专利名称：大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法
技术领域：
本发明涉及一种大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法，属于植物基因工 程领域。
背景技术：
大豆是重要的经济作物，因此提高和优化大豆品质成为人们关注的热点。建立一 个良好的组培再生系统，是大豆遗传转化成功的前提。虽然目前转基因大豆在全球已经大 规模种植，其遗传转化仍然是基因工程领域的难点之一。大豆遗传转化系统局限于农杆菌 介导的子叶节转化系统和胚芽转化系统。这几种转化系统都存在转化频率低、难于重复及 依赖于特定的基因型等问题。大豆基因转移和功能基因组学的进步因而受到目前的转化系 统限制。农杆菌是一种土壤寄生菌，具有天然感染植物细胞的能力，农杆菌介导的遗传 转化已经广泛应用于单子叶和双子叶植物中。目前应用的农杆菌主要有根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)禾口发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)，在植物基因 工程中，利用根瘤农杆菌介导的遗传转化最多。根癌农杆菌具有趋化性，侵染受体时，在植 物受伤组织产生的一些糖类和酚类物质诱导下，向受伤组织集中，通过供体和受体特异互 作，农杆菌细胞识别并附着到植物细胞表面，将Ti质粒上的一段T-DNA片段导入植物细胞 并整合到植物基因组中。这个转化过程主要包括农杆菌积聚、农杆菌致毒系统的诱导、 T-DNA转移复合物的形成、T-DNA转入并整合到植物基因组，植物受伤后产生的酚类诱导物 主要为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不 存在于单子叶植物中，一些中性糖(如L-阿拉伯糖、D-木糖等)对农杆菌也有诱导作用。 这些酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒 上Vir区(毒性区)基因的诱导物，使Vir区基因活化，促使T-DNA的加工和转移，从而侵 染植物细胞。1988年H inchee等首次用农杆菌介导法获得大豆转基因植株。从100个栽培品 种中筛选到对农杆菌敏感的品种Peking，用农杆菌转化其子叶外植体，经检测再生植株中 仅有6%为转基因植株。2001年Clement等也使用了与Hinche等相似的方法，以草甘麟作 为筛选剂，获得了 196个转基因植株。1996年Di等用农杆菌/子叶节系统以卡那霉素为 筛选剂将BPMV(bean pod mottle virus)外壳蛋白基因转人大豆。2000年Donaldson等 用农杆菌转化12个短季大豆品种子叶节，感染率可达92%，但仅从品种Accolibri得到了 遗传稳定的转基因植株，且转化率极低。2001年P. M. olhoft等发现在固体共培养培养基 中加入L-半胧氨酸(L-Cys)能大大提高农杆菌对子叶节区的感染率。1989年Parrott等 用14个大豆品种的未成熟子叶为外植体，接种土壤农杆菌EHA 101或LBA4404，两株菌都含 有质粒PH5PZ3D，该质粒带有15kD的玉米醇溶蛋白基因(zein)和新霉素磷酸转移酶基因 (apt II)，得到3株转基因植株。2000年B. Ya η等利用根癌农杆菌感染大豆未成熟子叶， 通过体细胞胚发生过程得到3株转基因植株，转化效率为0. 03%。这一系统的转化效率仍很低。最近，人们又发现了一些新的转化方法超声辅助农杆菌转化法(SAAT)、真空抽滤辅 助农杆菌转化完整植株法、微粒轰击与农杆菌综合法等，但大豆转化的频率仍很低，远未达 到模式化水平，还存在着重复性差，受大豆基因型限制的缺点，因此，尚需深入研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法。本发明所述大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法包括种子的消毒及预 培养处理；种子胚膨大萌动后经切割，暴露或损伤萌动胚部位；真空渗透辅助法将含有目 的基因的农杆菌侵染萌动胚；共培养；丛生芽再生、筛选及小苗生根、筛选；小苗壮苗及移 栽。具体是(1)种子消毒及预培养处理将大豆种子用70%乙醇消毒5分钟，去净乙醇后用0. 1 % HgCl2消毒10分钟，无 菌水冲洗5-6遍，在25°C -28°C下无菌水浸种12小时。将浸种后胚膨大萌动的大豆放入预培养培养基，28°C、光培养1天，其中所述预 培养培养基配方为MS+3. 0-3. 5mg/L 6_BA(6_苄氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂， ρΗ5· 8。