专利名称：牛肌卫星细胞的体外分离培养及诱导分化的方法
技术领域：
本发明涉及细胞的体外分离培养及诱导分化的方法。
背景技术：
骨骼肌组织中的成肌细胞是以肌卫星细胞(satellite cell, SC)的形式而存在； 实验表明骨胳肌中的肌卫星细胞有自我更新及成肌、成骨、成脂肪等能力，亦称之为“肌肉 干细胞”，这种细胞是向成肌细胞系定向的一种前体细胞；肌肉再生过程主要是由肌卫星细 胞来完成的；肌卫星细胞位于肌纤维的肌膜与基底膜之间，一般为小梭形扁平的单核细胞； 当肌肉组织受到刺激时如骨骼肌受损时，卫星细胞就会被激活，大量分裂、增殖并相互融合 形成再生肌纤维；激活的卫星细胞与受损伤细胞融合以修复受损伤细胞，或几个成肌细胞 融合形成肌管，进而生成新的肌细胞。卫星细胞的激活、增殖和分化也是骨骼肌细胞肥大、 数目增多以及肌纤维转化的重要机制。肌卫星细胞体外分离培养成为研究肌肉分化途径及 性状改良的分子机制的重要技术平台，为改良家畜肌肉品质及畜牧业生产领域奠定研究基 石出。肌细胞是肌组织的前体细胞，易培养、可塑性强，具有骨骼肌的许多重要生物特 性，对于肌卫星细胞的研究成为生物组织工程中的一个热门领域。不同年龄、不同肌肉类型 中卫星细胞的数目不同，因此取材对于肌卫星细胞的原代培养很重要；一般来说，年幼个体 的卫星细胞含量较丰富。
目前，牛肌卫星细胞的分离培养一般均选用胶原酶XI和分散酶结合的方法，但是这两 种酶的价格较高，导致牛肌卫星细胞的体外分离培养成本较高；且采用现有技术分离培养 的牛肌卫星细胞传代稳定性不好，仅为1 10代。肌卫星细胞诱导分化为肌肉细胞的方法 为采用DMEM高糖培养液+2%马血清的作用细胞，诱导分化细胞分化为肌管，以研究肌肉分 化机理，对于原代培养的肌卫星细胞，用此种方法进行诱导分化，其分化后获得的肌管数量 少，且无法获得具有收缩功能的肌管。
发明内容
本发明目的是为了解决现有牛肌卫星细胞的分离培养存在成本高，传代稳定性不 好，且诱导分化存在所获肌管数量少及不具有收缩功能的问题，而提供牛肌卫星细胞的体 外分离培养及诱导分化的方法。牛肌卫星细胞的体外分离培养方法按以下步骤实现一、用D-Hanks液清洗牛 肌肉组织并剪成Imm3的小块，然后置于含有0. 25g胰酶的D-Hanks液中，在37°C下消化 30min，再离心弃去上清，然后加入胶原酶液，在37°C下消化2 3h，得细胞悬液；二、采用 400目孔径的筛网过滤细胞悬液，然后离心，所得细胞沉淀用D-Hanks液重悬并离心，再 用细胞生长培养液重悬细胞，然后接种于以多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶中，采用差速贴 壁法培养细胞PPl至PP6 ；三、将pp6中的细胞培养至汇合率为95%，然后采用质量浓度为 0. 25%的胰酶进行传代，即完成牛肌卫星细胞的体外分离培养；其中步骤一中D-Hanks液由8g 的 NaCl、0. 6g 的 Na2HPO4. 2H20、4g 的 KC1、0. 6g 的 KH2P04、3. 5g 的 NaHC03、5g 的青链霉素、 1. Og的两性霉素B和IOOOmL三蒸水组成；步骤一中胶原酶液由0. 2g的胶原酶I、100ml的 DMEM高糖培养液和Ig的青链霉素和Ig的两性霉素B组成；步骤二中细胞生长培养液由 70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBS、IOml的马血清、Ig的青链霉素和Ig的两性霉素B组 成，pH值为7. 2;步骤三中传代的比例为1 1。牛肌卫星细胞的诱导分化方法按以下步骤实现一、采用100 μ 1的DMEM高糖培 养液对4 μ g的pEGFP-IRES-Myf6质粒和8 μ 1的PEI转染试剂分别进行孵育5min，然后混 合并孵育15min，得PEI-质粒复合物；二、取体外分离培养的牛肌卫星细胞并培养至汇合率 为75%，弃掉培养液，用DMEM高糖培养液清洗牛肌卫星细胞两次，然后补加1. 