专利名称：一种在真菌中表达鉴定外源基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种植物转基因育种方法，具体涉及一种利用CaMV 35S启动子在真 菌中表达外源基因，快速鉴定基因功能的方法。
背景技术：
在现有技术的植物转基因育种方法中，待转入的外源基因通常需要首先在真核生 物中进行表达和功能验证，再导入目标植物中。目前常用的方法是通过转化模式植物，如 烟草或拟南芥，检测其表达情况及初步功能，再将该基因转到目标植物中。这个过程鉴定周 期较长，一般需要6-8个月才能完成，并且费时、费力。真菌是最简单的真核生物。与转化植物相比，真菌的遗传转化省去了播种、收获、 组织培养等繁琐的操作过程，并且周期短，操作简便易行。因此，如果能够在真菌中实现外 源基因的表达和功能初步鉴定，将大大缩短转基因育种进程。用作真菌转化的方法很多，但 目前公认的方法是通过农杆菌介导(侵染)的转化。实现转化过程已经是成熟的技术，通 过农杆菌转化真菌和转化植物的原理基本相同。目前，用于高等植物遗传转化的表达载体，其标记基因和功能基因所使用的启动 子均为CaMV35S启动子。CaMV35S是来自花椰菜病毒的一种强启动子，可以被植物识别，被 广泛应用于植物转基因育种中。但是，遗憾的是，多数真菌对其无法识别，如果将植物表达 载体转入真菌，则会导致其所带有的抗性标记基因和功能基因无法在真菌中表达。所以，当 科学家从原核生物(如细菌)中获得一个有用的基因后，必需先在拟南芥这样的模式植物 中去做初步表达和功能鉴定，然后再转入需要的植物中，因为拟南芥的遗传转化非常容易、 方便(植物转化比较难，主要难在组织培养成苗过程)，然而，就是这个目前被认为最方便 快捷的过程也需要半年以上。因此，在真核生物中建立一个更加快速、简便易行的外源基因 表达鉴定方法很有必要。有人发现，尖孢镰刀菌可以识别CaMV35S启动子，现有技术中，尚未见有人将其用 于在真菌中对外源基因的表达和功能鉴定。
发明内容
本发明的最终目的是建立一种能够快速、省时、省力地在真菌中对来自原核生物 的新的功能基因进行表达和功能鉴定的方法。本发明的直接目的是利用农杆菌介导和CAMV35S启动子表达外源基因和进行功 能初步鉴定。为了解决绝大部分真菌不识别植物表达载体所用的CAMV35S启动子的问题，本发 明人对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)可以识别CaMV35S启动子进行了研究。利用了 这个特点，本发明实现了在真菌中快速对外源基因进行表达鉴定的目的。尖孢镰刀菌属于半知菌亚门、镰刀菌属。有人发现，尖孢镰刀菌可以识别CAMV35S 启动子。本发明实验证明，常用的植物表达载体PCAMBIA1300可以直接转化尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)获得具有潮霉素抗性的突变体，表明尖刀镰孢菌的确可以识别植物 表达载体潮霉素磷酸转移酶基因带有的CaMV35S启动子。这是迄今为止报道的唯一一个可 以识别CaMV35S启动子的丝状真菌，这一发现使目前适用于植物转化的双元载体不需要任 何修改就可以用来转化真菌。本发明方法的技术手段是利用CaMV35S启动子在真菌中进行基因表达和鉴定的方法，其操作步骤如下1、将目的基因克隆至带有CaMV35S启动子的植物表达载体上；2、将步骤1所得的载体转化导入农杆菌中；3、用步骤2所得到的农杆菌侵染尖孢镰刀菌，筛选获得阳性转化子；4、对步骤3所述阳性转化子中含有的目的基因进行表达和初步功能鉴定。上述步骤1中，所述植物表达载体可以是本领域常用的植物表达载体，如pBI121 或pCAMBIA系列等；步骤3中，可以选用潮霉素抗性为筛选标记。在运用本方法的一个实例中，发明人构建了高抗草甘膦的EPSP合酶基因植物表 达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法，转化尖孢镰刀菌EPSPs基因敲除的突变体，可以 使其恢复对草甘膦的耐受性。发明人从原核生物中获得了一个新型高抗草甘膦的EPSP合 酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)基因，采用本发明提供的方法快速对该基因在真 核生物中进行了表达和功能快速鉴定。