专利名称：一种炭疽菌菌株及含有其孢子的生物除草试剂的制作方法
技术领域：
本发明为一种炭疽菌属真菌及其用于生物除草的方法，属于微生物用于农业植物 保护、防除农作物杂草的技术领域，专用于农田杂草的防除。
背景技术：
随着人们对化学除草残留、环境污染以及耐药和抗药性杂草发展的认识、绿色食 品和有机农业的大力推广，研制生物除草剂防除杂草已成为生产上的迫切需求，它具有投 资少、研制周期短、专一性强、对环境安全、不产生污染等优点。目前，商业化的生物除草剂 品种有80年代初研制出的DeVine和Collego以及90年代末推出的Comperico和Biochon。 这些除草剂在控制相对的目标杂草上起到了重要作用，如DeVine的持效性可以保证使用 一次，2-3年无须再除草。有希望商业化的生物除草剂项目有数十项，其中防除稗草、野荸荠 等杂草的生物除草剂品种具有十分诱人的前景。单子叶杂草马唐(Diditaria sanguinaris)是世界上公认的18种恶性杂草之一， 广泛分布于世界热带和温带地区，是玉米、高粱、大豆、花生等秋熟旱作物田的恶性杂草，对 棉花、烟草、麻类、甘 等幼苗生长危害也十分严重，同时也是蔬菜田、果园、草坪和园艺作 物田的优势杂草。在中国，马唐的危害面积大约在6千万公顷左右，由其引起的作物损失 占秋熟旱作物田杂草总损失的一半以上。该杂草繁殖能力强，生长速度快，生长期长，消耗 地力、遮光、耐药性强，人工、机械防除比较困难。目前，化学防除虽然有效，但是，化学除草 剂的长期使用引起抗性杂草的产生和严重的环境污染，导致土地退化。因此研制生物除草 剂防除马唐不仅可以有效防除该杂草，而且对环境安全性高。目前，关于马唐真菌除草剂 的研究，美国已申请了利用弯孢霉属(Curvularia intermedia Boedijn)菌株(国际真菌 学会收藏，保藏号为 361688 (MT-5)，361689 (CG-L)，375263 (MT-6)，375264 (MT-7))生物控 制马唐的专利，专利号为US 5，635，444和UA 5，952，264。但该专利文献在提出其使用技 术与生产方法时，仅明确对大豆、棉花比较安全，而对玉米和水稻等单子叶作物的安全性及 其使用并未提及。此外，国内南京农业大学已申请了利用双曲孢霉(Nakataea Hara)菌株 QZ-2000 (保藏号=CGMCC NO. 0640)生物控制马唐的专利(ZL专利号01134002. 9)，但其单 菌株防效不理想，需由几个单株的孢子按比例混合后喷施才能达到较好的防除效果，这就 增加了生产的难度。同时，真菌除草剂的一个重要特点就是它对环境条件的要求较为苛刻， 只有当在能充分满足该菌剂对水分和温度的要求条件下，才能保证该菌株对杂草的有效侵 染，才能取得良好的防除效果，而对异地生态条件不一定能适应，易具有一定的地域性，因 此，为解决这一难题只有选择对寄主侵染时所要求的环境条件较宽，易能满足的寄生真菌 菌株，才具有较宽广的推广应用前景。
发明内容
本发明目的是针对棉花、玉米、大豆、花生等作物田恶性杂草——马唐，筛选获得 的炭疽菌菌株，用于生物除草，能安全有效的控制和防止恶性杂草马唐，对农作物安全，尤其是对单子叶作物安全，应用适应性广，无污染。本发明提供一种保藏号为CGMCC No. 2867的炭疽菌菌株。炭疽菌菌株Cds0501 的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址北京市朝阳区北辰 西路1号院中科院微生物研究所；保藏日2009年1月12日；保藏号CGMCC No. 2867， 分类学命名炭疽菌(Colletotrichum sp.))。