8ml的DMEM高 糖培养液，再将PEI-质粒复合物逐滴滴加到牛肌卫星细胞表面并作用4h，然后更换为细胞 生长培养液A培养24h，再更换为细胞生长培养液B，在温度为37°C并装有5%C02的培养箱中 诱导分化48 72h，即完成牛肌卫星细胞的诱导分化；步骤二中细胞生长培养液A由70ml 的DMEM高糖培养基、20ml的FBSUOml的马血清、Ig的青链霉素和Ig的两性霉素B组成， pH值为7. 2 ；步骤二中细胞生长培养液B由98ml的DMEM高糖培养液、2ml的马血清组成， pH值为7. 2。本发明体外分离培养中采用D-Hanks液配制胰蛋白酶和胶原酶I，可以避免细胞 培养过程中的污染问题，同时此操作获得的细胞悬液非常有利于通过筛网进行快速过滤以 去除未消化的组织块，避免粘稠的细胞消化混合物堵塞筛网；在差速贴壁法培养细胞的过 程中，每一步的转瓶培养之前均进行了离心，能够提高肌卫星细胞的纯度；本发明选用了价 格低廉的胰蛋白酶和胶原酶I，通过延长胶原酶I的消化时间结合400目筛网网孔过滤得 方法从新生胎牛的肌肉组织中分离卫星细胞，采用差速贴壁法对卫星细胞进行纯化，分离 培养的牛肌卫星细胞形态均一，增殖活力强，在分化诱导后具有融合成肌管得能力。本发明 牛肌卫星细胞的体外培养方法不但操作简便，而且大大节省了培养成本，具有一定的经济 意义，且可以获得大量传代稳定性好的细胞。牛肌卫星细胞的体外培养可以为探索肌肉分 化途径的分子机制及改善肌肉性状的转基因动物生产提供丰富的细胞来源，具有一定的理 论和应用价值。本发明牛肌卫星细胞的诱导分化中，操作方法简单，通过将pEGFP-IRES_Myf6质 粒转染入牛肌卫星细胞，同时结合细胞生长培养液B的作用，从而极大的提升了其分化为 肌管的能力，诱导分化的肌管数量众多，数量众多的肌管可自发融合为更粗的肌管，并发生 功能性的收缩，同时证明了肌卫星细胞的干细胞及分化特性，且成功诱导牛肌卫星细胞分 化为功能性肌管的方法，从而为研究肌肉分化机理提供良好的理论支持和技术平台。
图1为具体实施方式
一中所得牛肌卫星细胞放大40倍的显微镜图；图2为具体实 施方式一中所得牛肌卫星细胞放大100倍的显微镜图；图3为具体实施方式
一中所得牛肌 卫星细胞放大200倍的显微镜图；图4为具体实施方式
一中所得牛肌卫星细胞放大400倍 的经Desmin作用的免疫荧光细胞染色图；图5为具体实施方式
一中所得牛肌卫星细胞放大 400倍的经CD34作用的免疫荧光细胞染色图；图6为具体实施方式
一中所得牛肌卫星细胞 放大400倍的经Sca-I作用的免疫荧光细胞染色图；图7为具体实施方式
六中牛肌卫星细
4胞在诱导分化进行24 48h时的放大40倍的显微镜图；图8为具体实施方式
六中牛肌卫 星细胞在诱导分化进行24 48h时的放大200倍的显微镜图；图9为具体实施方式
六中牛 肌卫星细胞在诱导分化进行24 48h时的放大200倍的显微镜图；图10为具体实施方式
六中牛肌卫星细胞在诱导分化进行48h后的放大40倍的显微镜图；图11为具体实施方式
六中牛肌卫星细胞在诱导分化进行48h后的放大40倍的显微镜图；图12为具体实施方式
六中牛肌卫星细胞在诱导分化进行48h后的放大200倍的显微镜图；图13为具体实施方 式六中诱导分化后所得牛肌卫星细胞放大40倍的经Desmin作用的免疫荧光细胞染色图； 图14为具体实施方式
六中诱导分化后所得牛肌卫星细胞放大40倍的经CD34作用的免疫 荧光细胞染色图；图15为具体实施方式
六中诱导分化后所得牛肌卫星细胞放大40倍的经 Sca-I作用的免疫荧光细胞染色图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式牛肌卫星细胞的体外分离培养方法按以下步骤实 现一、用D-HankS液清洗牛肌肉组织并剪成Imm3的小块，然后置于含有0. 25g胰酶的 D-Hanks液中，在37°C下消化30min，再离心弃去上清，然后加入胶原酶液，在37°C下消化 2 3h，得细胞悬液；二、采用400目孔径的筛网过滤细胞悬液，然后离心，所得细胞沉淀用 D-Hanks液重悬并离心，再用细胞生长培养液重悬细胞，然后接种于以多聚赖氨酸包被的 细胞培养瓶中，采用差速贴壁法培养细胞PPl至PP6 ；三、将pp6中的细胞培养至汇合率为 95%，然后采用质量浓度为0. 