专利名称：氧化葡萄糖酸杆菌的基因敲除菌及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，特别涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌的基因敲除菌及其制 备方法、用于该基因敲除的重组载体、以及该氧化葡萄糖酸杆菌的基因敲除菌的用途。
背景技术：
氧化葡萄糖酸杆菌(GluconcAacter oxydans)是生物工业及手性合成领域中广泛 应用的生物催化剂之一。其最大的特点就是具有不完全氧化一系列的糖醇类化合物的能 力，反应生成的酮、醛、酸等能够直接分泌到胞外，绝大多数反应都是由膜上的脱氢酶来参 与催化的，氧化效率非常高。这个特性使得氧化葡萄糖酸杆菌成为微生物工业生产的理想 菌株。目前，氧化葡萄糖酸杆菌已经成功应用于维生素C、二羟基丙酮、米格列醇、葡萄糖酸 及酮基葡萄糖酸等的工业生产。然而，在实际应用与研究中发现，氧化葡萄糖酸杆菌在生长中的最适碳源为山梨 醇。而当以葡萄糖为碳源时，培养基中往往需要加入CaCO3并且在发酵过程中由于膜结合 葡萄糖脱氢酶将葡萄糖氧化为葡萄糖酸使发酵液PH值很低，从而抑制了细胞的生长，需要 不断的调节发酵液PH值，这些因素使得菌体的发酵和分离过程都比较繁琐。同时在pH的 调节过程中，生产成本以及染菌几率相应都升高。但是，众所周知，山梨醇的价格比葡萄糖 要昂贵得多，同样AR级别的山梨醇市场价约300元/kg，葡萄糖只需20元/kg，工业山梨醇 报价约4. 5元/kg，而工业葡萄糖报价约2. 3元/kg。然而在氧化葡萄糖酸杆菌的生长过程 中需要消耗掉的山梨醇更高达80g/L，这样无疑加大了氧化葡萄糖酸杆菌在工业应用生产 中的成本，从而限制了其进一步扩大生产的可能。因此，如何降低氧化葡萄糖酸杆菌的饲养 成本，是当前急待解决的问题。目前，对氧化葡萄糖酸杆菌的高密度培养主要集中在以山梨 醇为主要碳源的培养基的优化上，而通过基因工程来改造氧化葡萄糖酸杆菌使其能充分的 利用葡萄糖并减少菌体在葡萄糖中发酵和分离的不必要麻烦进而降低氧化葡萄糖酸杆菌 的饲养成本的研究方法尚无报道。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的氧化葡萄糖酸杆菌的最适碳源为 价格昂贵的山梨醇，而以价格低廉的葡萄糖为碳源时存在菌体生长不良，工艺繁琐的缺陷， 提供一种氧化葡萄糖酸杆菌的基因敲除菌，其能以葡萄糖为唯一碳源，生长良好。本发明也 提供该氧化葡萄糖酸杆菌的基因敲除菌的制备方法、用于该基因敲除的重组载体、以及该 氧化葡萄糖酸杆菌的基因敲除菌的用途。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是一种用于基因敲除的重组载 体，其依次含有氧化葡萄糖酸杆菌(GluconcAacter oxydans)膜结合葡萄糖脱氢酶(mgdh) 基因同源重组前臂、标记基因和mgdh基因同源重组后臂。本发明中，所述的标记基因可以是常规的各种抗生素基因，优选抗生素抗性基因， 更优选庆大霉素抗性基因(Gm)，更佳的是核苷酸序列为Genbank登录号为U25061. 1的第3575 4608 位。本发明中，所述的mgdh基因同源重组前臂和后臂的长度为0. 5 1. 51Λ，优选分别 是Genbank登录号为AAW60048的第180 1151位、第1186 2231位。本发明中，所述的重组载体优选自杀载体，更优选质粒pSUP202。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是一种氧化葡萄糖酸杆菌的基 因敲除菌，其为mgdh基因敲除菌。本发明中，所述的mgdh基因的Genbank登录号为AAW60048。较佳的敲除了 Genbank登录号为AAW60048的第180 2231位。本发明中，所述的氧化葡萄糖酸杆菌优选氧化葡萄糖酸杆菌621H。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是一种氧化葡萄糖酸杆菌 mgdh基因敲除菌的制备方法，包括以下步骤1)用所述的用于基因敲除的重组载体转化大肠杆菌，得到转化子；2)将步骤1)所得的转化子作为供体菌，氧化葡萄糖酸杆菌作用受体菌，进行两亲 本接合，所述的重组载体进入氧化葡萄糖酸杆菌中和其染色体上的mgdh基因发生同源双 交换，获得的接合子即为mgdh基因敲除菌。本发明中，所述的氧化葡萄糖酸杆菌和大肠杆菌的接合是常规方法。其中，步骤1) 所得的转化子是供体菌，氧化葡萄糖酸杆菌是受体菌。大肠杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌作为 两个亲本发生接合，从而使转化子中含有的重组载体进入氧化葡萄糖酸杆菌中。