主要操作步骤如下1、将EPSP合酶基因的开放阅读框序列5'端连接CAMV35S启动子，3'端连接nos 终止子；2、将连接好的完整的EPSP合酶基因克隆至PCAMBIA1300的多克隆位点(图1)；3、得到的重组质粒(表达载体)转化导入农杆菌AGL-I中；4、用含有重组质粒的农杆菌侵染尖孢镰刀菌草甘膦抗性缺失的突变体菌株，用潮 霉素抗性标记筛选阳性转化子，并获得单孢培养(图2)；5、提取转化子的基因组DNA，在潮霉素磷酸转移酶基因内部设计引物，采用PCR方 法对阳性转化子进行分子验证(图3)；6、提取转化子的总RNA，反转录进行基因表达鉴定；7、在含有草甘膦的基本培养基平板上，进行目的基因的功能鉴定；8、综合分析评估EPSP合酶基因的表达和功能情况。具体操作过程和结果详见实施例。本发明主要的创新点是选用了尖孢镰刀菌。因为一般的真菌不识别CAMV35S启动 子，所以常用的转植物的表达载体不能用做真菌转化，无法用作重要功能基因的表达和功 能鉴定。而本发明利用尖孢镰刀菌可以识别CAMV35S启动子的特点，将植物重要功能基因 转移的表达鉴定过程，从常用的转模式植物拟南芥变成通过转化真菌进行鉴定。由于真菌 和拟南芥都是真核生物，所以在真菌里的鉴定结果可以代表在拟南芥中的鉴定结果，这种 改变或方法创新，简便、快速，缩短了植物转基因育种的进程。本发明的主要优点1、技术操作简单、省力
省去了在温室种苗、种子收获、纯合子筛选、或组织培养成苗(烟草)等繁琐的步 骤，在实验室内就可以完成。2、周期短、快速、省时一般在植物表达载体构建完成后，14天内可以得到阳性转化子，18天内可以得到 经过分子验证的转化子纯培养菌株，包括农杆菌转化2天、需转化的镰刀菌培养2-3天、共 培养2天、转化子筛选4天、获得单菌落4天和分子验证4天(详见实施例1)；在获得经过 分子验证的单菌落后，7天内可以完成基因的表达和功能初步鉴定，包括摇菌培养及RNA提 取、反转录及表达鉴定(为节约时间，可与分子验证同时进行菌株培养)。基因功能鉴定一 般在6天之内完成(为节省时间，可与表达鉴定同时进行)。具体时间计算参见表1。因此， 在表达载体构建完成后，采用本发明方法进行基因表达和功能鉴定可在25天之内完成，与 目前常用的转化拟南芥方法进行鉴定相比，鉴定周期缩短了半年左右。
图1是用含有植物表达载体pCAMBIA1300的农杆菌，直接侵染尖孢镰刀菌，以潮霉 素抗性作为筛选标记，所得到尖孢镰刀菌转化子。说明尖孢镰刀菌可以识别植物表达载体 带有的CAMV35S启动子。图2是将带有CAMV35S启动子目的基因克隆至植物表达载体使用植物转基因常用的启动子CAMV35S控制目的基因的表达，构建完成后，直接 转化尖孢镰刀菌进行初步鉴定，根据鉴定结果，确定是否转化植物。图3是阳性转化子分子鉴定的电泳图谱在潮霉素磷酸转移酶基因的内部设计引物，产物大小为800bp，以转化子的基因组 DNA为模板进行PCR扩增，用1. 0%的琼脂糖凝胶电泳(1-7为不同的转化子)。图4是转IrrE基因的尖孢镰刀菌在不同盐浓度的匪培养基中培养4天以后孢子 浓度的数据。原始接种孢子浓度在0. IXlOVml左右。
具体实施例方式以下实施例中，用高抗草甘膦的EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶) 基因进行了具体实验，证明本发明方法有效。但需要说明的是，本领域技术人员按照本发明 的精神，采取本方法，也可用于其它目的基因的表达检测和功能鉴定。因此，本专利的范围 并不限于如下实施例的内容。以下实施例中所用的部分材料来源如下尖孢镰刀菌菌株来自中国农业科学院土壤肥料研究所“中国农业微生物菌种 保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China，ACCC) ”，菌株保藏编号 31352。需要说明的是，用任何尖孢镰刀菌菌株，都可达到本发明的目的。CaMV35S启动子来自花椰菜病毒的一种强启动子，可以被植物识别，已经被广泛 应用于植物转基因育种中外源基因的启动表达，其序列已知。pCAMBIA系列植物表达载体从澳大利亚Cambia研究所购得。pBI121 是植物转基因常用的表达载体，可以从质粒载体服务商处购得。
潮霉素B 美国Amresco公司产品。EPSP合酶基因是申请人通过采集草甘膦极端污染环境中土壤样品，分离样品总 DNA，构建粘粒文库，筛选草甘膦抗性转化子，序列分析，人工合成而得到的高抗草甘膦的 DNA片段。Nos终止子是国际通用的真核基因的表达终止元件。pCAMBIA1300植物表达载体购自澳大利亚Cambia研究所。农杆菌AGL-I 真菌或植物转基因常用的农杆菌菌株之一，可从专业菌株服务商 处购得。实施例1来自原核生物的新的抗草甘膦基因的表达和功能鉴定本发明所用的植物表达载体pCAMBIA1300来自澳大利亚Cambia研究所，其上所 带的CAMV35S启动子是来自花椰菜病毒的一种强启动子，已被广泛应用于植物转基因育种 中。