25%的胰酶进行传代，即完成牛肌卫星细胞的体外分离培养； 其中步骤一中 D-Hanks 液由 8g 的 NaCl、0. 6g 的 Na2HPO4. 2H20、4g 的 KC1、0. 6g 的 KH2P04、3. 5g 的NaHC03、5g的青链霉素、1. Og的两性霉素B和IOOOmL三蒸水组成；步骤一中胶原酶液由 0. 2g的胶原酶I、100ml的DMEM高糖培养液和Ig的青链霉素和Ig的两性霉素B组成；步 骤二中细胞生长培养液由70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBSUOml的马血清、Ig的青链 霉素和Ig的两性霉素B组成，pH值为7. 2;步骤三中传代的比例为1 1。本实施方式中FBS和DMEM高糖培养液购买自Gibco公司；多聚赖氨酸和胶原酶I 购买自Sigma公司。本实施方式步骤一中牛肌肉组织来源于健康的新生胎牛的骨骼肌组织。本实施方式步骤一中消化的目的是使结缔组织充分消化。本实施方式步骤一中胶原酶液的作用是去除细胞间的胶原蛋白成分，使细胞分散 为单个细胞。本实施方式步骤二中筛网过滤细胞悬液的目的是去除未消化的组织块。本实施方式步骤二中差速贴壁法培养细胞ppl至pp6的培养的过程中，每一次转 瓶之前均以lOOOr/min离心5min并收集细胞，然后采用D-Hanks液对细胞沉淀进行清洗， 再以lOOOr/min离心5min后用细胞生长培养液重悬细胞并接种；上述这种反复清洗可以避 免细胞污染，同时提高肌卫星细胞的纯度。本实施方式步骤二中采用差速贴壁法培养细胞的目的是纯化肌卫星细胞，排除其 他细胞对肌卫星细胞生长的影响；过程为接种于以多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶中的细胞培养2h，贴壁细胞为ppl ；未贴壁细胞悬液转瓶培养24h，贴壁的细胞为pp2 ；未贴壁细胞 悬液再转瓶培养24h，贴壁的细胞为pp3 ；未贴壁细胞悬液转瓶培养24h，贴壁的细胞为pp4 ； 未贴壁细胞悬液转瓶培养24h，贴壁细胞为pp5 ；未贴壁细胞悬液转瓶培养24h，贴壁细胞为 pp60本实施方式可获得高纯度(纯度达96 99%)、可持续传代且稳定性好的牛肌卫星 细胞。本实施方式中体外分离培养所得牛肌卫星细胞，通过相差显微镜观察，由图1、图 2和图3中，可知，牛肌卫星细胞在pp6转瓶培养后约48h后呈贴壁生长，绝大多数细胞为梭 形，少数有突起，为不规则状，细胞间的连接紧密；本实施方式中体外分离培养的牛肌卫星 细胞形态完整，折光率好，且保持较强的增殖活力，24h即可传代1次。本实施方式中体外分离培养所得牛肌卫星细胞在细胞生长培养液中能够保持较 好的增殖活力。本实施方式中体外分离培养所得牛肌卫星细胞，应用免疫荧光细胞染色法进行检 测取普通洁净的盖玻片，接种细胞，制作肌卫星细胞爬片；待细胞长成80%汇合单层时， 倒掉培养液，用预冷的D-Hanks液冲洗细胞两次；用冰浴的Iml甲醇于4°C固定IOmin ；用 TBSTx冲洗细胞3次，每次5min ；用含5%BSA的TBSTx封闭60min，可以用摇床轻轻摇动；去 封闭液，用含5%BSA的TBSTx稀释的特定一抗(分别为Desmin、CD34、Sca-l)作用60min ；去 除一抗，用TBSTx冲洗细胞3次，每次5min ；用含5%BSA的TBSTx稀释的特定二抗(FITC标 记，可与特异性的一抗结合)作用60min ；去除二抗，用TBSTx冲洗细胞3次，每次5min ；滴加 DAPI (细胞核荧光染料)，染色5min后，用TBSTx冲洗细胞3次，每次5min ；采用抗荧光淬灭 剂DABCO (防荧光淬灭封片剂)封片，于激光扫描共聚焦显微镜下分别观察细胞中Desmin、 ⑶34、Sca-I的特异性表达情况；