(2)种子胚膨大萌动后经切割，暴露或损伤萌动胚部位当预培养的大豆胚整体膨大、胚根长至0.5士0. 1mm，未突破种皮时，剥去种皮，切 去胚根，保留胚芽、胚轴及1/2的子叶，同时用解剖针在胚芽尖处刺针，使针眼布满胚芽尖。(3)真空渗透辅助法将含有目的基因的农杆菌侵染萌动胚将4°C保存的带有植物表达载体的农杆菌在添加了 50mg/L利福平的YEP固体培 养基上划线，28°C黑暗培养3天后挑取单菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液体培养基， 黑暗下28°C、200r/min振荡培养24小时后再次转接，相同条件下培养16小时。将菌液置 于灭菌的离心管中，5000rpm离心5分钟收集菌体，用侵染液重悬菌体，调整至0D_值为 0. 6-0. 8，加入30mg/L乙酰丁香酮，备用；其中所述侵染液配方为0. IMS大量元素+0. IMS 微量元素+B 5维生素+0. 5MES+1%葡萄糖+2%蔗糖，pH5. 4。将步骤2)处理后的大豆胚浸在OD6tltl为0. 6-0. 8并加入30mg/L乙酰丁香酮的农 杆菌悬液中，抽真空并维持0. 05MPa压力5-8分钟，然后置黑暗下28°C、200r/min振荡培养 15-20分钟。⑷共培养将步骤(3)的大豆取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，切面朝下置于共培养培养基 上，25°C _28°C下暗培养3-4天；其中所述共培养培养基配方为MS+30mg/L乙酰丁香酮 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂，pH5. 8。(5)丛生芽再生、筛选及小苗生根、筛选将步骤4)所述暗培养后的大豆胚用无菌水清洗3-4次，再用无菌滤纸吸干，转 接至丛生芽诱导培养基上，在25°C _28°C、且每日光照14小时条件下，每两周换至新的 培养基，连续培养20士2天，分化出丛生芽。其中所述丛生芽诱导筛选培养基配方为 MS+3. 0-3. 5mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+0. 2-0. 5mg/L IAA(吲哚乙酸)+15mg/L卡那霉素 +200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5. 8。
选筛选后长至1-2厘米的丛生芽，将小芽单独剪下，转移到生根筛选培养基上，在 250C _28°C、且每日光照14士 1小时条件下，连续培养14天。其中所述生根筛选培养基配方 为MS+0. 4-0. 6mg/L IBA (乙哚丁酸)+25mg/L卡那霉素+200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖 +7g/L 琼脂，pH5. 8。(6)小苗壮苗及移栽选步骤5)所得的根系生长良好的小苗转移到壮苗培养基上，在25°C -28°C且每 日光照14-15小时条件下，培养7-10天；其中所述壮苗培养基配方为MS+2. 0-2. 5mg/L KT (激动素)+0. 4-0. 6mg/L NAA( α -萘乙酸)+20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂，ρΗ5· 8。当小苗经筛选存活、且根系生长良好后，将其不伤及根部取出，除去残存培养基移 入土壤，用薄膜覆盖花盆以提高湿度。上述大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法中所述预培养培养基配方优 选为MS+3. 2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5. 8。上述大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法中所述丛生芽诱导筛选培 养基配方优选为MS+3. 2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0. 35mg/L吲哚乙酸+15mg/L卡那霉素 +200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5. 8。上述大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法中生根筛选培养基配方优选 为MS+0. 5mg/L乙哚丁酸+25mg/L卡那霉素+200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L琼脂， ρΗ5· 8。