属半知菌类(Fungi Imperfecti)，腔孢纲 (Coelomycetes)，黑盘抱目(Melanconiales)，炭疽菌属(Colletotrichum Corda)。将CGMCC No. 2867的菌株在PDA平板上紧贴平板表面生长，菌落初呈白色，后 转为灰白或灰色。分生孢子单细胞，镰刀形，培养物后期形成黑褐色菌核，生有褐色刚 毛。孢子在PE膜上可生成椭圆或棍棒状附着胞，边缘光滑或有裂瓣，有黑色素沉积。从 发病部位刮取的小黑点，经显微镜观察为分生孢子器，周围生有褐色刚毛，具2-3个分隔， 52. 41-112. 75 X 3. 08-7. IOym ；分生孢子单细胞，12. 24-31. 82 X 3. 07-5. 96 μ m, 一端略尖， 无色，呈镰刀形，直或弯曲，含1至多个油球。本发明还提供一种将上述炭疽菌菌株用于单子叶作物中马马唐的生物除草的方 法，该方法包括利用保藏号为CGMCC No. 2867的炭疽菌菌株的分生孢子为每毫升IO5至 109，或者用该菌的分生孢子与1/5至1/20常规用量的化学除草剂配合使用。上述化学除 草剂主要指阿特拉津、丁草胺、精禾草克、百草枯等。发明人在对马唐的生物防治研究过程中发现了田间马唐的自然发病现象，故对 其寄生真菌进行筛选研究。首先分离获得了炭疽菌菌株，其编号为Cds0501(保藏号码为 CGMCC No. 2867)，研究发现其专化性强，对作物和其他绝大多数植物安全，但对马唐有很强 的感染致病率，两周后马唐的死亡率达到70%左右，感病率达到100%。菌株的培养条件、 大批量生产方法均已进行了详细的研究；该菌的感染致病条件也进行了专门的研究工作。 显示出该菌有较大的潜力开发成商品化生物除草剂。可用于棉花、玉米、大豆、花生、西瓜等 作物田控制马唐。目前，国内外鲜有用炭疽菌属真菌防除马唐的报道，这方面的研究对解决该草的 防除将提供一个新的优良的途径。本发明采集到的马唐罹病植株叶片和茎干上有褐色小 点、椭圆形或梭形大病斑，病斑最大可达6. 5-8X22-24mm，周围有黄色晕圈，外缘褐色，中部 凹陷呈灰色或缺刻，有些在病部形成轮纹状排列小黑点。叶鞘基部病斑扩展后常连接愈合 导致植株易折断倒伏。在显微镜下观察，病叶可见大小不一的分生孢子子座密布表面，子座 上密生黑褐色的刚毛，还发现弯镰形的分生孢子。经分离得到一炭疽菌，其培养特征与致病 特征如下PDA平板上紧贴平板表面生长，菌落初呈白色，后转为灰白或灰色。分生孢子单细 胞，镰刀形，和原植物发病组织上的特征一致。培养物后期形成黑褐色菌核，生有褐色刚毛。 孢子在PE膜上可生成椭圆或棍棒状附着胞，边缘光滑或有裂瓣，有黑色素沉积。以分离的 纯培养物的分生孢子悬浮液喷雾接种3-4叶期马唐植株。接种后3d，在叶片、叶鞘等部位 开始出现明显的水渍状斑点；之后斑点逐渐扩大，至第7d叶片上多个病斑相互粘连；至第 12d，大量叶片干枯。切取病斑组织经重新分离、培养，所得分离物于原接种的病原物形态特 征一致。从而完成了 Koch’ s法则的验证，确定所得的分离物为导致马唐病害的病原物。按其特征鉴定为半知菌类(Fungi Imperfecti)，腔孢纲(Coelomycetes)，黑盘孢 目(Melanconiales)，炭疽菌属(Colletotrichum Corda)。致病真菌的分离、筛选与鉴定