结果如图4、图5和图6所示，Desmin呈阳性表明此细胞为肌肉来源的细胞，而⑶34和 Sca-I呈阳性表达表明此细胞为具有干细胞性质的卫星细胞，证明本实施方式中体外分离 培养所得牛肌卫星细胞为具有干细胞特性的肌卫星细胞。本实施方式中Desmin (结蛋白)一抗、⑶34 —抗、Sca-I 一抗购买自博奥森公司； 特定二抗购买自中杉金桥公司；DAPI购买自碧云天公司；DABCO购买自Sigma公司。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一和二中离心均是 以lOOOr/min的转速离心5min。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中加入胶原酶 液，在37°C下消化2h，得细胞悬液。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中加入胶原酶 液，在37°C下消化3h，得细胞悬液。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中加入胶原酶 液，在37°C下消化2.5h，得细胞悬液。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式牛肌卫星细胞的诱导分化方法按以下步骤实现 一、采用100 μ 1的DMEM高糖培养液对4 μ g的pEGFP-IRES_Myf6质粒和8 μ 1的PEI转染 试剂分别进行孵育5min，然后混合并孵育15min，得PEI-质粒复合物；二、取体外分离培养 的牛肌卫星细胞并培养至汇合率为75%，弃掉培养液，用DMEM高糖培养液清洗牛肌卫星细胞两次，然后补加1. 8ml的DMEM高糖培养液，再将PEI-质粒复合物逐滴滴加到牛肌卫星细胞表面并作用4h，然后更换为细胞生长培养液A培养24h，再更换为细胞生长培养液B，在温 度为37°C并装有5%C02的培养箱中诱导分化48 72h，即完成牛肌卫星细胞的诱导分化；步 骤二中细胞生长培养液A由70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBSUOml的马血清、Ig的青 链霉素和Ig的两性霉素B组成，pH值为7. 2 ；步骤二中细胞生长培养液B由98ml的DMEM 高糖培养液、2ml的马血清组成，pH值为7. 2。本实施方式中pEGFP-IRES_Myf6质粒为购买得到；PEI转染试剂购买自Sigma公司。本实施方式步骤二滴加过程中要轻晃细胞培养板。本实施方式中牛肌卫星细胞在诱导分化进行24 48h时，由图7、图8和图9可观 察到相邻的卫星细胞可以自发融合形成肌管，表明具体实施方式
一中体外分离培养所得牛 肌卫星细胞具有分化为肌细胞的潜能。本实施方式中牛肌卫星细胞在诱导分化进行48h后，由图10、图11和图12可观察 到相邻的卫星细胞可以自发融合形成大量的肌管，数量众多的肌管可自发融合为更粗的肌 管；诱导分化进行至72h，融合率达到顶峰，之后融合率变化不明显；其肌管形态区别于仅 用DMEM高糖培养液+2%马血清诱导分化形成的肌管，且在肌管形成数量上具有明显优势。本实施方式中诱导分化后所得牛肌卫星细胞，应用免疫荧光细胞染色法进行检 测由图13、图14和图15中可见，诱导分化后的肌管其Desmin、⑶34和Sca-I呈阳性表达， 保持了其由干细胞分化而来的特性；且分化后的肌管可发生功能性收缩；本实施方式中通 过对体外分离培养的牛肌卫星细胞进行Myf6基因的转染，证明了牛肌卫星细胞的干细胞 及分化特性，且得到了成功诱导牛肌卫星细胞分化为功能性肌管的方法，从而为研究肌肉 分化机理提供良好的理论支持和技术平台。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中在温度为 37°C并装有5%C02的培养箱中诱导分化48h。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中在温度为 37°C并装有5%C02的培养箱中诱导分化72h。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中在温度为 37°C并装有5%C02的培养箱中诱导分化50 70h。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中在温度为 37°C并装有5%C02的培养箱中诱导分化60h。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
