菌牙签均匀接种四个从魔芋病建交接处分离到的非软腐病病原菌，每个接菌平板平行做三份，本步骤重复三次，30℃恒温培养箱中培养24h后测定其抑菌圈直径；F、采用牛津杯法进行拮抗菌的复筛将初筛的拮抗菌株在营养肉汤培养基中200r/min，30℃培养2d，发酵液6000g离心20min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，经营养琼脂培养基培养无菌落生成，为无菌滤液，取过夜培养的魔芋软腐病病原菌菌悬液浓度为1×108cfu/ml的0.1ml均匀涂于营养琼脂培养基上，在每个平板上摆放牛津杯，在每个牛津杯中加入0.2ml的供试拮抗菌无菌滤液，每个平板牛津杯加入拮抗菌无菌滤液的处理平行做三份，本步骤重复三次，30℃恒温培养箱中培养24h后测定其抑菌圈直径。
2.根据权利要求1所述的一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法，其特征在 于所述的培养基为将搅碎器预加热，在IOOOml煮沸的蒸馏水，将以下成分依次加入，用 低速搅拌。10%质量比结晶紫的水溶液2. OmlUmol/1氢氧化钠9. 0ml、1 %质量比配制的氯 化钙9ml、琼胶4g、硝酸钠2g、随后将聚果胶酸钠18g加入，高速搅拌15s，分装三角瓶中于 121°C灭菌15min后倒入培养皿，制成平板干燥后使用。
3.根据权利要求1所述的一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法，其特征 在于所述的营养琼脂培养基为牛肉膏3g、蛋白胨10. 0g、氯化钠5. 0g、琼脂20g、蒸馏 水1000ml，在烧杯中加水，称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和琼脂，加热溶化后，调节pH值至 7. 0-7. 2，分装，121°C灭菌 20min。
4.根据权利要求1所述的一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法，其特征在 于所述的营养肉汤培养基为牛肉膏3g、蛋白胨10. 0g、氯化钠5. 0g、蒸馏水1000ml，在 烧杯中加水，称取牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，加热溶化后，PH值7. 0-7.2，分装，1211灭菌 20mino
全文摘要
本发明公开了一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法，其步骤是A、取感染软腐病的魔芋组织；B、病健交界处组织表面消毒后接到营养琼脂培养基上；C、将组织边长出的细菌划线，挑单菌落纯化、保存；D、采用欧文氏菌具有特色的结晶紫聚果胶选择性培养基(CVP)筛选魔芋软腐病病原菌；E、采用点接法进行拮抗菌的初筛；F、采用牛津杯法进行拮抗菌的复筛。本发明具有操作简便、方法易行、能快速有效的筛选出抗魔芋软腐病病原菌拮抗菌，同时为其他作物病害拮抗菌快速筛选提供了思路。
文档编号C12N1/00GK101892156SQ201010221539
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月2日 优先权日2010年7月2日
发明者向发云, 吴金平, 宋志红, 曾祥国, 顾玉成 申请人:湖北省农业科学院经济作物研究所