上述大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法中壮苗培养基配方优选为 MS+2. 2mg/L 激动素 +0. 5mg/L α -萘乙酸 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂，pH5. 8。当小苗在土壤中长出4-7片新叶，剪取2-3片新叶用CTAB法提取DNA检测。大豆叶片经液氮研磨后迅速转移至1.5ml离心管中，加入600 μ 1 65°C预热的 2XCTAB提取缓冲液，颠倒离心管混勻，65°C水浴30分钟。混合物冷却至室温后加入等体 积的酚氯仿异戊醇(体积比25 24 1)，混勻后12000rpm离心10分钟，上清液转 移至新管，加入等体积氯仿异戊醇(体积比24 1)，混勻后12000rpm离心10分钟，上 清液转移至新管，加入三分之二体积预冷的异丙醇，混勻，12000rpm离心10分钟，弃去上清 液，70%乙醇不打散沉淀洗涤3次，弃去乙醇将沉淀晾干，用30 μ 1双蒸水溶解后PCR检测。本发明所述真空渗透辅助的大豆萌动胚外源基因转化方法的特点和有益效果 是(1)丛生芽再生速度快，转化周期短，从大豆预处理开始60-70天即可获得转基因 植株；(2)以萌动胚为外植体诱导丛生芽可以避免愈伤组织培养中引起的不良变异；(3)本发明的萌动胚丛生芽再生体系再生率高且适用于多种大豆品种(例如冀 豆12号，圣豆9号等)，适用性广，克服了基因型对大豆遗传转化的限制；(4)不可育的再生植株少；(5)外植体来源广，不受时间限制；(6)操作比较简单，易于掌握，重复性好；(7)转化频率高，是一个能够用于大豆转基因育种的有效的体系。
图1示PK7WG2D载体图(含snacl和snac6基因)。图2示大豆再生苗生根。图3示pKGWFS7载体图(含gus基因)。图4示转gus基因植株PCR阳性植株的⑶S染色结果。图5转snacl基因植株35S引物PCR检测电泳图，其中M为Marker (DNA/ HindIII-EcoRI)。图6示转snacl基因植株snacl基因引物PCR检测电泳图，其中M为Marker (DNA/ HindIII-EcoRI)。图7示示转snacl基因植株snacl基因在大豆中的非重复序列引物PCR检测电泳 图，其中 M 为 Marker (DNA/HindlII-EcoRI)。图8示转snac6基因植株35S引物PCR检测电泳图，其中M为Marker (DNA/ HindIII-EcoRI)。图9示转snac6基因植株snac6基因引物PCR检测电泳图，其中M为Marker (DNA/ HindIII-EcoRI)。图10示转SnaC6基因植株snaC6基因在大豆中的非重复序列引物PCR检测电泳 图，其中 M 为 Marker (DNA/HindlII-EcoRI)。
具体实施例方式实施例1 以冀豆12 (购买自潍坊农科院)为受体材料，转化菌株为携带psnacl :K7WG2D载 体的农杆菌菌株AGL104 (载体购买自Invitrogen公司)。(1)种子消毒及预培养处理将大豆种子用70%乙醇消毒5分钟，去净乙醇后用0. 1 % HgCl2消毒10分钟，无 菌水冲洗5-6遍，在25°C -28°C下无菌水浸种12小时。将浸种后胚膨大萌动的大豆放入预培养培养基，28°C、光培养1天，其中所述预培 养培养基配方为MS+3. Omg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5. 8。(2)种子胚膨大萌动后经切割，暴露或损伤萌动胚部位当预培养的大豆胚整体膨大、胚根长至0. 5士0. Imm,未突破种皮时，剥去种皮，切 去胚根，保留胚芽、胚轴及1/2的子叶，同时用解剖针在胚芽尖处刺针，使针眼布满胚芽尖。(3)真空渗透辅助法将含有目的基因的农杆菌侵染萌动胚将4°C保存的带有植物表达载体的农杆菌在添加了 50mg/L利福平的YEP固体培养 基上划线，28°C黑暗培养3天后挑取单菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液体培养基，黑 暗下28°C、200r/min振荡培养24小时后再次转接，相同条件下培养16小时。将菌液置于 灭菌的离心管中，5000rpm离心5分钟收集菌体，用侵染液重悬菌体，调整至0D_值为0. 6， 加入30mg/L乙酰丁香酮备用。其中所述侵染液配方为0. IMS大量+0. IMS微量+B 5维生 素 +0. 5MES+1% 葡萄糖 +2% 蔗糖，ρΗ5· 4。将步骤(2)的大豆浸入农杆菌菌液中，抽真空并维持0.05MPa压力5-8分钟，黑暗 下28°C、200r/min振荡培养，侵染15_20min钟。