由于所述 的重组载体带有膜结合葡萄糖脱氢酶的同源片段(gdhl，gdM)，因此可以和氧化葡萄糖酸 杆菌染色体上的mgdhDNA片段发生同源双交换，将含Gm抗性基因的mgdh片段整合到氧化 葡萄糖酸杆菌的染色体上，从而使膜结合葡萄糖脱氢酶基因失活，所得的接合子即为mgdh 基因敲除菌。而所述的转化子的宿主大肠杆菌可以是大肠杆菌的K-12株来源的菌株，例如 DH5a，了M109，优选 E. coli 了M109。较佳的，如本领域常规技术一样，步骤幻中还可以加入帮助菌，进行三亲本接合。 所述的帮助菌是含帮助质粒PRK2013或者PRK2073的大肠杆菌。该含帮助质粒的大肠杆菌 可以是大肠杆菌的K-12株来源的菌株，例如DH5a，JM109，优选E. coli HBlOl0在帮助菌 的作用下，供体菌和受体菌的接合效率大大增强。本发明中，所得的mgdh基因敲除菌生长和利用葡萄糖较缓慢，为此优选的还包括 3)氧化葡萄糖酸杆菌mgdh基因敲除菌的适应性进化的步骤。具体是在葡萄糖为唯一碳源 的培养基中进行培养，每一定时间转接一次，直到获得菌体得率和比生长速率明显的菌株。 优选每M小时转接一次，接种比例为1 100(体积比)，连续培养10天。所述的葡萄糖 为唯一碳源的培养基的成分较佳的含有葡萄糖和酵母粉，更佳的含有葡萄糖10g/L，酵母粉 20g/L。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之四是如上所述的氧化葡萄糖酸杆 菌mgdh基因敲除菌的用途。用作生物工业及手性合成领域中的生物催化剂。特别的应用 于维生素C、二羟基丙酮、米格列醇的工业生产。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明采用基因敲除和适应性进化所 得到的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌GDHE，可以采用相对低廉的葡萄糖作为碳源进行培养，获得较高的生长速率和菌体得率，同时葡萄糖的添加浓度要远远低于工业上应用的山 梨醇添加浓度80g/L，仅为10g/L。因此对于工业上应用的不以膜结合葡萄糖脱氢酶为关键 酶的催化反应如在维生素C前体、抗II型糖尿病药物米格列醇前体及二羟基丙酮等的工业 生产中，完全可以用葡萄糖代替山梨醇等作为发酵碳源，进行细胞的转化前培养，能够大大 节约生产成本。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1是敲除载体构建过程示意图。图2是同源双交换流程示意图。图3是敲除菌在含有碳酸钙的葡萄糖酵母粉固体平板上的筛选，成功敲除mgdh基 因的氧化葡萄糖酸杆菌在该平板上不产生透明圈，而未成功的依旧可以产生透明圈。图4是氧化葡萄糖酸杆菌621H，基因敲除菌⑶HK和进化菌⑶HE在葡萄糖酵母粉 液体培养基中的生长情况。其中，621Η( Δ )，⑶HK( )，⑶HE( □)。
具体实施例方式因为导致氧化葡萄糖酸杆菌在葡萄糖上生长催化性能差的原因主要是因为膜结 合葡萄糖脱氢酶对葡萄糖的氧化，生成的葡萄糖酸导致培养基中PH的极具降低，最终影响 了菌体的生长和催化性能。本发明首先构建了 mgdh基因敲除菌GDHK，消除膜结合葡萄糖脱 氢酶催化导致酸的积累，同时通过代谢进化的方法，得到了适宜用于工业生产应用的具有 较高菌体得率和较好生长特性的菌株GDHE。以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实 验室手册》中所述的条件进行。实施例1敲除菌株⑶HK (/ Δ mgdh)的构建利用同源交换的方法进行氧化葡萄糖酸杆菌基因组中膜结合葡萄糖脱氢酶 (mgdh)基因的敲除。mgdh基因在膜上负责催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸的反应，是培养基 酸化的主要原因。具体如下 1.1 敲除载体 pSUP202_mgdh Gm 的构建提取氧化葡萄糖酸杆菌621H(购买自德国DSMZ股份有限公司)的全基因组DNA， 以其为模版，利用以下引物对分别PCR扩增上游片段gdhl和下游片段gdh2。引物对1:gdh IF-Nco I :AATCCATGG GGCTGCCCTCTACCTGTT ；gdh IR-Kpn I -Xba I -EcoR I :GCCGAATTC TCTAGA GGTACC GCATCGAACACCCAGACA。引物对2:gdh2F-Xba I :AACTCTAGA AGCCACCCTGTCTTCCAC ；gdh2R-EcoR I :AACTCTAGA AGCCACCCTGTCTTCCAC。