4从浙江新昌采集到罹病马唐叶片，剪取病健交界处叶片，用6%次氯酸钠溶液进行表面消 毒，然后置于PSA培养基上，在25°C恒温箱中培养，一周后进行单菌分离纯化，进而，进行单 菌株产孢子量、防除马唐等单子叶杂草效果试验，从中筛选出高产高效菌株Cds0501，并在 PSA培养基上观察该病原菌的显微形态和形态特征。另外，本发明还提供一种生物除草剂，包括以编号为CGMCC No. 2867的炭疽菌 (Colletotrichum Corda)菌株的产孢菌种。在一个方式中，该生物除草剂还包括化学除草 剂或辅助试剂。在一个优选的方式中，该除草剂的组分与各组分的重量百分比含量为编号为Cds0501的炭疽菌纯孢子 80-95%化学除草剂0-18%辅助剂2-5%。其中，所述的化学除草剂为阿特拉津、丁草胺、精禾草克、百草枯中的一种或几种。所述的辅助剂为吐温20、吐温80、葡聚糖、植物油、纤维素、聚醚硅油等中的种或 几种。该生物除草剂的制备方法，按以下步骤进行(1)培养基的准备菌株Cds0501可用PDA固体培养基、麸皮液体培养基活化并诱 导分生孢子的产生；(2)菌株Cds0501的活化培养挑取少许保存的该菌菌丝块PDA平板培养基中， 28°C恒温暗培养，活化菌株；(3)菌株种子液的培养挑取少许步骤(2)培养的菌块，接入麸皮液体培养基的 三角瓶中，28°C，150rpm，振荡培养3-4天至产生丰富分生孢子；(4)菌种孢子的生产培养与收集在无菌条件下，吸取步骤(3)中液体培养的分生 孢子接种于IL麸皮液体培养基的三角瓶中，置于28°C，150rpm振荡培养3_4天，用双层纱 布过滤除去菌丝体，孢子悬浮液经7000rpm离心10分钟，收集沉淀，干燥备用；(5)将按配方秤取的纯孢子、化学除草剂和辅助剂，混合成生物除草剂，分装，密 封，即成产品。将上述炭疽菌株Cds0501除草剂用于防除杂草的方法为可用浓度为3_50g/L的炭疽菌菌株Cds0501的纯分生孢子水悬浮液对杂草进行叶 面喷施或种子处理；或将该菌的分生孢子加以各类辅助剂配成水悬浮液使用；或分生孢子 与辅助剂的混合物与5-20%常规用量的化学除草剂混合水悬浮液使用；或者与其他杂草 上分离得到的致病性菌株联合使用，其配合使用方法都是本领域技术人员所掌握的常规技 术。本发明与现有技术相比，其有益效果如下1、菌株Cds0501对小麦、大豆、棉花、豇豆、向日葵、玉米、花生、水稻等作物的小苗
都安全，对狗尾草、稗草、牛筋草等杂草有部分感染，而对马唐是严重感染，二周后的控制效 果在70%左右，该菌的寄主范围相对专一，对农业生产是安全的(见表2)；故采用本发明 马唐炭疽菌菌剂不仅可用于防除大豆、棉花、花生等双子叶作物田块杂草，也可用于防除水 稻、玉米和麦子等单子叶作物田块杂草，这明显优于几乎不能在单子叶作物与单子叶杂草 间进行选择的常规防除单子叶杂草的化学除草剂，因此，也就优于现有技术中的美国专 利。
2、与相关辅助剂配合使用，该菌剂对目标杂草马唐的控制效果可以达到 85% -100%，特别是3叶龄以下的植株。3、本发明筛选获得的菌株Cds0501，作为制备菌剂的生产用种，其对培养条件适应 性广，在15-35°C，pH5-12均可生长和产孢，培养基原料易得，成本低廉，利用常用的农业基 础产品即可进行大批量生产，孢子产量高(5. OX IO6个孢子/mL液体培养基)；而作为防除 杂草的感病菌剂，其在田间致病条件较宽，10-40°C孢子均可萌发，失活温度为53°C，容易感 染防除对象，研究显示该菌有较大的潜力开发成商品化生物除草剂，可用于大多数作物田 控制杂草马唐。因此，本发明利用炭疽菌菌株Cds0501发展生物除草剂控制马唐，该菌株对主要 农作物安全性高，不感染禾本科作物和阔叶植物，应用范围广，因而该生物除草剂具有极为 显著的经济和社会效益。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明，但这并不对本发明构成任何意义 上的限定。