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(4)共培养将步骤(3)的大豆取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，切面朝下置于共培养培养基 上，25°C _28°C下暗培养4天。其中所述共培养培养基配方为MS+30mg/L乙酰丁香酮+20g/ L 蔗糖 +7g/L 琼脂，pH5. 8。(5)丛生芽再生、筛选及小苗生根、筛选将共培养后的大豆用无菌水清洗4次，再用无菌滤纸吸干，转接至丛生芽诱导培 养基上，在25°C、且每日光照14小时条件下，每两周换至新的培养基，连续培养20士2天， 分化出丛生芽。其中所述丛生芽诱导筛选培养基配方为MS+3.0mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌 呤)+0. 2mg/L IAA (吲哚乙酸)+15mg/L卡那霉素+200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L 琼脂，pH5. 8。选筛选后长至1-2厘米的丛生芽，将小芽单独剪下，转移到生根筛选培养基上，在 25°C°C、且每日光照14士 1小时条件下，连续培养14天。其中所述生根筛选培养基配方为 MS+0. 4mg/L IBA (乙哚丁酸)+25mg/L卡那霉素+200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L琼 脂，pH5. 8。(6)小苗壮苗及移栽选根系生长良好的小苗转移到壮苗培养基上，在25°C°C且每日光照14小时条件 下，培养7-10天。当小苗经筛选存活、且根系生长良好后，将其不伤及根部取出，除去残存 培养基移入土壤，用薄膜覆盖花盆以提高湿度。其中所述壮苗培养基配方为MS+2.0mg/ LKT(激动素)+0. 4mg/L ΝΑΑ(α-萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，ρΗ5· 8。移栽成活率大 于 90%。当小苗在土壤中长出4-7片新叶，剪取2-3片新叶用CTAB法提取DNA检测。大豆 叶片经液氮研磨后迅速转移至1. 5ml离心管中，加入600 μ 1 65°C预热的2 X CTAB提取缓冲 液，颠倒离心管混勻，65°C水浴30分钟。混合物冷却至室温后加入等体积的酚氯仿异 戊醇(体积比25 24 1)，混勻后12000rpm离心10分钟，上清液转移至新管，加入等体 积氯仿异戊醇(体积比24 1)，混勻后12000rpm离心10分钟，上清液转移至新管，加入 三分之二体积预冷的异丙醇，混勻，12000rpm离心10分钟，弃去上清液。70%乙醇不打散沉 淀洗涤3次，弃去乙醇将沉淀晾干。用30 μ 1双蒸水溶解。PCR法检测阳性转基因植株抗性植株总DNA分别用35S启动子引物、snacl基因 引物和snacl基因在大豆中的非重复序列引物进行PCR检测。
PCR 反应条件如下预变性 94°C 5min，94°C 30sec，52°C -57°C 30min，72°C 2min, 35个循环，72°C延伸lOmin。PCR产物用1.0% Agrose电泳鉴定。结果利用大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法，对冀豆12进行了农杆 菌转化。三次生物学重复(共600颗种子)丛生芽芽再生获得510植株，抗生素筛选具有 抗性植株37株。转基因阳性植株经PCR检测，证明27株为阳性植株，转化率为5. 3%。实施例2 以圣豆9号(购买自潍坊农科院)为受体材料，转化菌株为携带有 psnac6: :K7WG2D 的农杆菌 AGL104 (p2K7GW7 载体购买自 Invitrogen 公司)。(1)种子消毒及预培养处理将大豆种子用70%乙醇消毒5分钟，去净乙醇后用0. 1 % HgCl2消毒10分钟，无 菌水冲洗5-6遍，在25°C -28°C下无菌水浸种12小时。将浸种后胚膨大萌动的大豆放入预培养培养基，28°C、光培养1天，其中所述预培 养培养基配方为MS+3. 2mg/L 6_BA(6_苄氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5. 8。(2)种子胚膨大萌动后经切割，暴露或损伤萌动胚部位当预培养的大豆胚整体膨大、胚根长至0. 5士0. Imm,未突破种皮时，剥去种皮，切 去胚根，保留胚芽、胚轴及1/2的子叶，同时用解剖针在胚芽尖处刺针，使针眼布满胚芽尖。