以质粒 pBBRlMCS-5 (Kovach ME, Elzer PH, Hill DS, Robertson GT, Farris ΜΑ, Roop RM, and Peterson KM. Four new derivatives of the broad—hostrange cloning vector pBBRlMCS carrying different antibioticresistance cassettes. Gene. 1995, 166:175-176.取自美国路易斯安那州立大学医学中心微生物学与免疫学系.Kovach ME教 授)为模版，以下述引物PCR扩增庆大霉素抗性基因(Gm)GmF-Kpn I :TAAGGTACC CGTGGAAACGGATGAAGG ；GmR-Xba I :GCGTCTAGA TCTCGGCTTGAACGAATT。回收PCR产物，酶切，如图1所示连接到载体pSUP202 (Simon R,Priefer U,Puhler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering transposon mutagenesis in Gram negative bacteria. Biotechnology. 1983, 1 784-791.取自德国比勒费尔德大学生物学院遗传学系.Simon R教授)上，从而得到重组 质粒pSUP202-mgdh: :Gm，完成敲除载体的构建。经验证，敲除载体中所含的序列是依次是 Genbank登录号为AAW60048的第180 1151位、登录号为U25061. 1的第3575 4608位、 第1186 2231位。1. 2将敲除载体导入氧化葡萄糖酸杆菌胞内完成基因敲除①供体菌的建立用重组质粒pSUP202-mgdh: :Gm转化感受态E. coliJM109 (购买 自 novagen 公司)，得到含有重组质粒 pSUP202_mgdh: :Gm 的 Ε. coli JM109。帮助菌的建立用质粒pRK2013(购于Clontech公司)转化感受态 E. coliHBlOl (购买自novagen公司)，得到含有帮助质粒pRK2013的Ε. coli HBlOl。②菌体培养分别将供体菌、帮助菌接种在各加有庆大霉素100mg/L和卡那霉素 100mg/L的LB中培养约8小时。受体菌氧化葡萄糖酸杆菌621H接种在山梨醇培养基(山 梨醇80g/L，酵母粉20g/L，头孢菌素100mg/L)中培养约18小时。③三亲接合取上述受体亲本菌液1. 5ml，离心收集菌体，倒掉上清，用生理盐水 洗两次后，倒掉液体，加入0. 5ml帮助菌液，离心收集菌体后加入1. 5ml供体菌，离心收集菌 体后用山梨醇培养基洗一次，倒掉液体，在剩下的少量培养基中用微量移液器将细胞混勻， 转移到不加抗生素的固体山梨醇培养基上涂布，倒置30°C培养过夜。重组质粒pSUP202-mgdh::Gm可以在帮助菌的帮助下进入氧化葡萄糖酸杆菌 621H，由于其上带有膜结合葡萄糖脱氢酶的同源片段(gdhl，gdM)，因此可以和氧化葡萄糖 酸杆菌621H染色体上的mgdh DNA片段发生双交换，将含Gm基因的mgdh片段整合到氧化 葡萄糖酸杆菌621H的染色体上，从而使膜结合葡萄糖脱氢酶基因失活。同源双交换的流程 示意图见图2。④接合子的筛选将培养过夜的三亲接合菌体用无菌双蒸水从固体山梨醇培养基 上洗下，涂布到加入头孢菌素和庆大霉素各100mg/L的固体山梨醇培养基平板上，培养2 4天。氧化葡萄糖酸杆菌621H本身具有头孢菌素(Cefoxitin)抗性，Cefoxitin用于杀死 三亲本结合过程中有庆大霉素抗性的大肠杆菌。质粒PSUP202是自杀质粒，进入氧化葡萄 糖酸杆菌621H后不久就不能存在，只有含Gm抗性基因的mgdh片段整合到染色体上的氧化 葡萄糖酸杆菌621H才具Gm抗性，因此通过Cefoxitin、Gm来筛选三亲接合子。1. 3敲除菌的筛选和验证将筛选到的接合子进一步用影印平板法转接到含有碳酸钙的葡萄糖固体培养基(成分葡萄糖20g/L，酵母粉20g/L，碳酸钙10g/L)上。30°C培养2_4天。敲除子因为缺少 膜结合葡萄糖脱氢酶，所以在葡萄糖培养基上不会产生酸，在其菌落周围不会产生透明圈， 如图3示。根据此原则，去除初筛中得到的假阳性菌落，挑取周围无透明圈的菌落即得到敲 除菌GDHK。实施例2氧化葡萄糖酸杆菌mgdh基因敲除菌的进化在250ml的摇瓶中放置50ml培养基，培养基成分为葡萄糖10g/l和酵母粉20g/ 1。培养基中不添加任何抗生素。接种比例为1 100(体积比)，大约M小时转接一次(培 养过程中随菌体倍增时间的改变而改变初始接种量或者转接时间)。