权利要求
牛肌卫星细胞的体外分离培养方法，其特征在于牛肌卫星细胞的体外分离培养方法按以下步骤实现一、用D-Hanks液清洗牛肌肉组织并剪成1mm3的小块，然后置于含有0.25g胰酶的D-Hanks液中，在37℃下消化30min，再离心弃去上清，然后加入胶原酶液，在37℃下消化2～3h，得细胞悬液；二、采用400目孔径的筛网过滤细胞悬液，然后离心，所得细胞沉淀用D-Hanks液重悬并离心，再用细胞生长培养液重悬细胞，然后接种于以多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶中，采用差速贴壁法培养细胞ppl至pp6；三、将pp6中的细胞培养至汇合率为95%，然后采用质量浓度为0.25%的胰酶进行传代，即完成牛肌卫星细胞的体外分离培养；其中步骤一中D-Hanks液由8g的NaCl、0.6g的Na2HPO4.2H2O、4g的KCl、0.6g的KH2PO4、3.5g的NaHCO3、5g的青链霉素、1.0g的两性霉素B和1000mL三蒸水组成；步骤一中胶原酶液由0.2g的胶原酶Ⅰ、100ml的DMEM高糖培养液和1g的青链霉素和1g的两性霉素B组成；步骤二中细胞生长培养液由70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBS、10ml的马血清、1g的青链霉素和1g的两性霉素B组成，pH值为7.2；步骤三中传代的比例为1∶1。
2.根据权利要求1所述的牛肌卫星细胞的体外分离培养方法，其特征在于步骤一中加 入胶原酶液，在37°C下消化2. 5h，得细胞悬液。
3.诱导分化权利要求1所述方法培养的牛肌卫星细胞，其特征在于牛肌卫星细 胞的诱导分化方法按以下步骤实现一、采用ΙΟΟμΙ的DMEM高糖培养液对4yg的 pEGFP-IRES-Myf6质粒和8 μ 1的PEI转染试剂分别进行孵育5min，然后混合并孵育15min， 得PEI-质粒复合物；二、取体外分离培养的牛肌卫星细胞并培养至汇合率为75%，弃掉培养 液，用DMEM高糖培养液清洗牛肌卫星细胞两次，然后补加1. 8ml的DMEM高糖培养液，再将 PEI-质粒复合物逐滴滴加到牛肌卫星细胞表面并作用4h，然后更换为细胞生长培养液A培 养24h，再更换为细胞生长培养液B，在温度为37°C并装有5%C02的培养箱中诱导分化48 72h，即完成牛肌卫星细胞的诱导分化；步骤二中细胞生长培养液A由70ml的DMEM高糖培 养基、20ml的FBSUOml的马血清、Ig的青链霉素和Ig的两性霉素B组成，pH值为7. 2 ；步 骤二中细胞生长培养液B由98ml的DMEM高糖培养液、2ml的马血清组成，pH值为7. 2。
4.根据权利要求3所述的牛肌卫星细胞的诱导分化方法，其特征在于在温度为37°C并 装有5%C02的培养箱中诱导分化50 70h。
5.根据权利要求3所述的牛肌卫星细胞的诱导分化方法，其特征在于在温度为37°C并 装有5%C02的培养箱中诱导分化60h。
全文摘要
牛肌卫星细胞的体外分离培养及诱导分化的方法，它涉及细胞的体外分离培养及诱导分化的方法。它解决了现有牛肌卫星细胞的分离培养存在成本高，传代稳定性不好，且诱导分化存在所获肌管数量少及不具有收缩功能的问题。方法清洗组织，用胰蛋白酶和胶原酶液消化；过滤后离心，重悬细胞，接种后用差速贴壁法培养细胞；培养至汇合率为95%，用胰酶进行传代即完成。方法获得PEI-质粒复合物；牛肌卫星细胞培养至汇合率为75%，清洗后加DMEM高糖培养液，将PEI-质粒复合物加到细胞表面，更换培养液A培养，再更换培养B诱导分化即完成。本发明牛肌卫星细胞的分离培养成本低，传代稳定性好，诱导分化所获肌管数量大且具有收缩功能。
文档编号C12N5/10GK101886060SQ20101023136
公开日2010年11月17日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者严云勤, 佟慧丽, 兴孝友, 李光鹏, 李树峰, 金慧然, 陆黎敏, 高学军 申请人:东北农业大学