(3)真空渗透辅助法将含有目的基因的农杆菌侵染萌动胚将4°C保存的带有植物表达载体的农杆菌在添加了 50mg/L利福平的YEP固体培养 基上划线，28°C黑暗培养3天后挑取单菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液体培养基，黑 暗下28°C、200r/min振荡培养24小时后再次转接，相同条件下培养16小时。将菌液置于 灭菌的离心管中，5000rpm离心5分钟收集菌体，用侵染液重悬菌体，调整至0D_值为0. 7， 加入30mg/L乙酰丁香酮备用。其中所述侵染液配方为0. IMS大量+0. IMS微量+B5维生 素 +0. 5MES+1%葡萄糖 +2%蔗糖，ρΗ5· 4。将步骤(2)的大豆浸入农杆菌菌液中，抽真空并维持0.05MPa压力5-8分钟，黑暗 下28°C、200r/min振荡培养，侵染15_20min钟。(4)共培养将步骤(3)的大豆取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，切面朝下置于共培养培养基 上，25°C _28°C下暗培养3天。其中所述共培养培养基配方为MS+30mg/L乙酰丁香酮+20g/ L 蔗糖 +7g/L 琼脂，pH5. 8。(5)丛生芽再生、筛选及小苗生根、筛选将共培养后的大豆用无菌水清洗4次，再用无菌滤纸吸干，转接至丛生芽诱导培 养基上，在28°C、且每日光照14小时条件下，每两周换至新的培养基，连续培养20士2天， 分化出丛生芽。其中所述丛生芽诱导筛选培养基配方为MS+3.2mg/L 6_BA(6_苄氨基腺嘌 呤)+0. 35mg/L IAA (吲哚乙酸)+15mg/L卡那霉素+200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L 琼脂，pH5. 8。选筛选后长至1-2厘米的丛生芽，将小芽单独剪下，转移到生根筛选培养基上，在 28°C、且每日光照14士 1小时条件下，连续培养14天。其中所述生根筛选培养基配方为 MS+0. 5mg/L IBA (乙哚丁酸)+25mg/L卡那霉素+200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L琼 脂，pH5. 8。(6)小苗壮苗及移栽选根系生长良好的小苗转移到壮苗培养基上，在28°C且每日光照14小时条件下， 培养7-10天。当小苗经筛选存活、且根系生长良好后，将其不伤及根部取出，除去残存培养 基移入土壤，用薄膜覆盖花盆以提高湿度。其中所述壮苗培养基配方为MS+2.2mg/LKT(激 动素)+0.5mg/L ΝΑΑ(α-萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。移栽成活率大于90%。当小苗在土壤中长出4-7片新叶，剪取2-3片新叶用CTAB法提取DNA检测。大豆 叶片经液氮研磨后迅速转移至1. 5ml离心管中，加入600 μ 1 65°C预热的2 X CTAB提取缓冲 液，颠倒离心管混勻，65°C水浴30分钟。混合物冷却至室温后加入等体积的酚氯仿异 戊醇(体积比25 24 1)，混勻后12000rpm离心10分钟，上清液转移至新管，加入等体 积氯仿异戊醇(体积比24 1)，混勻后12000rpm离心10分钟，上清液转移至新管，加入 三分之二体积预冷的异丙醇，混勻，12000rpm离心10分钟，弃去上清液。70%乙醇不打散沉 淀洗涤3次，弃去乙醇将沉淀晾干。用30 μ 1双蒸水溶解。PCR法检测阳性转基因植株抗性植株总DNA分别用35S启动子引物、snac6基因 引物和snace基因在大豆中的非重复序列引物进行PCR检测。
PCR 反应条件如下预变性 94°C 5min，94°C 30sec,50°C -55°C 30min,72°C 2min, 35个循环，72°C延伸lOmin。PCR产物用1.0% Agrose电泳鉴定。结果利用大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法，对圣豆9号了农杆菌 转化。三次生物学重复(共600颗种子)，丛生芽再生获得591株，抗生素筛选具有抗性植 株46株。转基因阳性植株经PCR检测，证明31株为阳性植株，转化率为5. 2%。本发明中所述MS培养基配方如下
权利要求