培养第10天的菌株的 菌体得率和比生长速率得到明显的改善，命名为GDHE。将原始菌G. oxydans 621H与敲除突变体⑶HK、⑶HE在山梨醇培养基中活化到 0D600 = 1. 0，以的接种量转接到50ml新鲜的葡萄糖培养基(成分葡萄糖10g/L，酵母 粉20g/L)中，30°C摇床培养，每1小时测一次0D600值。对照OD值与干重标准曲线，确定 菌体对应的干重变化，绘制生长曲线，见图4，横坐标为时间变化，纵坐标为对应干重。可见， 通过敲除和进化之后，⑶HE的细胞生长密度较原始菌提高了 163%。综上所述，采用基因敲除和适应性进化所得到的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌 GDHE，可以采用相对低廉的葡萄糖作为碳源进行培养，并且可以获得较高的生长速率和 菌体得率，同时葡萄糖的添加浓度要远远低于工业上应用的山梨醇添加浓度80g/L，仅为 10g/L。因此对于工业上应用的不以膜结合葡萄糖脱氢酶为关键酶的催化反应如在维生素C 前体、抗II型糖尿病药物米格列醇前体及二羟基丙酮等的工业生产中，完全可以用葡萄糖 代替山梨醇等作为发酵碳源，进行细胞的转化前培养，能够大大节约生产成本。
权利要求
1.一种用于基因敲除的重组载体，其特征在于，其依次含有氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacter oxydans)mgdh基因同源重组前臂、标记基因和mgdh基因同源重组后臂。
2.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述的标记基因是抗生素抗性基因。
3.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述的mgdh基因同源重组前臂和后臂 的长度为0. 5 1.5kb。
4.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体是质粒PSUP202。
5.一种氧化葡萄糖酸杆菌的基因敲除菌，其特征在于，其为mgdh基因敲除菌。
6.如权利要求5所述的基因敲除菌，其特征在于，所述的氧化葡萄糖酸杆菌是氧化葡 萄糖酸杆菌621H。
7.—种如权利要求5或6所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因敲除菌的制备方法，其特征在 于，包括以下步骤1)用权利要求1 4任一项所述的用于基因敲除的重组载体转化大肠杆菌，得到转化子；2)将步骤1)所得的转化子作为供体菌，氧化葡萄糖酸杆菌作用受体菌，进行两亲本接 合，所述的重组载体进入氧化葡萄糖酸杆菌中和其染色体上的mgdh基因发生同源双交换， 获得的接合子即为mgdh基因敲除菌。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中还加入帮助菌，进行三亲本接 合，所述的帮助菌是含帮助质粒PRK2013或者PRK2073的大肠杆菌。
9.如权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，还包括3)氧化葡萄糖酸杆菌mgdh 基因敲除菌的适应性进化的步骤在葡萄糖为唯一碳源的培养基中进行培养，每一定时间 转接一次，直到获得菌体得率和比生长速率明显的菌株。
10.如权利要求5或6任一项所述的氧化葡萄糖酸杆菌mgdh基因敲除菌的用途，其特 征在于，用作生物工业及手性合成领域中的生物催化剂。
全文摘要
本发明公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的基因敲除菌及其制备方法和用途以及所用的基因敲除载体。该制备方法包括1)用基因敲除重组载体转化大肠杆菌，得到转化子，该基因敲除重组载体依次含有氧化葡萄糖酸杆菌mgdh基因同源重组前臂、标记基因和mgdh基因同源重组后臂；2)用转化子和氧化葡萄糖酸杆菌进行两亲本接合，所述的重组载体进入氧化葡萄糖酸杆菌中和其染色体上的mgdh基因发生同源双交换，获得的接合子即为mgdh基因敲除菌。本发明的膜结合葡萄糖脱氢酶基因(mgdh)敲除菌利用葡萄糖为唯一碳源生长良好，克服了原氧化葡萄糖酸杆菌只能利用价格高昂的山梨醇作为有效碳源的不足，大大节约生产成本，在生物合成及手性合成领域具有重要意义。
文档编号C12P17/12GK102146415SQ20101022833
公开日2011年8月10日 申请日期2010年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者卢磊芳, 张敏华, 柳志杰, 祝坤, 花强, 韦柳静, 魏东芝 申请人:华东理工大学