实施例1 防除马唐高效菌株Cds0501的筛选从自然发生于浙江新昌地区的野外马唐病害植株上，采集马唐的病叶，用PDA培 养基进行病原真菌的分离培养，从中分离出数种真菌菌株，并对它们的致病性进行了如下 试验；在显微镜下挑取各菌株的单孢子，分别接种在PDA培养基上，于黑暗、28°C下培养，观 察病原真菌纯培养的菌落特征；另取直径6mm的各菌落圆片接种在PDA平板中央，分别于7 天后测量各菌落直径；将各菌株配制成浓度为1 X IO6个/mL的孢子悬浮液喷施2叶1心 马唐植株上，处理4天后，观察各菌株的致病特性(见表1)，从中选择出发病死亡率强、对作 物安全的弯孢霉属菌株Mds0404、炭疽菌菌株Cds0501，保存；马唐罹病植株叶片病斑初为 圆点状，后扩大为大小不等的扁椭圆形或梭形病斑，病斑最大可达6. 5-8 X 22-24mm,周围有 黄色晕圈，外缘褐色，中部凹陷呈灰色或缺刻，有些在病部形成轮纹状排列小黑点。叶鞘基 部病斑扩展后常连接愈合导致植株易折断倒伏。表1马唐病原真菌菌落特征及其对马唐致病率的比较 实施例2 菌株Mds0404寄主范围的测定经寄主范围测定明确，菌株Cds0501对棉花、向日葵、大豆、豇豆、花生、玉米、小麦
6及水稻等作物安全；稗草、牛筋草及狗尾草有感染，而马唐为严重感染(见表2)，一周后的 控制效果在65%左右。表2马唐炭疽菌菌株Cds0501的寄主范围测定 注NS表示没反应；LS表示有感染；HS表示严重感染实施例3 本发明一种生物除草剂及其制备方法1按配方称取菌株Cds0501纯孢子83克、阿特拉津15克、吐温2克，混合成生物除 草剂100克。该剂的制备方法按以下步骤进行(1)培养基的准备菌株Cds0501可用以下任一种培养基活化并诱导分生孢子的
产生PDA培养基马铃薯150g，葡萄糖10g，琼脂18g，水IL ；PSA培养基马铃薯150g，蔗糖10g，琼脂18g，水IL ；麸皮培养基麸皮50g，琼脂18g，水IL ；玉米粉培养基玉米粉50g，琼脂18g，水IL ；淀粉酵母培养基淀粉10g，酵母粉2g，琼脂ISgjjC IL ；Czapek 培养基=KNO3 2g ；K2HPO4 Ig ；KCl 0. 5g ；MgSO4. 7H20 0. 5g ；FeSO4 0. Olg ；蔗 糖30g ；琼脂18g ；水IL0(2)菌株Cds0501的活化培养挑取少许保存的该菌菌丝块至步骤(I)PDA平皿培 养基中，28°C恒温暗培养，活化菌株；(3)菌株种子液的培养挑取少许步骤(2)培养的菌块，接入盛有步骤(I)PD培养 液(PDA培养基不加琼脂即成)的三角瓶中，28°C，150rpm，振荡培养3_5天至菌液产生丰
7富菌丝球，待用；(4)菌种孢子的生产培养与收集采用液体培养的方法；在无菌条件下，将 Cds0501菌株种子液用四层擦镜纸过滤，调节孢子悬浮液的浓度为1乂106个/!^，用移液 枪吸取1 μ L上述孢子悬浮液，移入装有600mL麸皮液体培养基的IL容量三角瓶中，28°C、 160rpm黑暗振荡培养3-4d，用纱布过滤除去菌丝体，7000rpm离心收集沉淀即可得孢子，干 燥后保存备用；(5)将按配方称取的纯孢子、阿特拉津、吐温，混合成生物除草剂，分装，密封，即成产品。实施例4 本发明生物除草剂及其制备方法2按配方称取菌株Cds0501纯孢子95克、植物油5克，混合成生物除草剂100克；该 剂的制备方法同于实施例3。实施例5 本发明生物除草剂及其制备方法3按配方称取菌株Cds0501纯孢子90克、丁草胺7克、聚醚硅油3克，混合成生物除 草剂100克；该剂的制备方法同于实施例3。实施例6 纯孢子防除马唐草效果试验将菌株Cds0501在麸皮液体培养基，280C、160rpm振荡培养3_4天后，通过纱布过 滤除去菌丝体，收集滤液并镜检孢子浓度(1 X IO6个/ml)，用手持喷雾器喷施滤液，接种到 1叶1心至3叶1心期的马唐上，保湿48小时，处理10天后，对该草的控制效果达到90% 以上。这种孢子接种在马唐上的致病症状为在叶片、叶鞘等部位初现明显的水渍状斑点， 之后斑点逐渐扩大，叶片上多个病斑相互粘连，大量叶片干枯。