大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法，步骤包括1)种子的消毒及预培养处理；2)种子胚膨大萌动后经切割，暴露或损伤萌动胚部位；3)真空渗透辅助法将含有目的基因的农杆菌侵染萌动胚；4)共培养；5)丛生芽再生、筛选及小苗生根、筛选；6)小苗壮苗及移栽；其特征在于步骤1)所述预培养培养基配方为MS+3.0-3.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；步骤2)所述种子胚膨大萌动后经切割，暴露或损伤萌动胚部位是的方法是当预培养的大豆胚整体膨大、胚根长至0.5±0.1mm，未突破种皮时，剥去种皮，切去胚根，保留胚芽、胚轴及1/2的子叶，同时用解剖针在胚芽尖处刺针，使针眼布满胚芽尖；步骤3)所述真空渗透辅助法将含有目的基因的农杆菌侵染萌动胚的方法是将步骤2)处理后的大豆胚浸在OD600为0.6-0.8并加入30mg/L乙酰丁香酮的农杆菌悬液中，抽真空并维持0.05MPa压力5-8分钟，然后置黑暗下28℃、200r/min振荡培养15-20分钟；步骤4)所述共培养的方法是将步骤3)处理后的大豆胚切面朝下置于共培养培养基上，25℃-28℃下暗培养3-4天，其中所述共培养培养基配方为MS+30mg/L乙酰丁香酮+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；步骤5)所述丛生芽再生、筛选及小苗生根、筛选的方法是将步骤4)所述暗培养后的大豆胚用无菌水清洗3-4次，再用无菌滤纸吸干，转接至丛生芽诱导筛选培养基上，在25℃-28℃、且每日光照14-15小时条件下，连续培养20±2天，分化出丛生芽；选长至1-2cm的丛生芽，将小芽单独剪下，转移到生根筛选培养基上，在25℃-28℃、且每日光照14-15小时条件下，培养14±1天，进行生根及筛选，其中所述丛生芽诱导筛选培养基配方为MS+3.0-3.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.2-0.5mg/L吲哚乙酸+15mg/L卡那霉素+200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8，所述生根筛选培养基配方为MS+0.4-0.6mg/L乙哚丁酸+25mg/L卡那霉素+200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；步骤6)所述小苗壮苗的方法是选步骤5)所述生根的小苗转移到壮苗培养基上，在25℃-28℃、且每日光照14-15小时条件下，培养7-10天，其中所述壮苗培养基配方为MS+2.0-2.5mg/L激动素+0.4-0.6mg/L α-萘乙酸+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。
2.如权利要求1所述大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法，其特征在于所 述预培养培养基配方为MS+3. 2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5. 8。
3.如权利要求1所述大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法，其特征在于 所述丛生芽诱导筛选培养基配方为MS+3.2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0. 35mg/L吲哚乙酸 +15mg/L卡那霉素+200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5. 8。
4.如权利要求1所述大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法，其特征在于所 述生根筛选培养基配方为MS+0. 5mg/L乙哚丁酸+25mg/L卡那霉素+200mg/L头孢噻肟钠 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂，pH5. 8。
5.如权利要求1所述大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法，其特征在于所 述壮苗培养基配方为MS+2. 2mg/L激动素+0. 5mg/La -萘乙酸+20g/L蔗糖+7g/L琼脂， ρΗ5· 8。
全文摘要
本发明公开了一种大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法，所述方法包括以下步骤(1)种子的消毒及预培养处理(2)种子胚膨大萌动后经切割，暴露或损伤萌动胚部位(3)含有目的基因的农杆菌侵染萌动胚(4)共培养(5)丛生芽再生、筛选及小苗生根、筛选(6)丛生芽再生、筛选及小苗生根、筛选。本发明方法适用于多种基因型，且再生速度快，是一个能够用于大豆转基因育种的可靠体系。
文档编号C12N15/82GK101880686SQ20101022326
公开日2010年11月10日 申请日期2010年7月12日 优先权日2010年7月12日
发明者向凤宁, 姬丹丹, 王鹏 申请人:山东大学