经观察，病叶表面的孢子与 所喷施的炭疽菌Cds0501孢子一样。以上实验条件下的发病症状与自然病症相似。实施例7 孢子+辅助剂+5-20%常规用量的化学除草剂除马唐草效果试验按实施例3或5方法，先配制出添加有辅助剂的孢子悬浮液，再添加常规用量 5-20%的阿特拉津、丁草胺、精禾草克、百草枯等，均勻喷施在2. 5-3. 5叶龄期的马唐上，分 别保湿12小时和不保湿两组处理；处理后10天，保湿一组的马唐被控制100%，未保湿一 组的马唐被控制70-90%。
权利要求
一种生物除草剂，其特征在于，包括保藏号为CGMCC No.2867的炭疽菌(Colletotrichum Corda)菌株产生的孢子。
2.如权利要求1所述的生物除草剂，其特征在于，该除草剂还包括化学除草剂或辅助 试齐LU
3.如权利要求2所述的生物除草剂，其特征在于，该除草剂的组分与各组分的重量百 分比含量为保藏号为CGMCC No. 2867的炭疽菌纯孢子 80-95% ；化学除草剂0-18%辅助剂2-5%。
4.如权利要求3所述的生物除草剂，其特征在于，其中，所述的化学除草剂为阿特拉 津、丁草胺、精禾草克、百草枯中的一种或几种；所述的辅助剂为吐温20、吐温80、葡聚糖、 植物油、纤维素、聚醚硅油等中的一种或几种。
5.一种制备权利要求1所述生物除草剂的方法，其特征在于，包括(1)培养基的准备保藏号为CGMCCNo. 2867菌株可用PDA固体培养基、麸皮液体培养 基活化并诱导分生孢子的产生；(2)菌株的活化培养挑取少许保存的该菌菌丝块PDA平板培养基中，28°C恒温暗培 养，活化菌株；(3)菌株种子液的培养挑取少许步骤(2)培养的菌块，接入麸皮液体培养基的三角瓶 中，28°C，150rpm，振荡培养3_4天至产生丰富分生孢子；(4)菌种孢子的生产培养与收集在无菌条件下，吸取步骤(3)中液体培养的分生孢子 接种于IL麸皮液体培养基的三角瓶中，置于28°C，150rpm振荡培养3_4天，用双层纱布过 滤除去菌丝体，孢子悬浮液经7000rpm离心10分钟，收集沉淀，干燥获得纯孢子。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法所使用的菌株来自本马唐罹病植株 叶片和茎干上有褐色小点、椭圆形或梭形大病斑，周围有黄色晕圈，外缘褐色，中部凹陷呈 灰色或缺刻。
7.一种使用权利要求1所述试剂生物除草的方法，其特征在于将保藏号为CGMCC No. 2867的炭疽菌(Colletotrichum Corda)菌株在麸皮液体培养基，28°C、160rpm振荡培 养3-4天后，通过纱布过滤除去菌丝体，收集滤液并镜检孢子浓度，让其孢子浓度为1 X IO6 个/ml，用手持喷雾器喷施滤液，接种到1叶1心至3叶1心期的马唐上，保湿48小时。
全文摘要
本发明提供一种包括保藏号为CGMCC No.2867的炭疽菌(Colletotrichum Corda)菌株产生的孢子的生物除草剂，以及如何获得该除草试剂的方法和如何使用该试剂进行作物中杂草的去除。特别的，提供一种除去作物中马唐的生物除草剂，包括保藏号为CGMCC No.2867的炭疽菌菌株产生的孢子。利用该生物除草剂不仅可以防治双子叶植物中的杂草，还可以防治单子叶植物中的杂草；特别的，该菌剂对目标杂草马唐的控制效果可以达到85％-100％，特别是3叶龄以下的植株。
文档编号C12N1/14GK101919412SQ20101023163
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者姜华, 孙国昌, 张震, 杜新法, 柴荣耀, 毛学琴, 王教瑜, 王艳丽, 邱海萍 申请人:浙江省农业科学院