本发明从原核生物中获得了一个新型高抗草甘膦的EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽 草酸-3-磷酸合酶)基因，其开放阅读框核苷酸序列全长为1335个碱基，编码全长为445 个氨基酸。采用本发明提供的方法可以快速对该基因在真核生物中的表达和功能进行快速 鉴定。操作步骤如下1、植物表达载体的构建1. 1以含有上述高抗草甘膦的EPSP合酶基因的质粒为模板，对该EPSP合酶基因的 开放阅读框进行PCR扩增，所使用的5'端引物添加25个碱基与CAMV35S启动子3'末端 互补，3'末端引物引入HindIII酶切位点；1.2设计引物扩增CAMV35S启动子，5'端引物引入BamHI酶切位点，3'端引物添 加25个碱基与EPSP合酶基因阅读框的5'端互补；1. 3利用融合PCR技术将CAMV35S启动子序列与EPSP合酶基因的开发阅读框相 连，得到带有CAMV35S启动子的EPSP合酶基因片段；1. 4将步骤3获得的带CAMV35S启动子的EPSP合酶基因片段，用BamHI和 Hindi 11酶切后，连入相同酶切的载体pET28a得到重组质粒pETGR-79并将其转化大肠杆菌 BL2l(Promega 公司)；1. 5将pETGR-79和植物表达载体pCAMBIA1300分别用BamHI和HindIII酶切，回 收目的片段并连接，转化大肠杆菌，得到带有CAMV35S启动子的EPSP合酶基因的植物表达 载体(图1)。2、农杆菌的转化将构建好的植物表达载体转入农杆菌需2天时间。2. 1用常规方法制作农杆菌AGL-I的感受态细胞；2. 2向每管感受态细胞中加入大约1 μ g构建好的表达载体，冰浴30min.，液氮速 冻 lmin，37°C^^t3min。2. 3加入800 μ 1 YEP液体培养基，于28°C 150rpm恢复培养3h后，5000rpm离心 Imin.收集菌体。2. 4将收集到的农杆菌菌体涂布于YEP平板(含卡那霉素)上，28°C培养2_3天， 挑取长出的单菌落，鉴定转化子。
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3、侵染尖孢镰刀菌前农杆菌的培养农杆菌的培养过程需2-3天时间。3. 1取50ml三角瓶一个，加入匪液体培养基20ml，分别加入50mg/ml的Kan和 Rif各20 μ 1。接种含有植物表达载体的新鲜的农杆菌一环，28°C，200rpm振荡培养48h。3. 2取两个灭菌的1. 5ml EP管，吸取1. 5ml培养好的菌液，lOOOOrpm，离心30s，用 Iml IM液体培养基重悬菌体，重复离心操作，然后再用Iml IM重悬菌体。3. 3吸取200 μ L菌液，用IM稀释10倍，测定OD600值，根据测得的0. D值计算IOml 培养物菌液用量，使最终菌液0D_ = 0. 15。3. 4在IOml上述菌液中添加AS，使终浓度为200 μ M/L。28°C，200rpm摇床培养 12h，使OD6tltl值在0. 5-0. 7之间，备用。4、侵染前尖孢镰刀菌的准备尖孢镰刀菌培养需2-3天时间，但可以和农杆菌培养同时进行。4. 1取IOOml三角瓶一个，加入CM液体培养基20ml，接种平板或试管保存的、准备 用于转化的尖孢镰刀菌EPSPs突变体适量。4. 2 25°C，150rpm摇床培养2-3天。取少量菌液，用无菌水稀释10倍镜检，计算孢
子数量；4. 3根据镜检结果，用无菌水稀释至孢子浓度为IX 106Cfu/ml左右，备用。5、尖孢镰刀菌的遗传转化从侵染开始至获得转化子纯培养，共需12天，包括以下几个步骤。5.1共培养(2天)(1)制备IM(诱导培养基)平板数块，其中每块平板(25ml)含20mMAS 50 μ L，小 心将灭菌的微孔滤膜放在平板上，使尽量不存在气泡。(2)分别吸取准备好的农杆菌和尖孢镰刀菌孢子悬浮液100 μ L混勻。(3)将200 μ L农杆菌和尖孢镰刀菌混合液均勻涂布于微孔滤膜上，超净台吹干， 25 °C恒温培养箱培养48h。5. 2阳性转化子的筛选(4天)(1)制备PDA平板数块，其中每块平板(25ml)含IOOmM Cef 50 μ L, 50mg/ml Hygl5 μ L，并将完成共培养的滤膜转至该PDA平板上。(2)继续25°C培养4d，直至转化子菌落出现。(3)将得到的转化子单菌落转接至含有Cef和Hyg的PDA平板上，继续观察其生长 情况(图2)。5. 3转化子纯培养的获得(4天)将获得的阳性转化子菌体适量，用无菌水悬浮，镜检计算孢子数量，并根据孢子浓 度用无菌水进行梯度稀释，取少量菌液涂平板(PDA+Hyg)，使每块平板的菌落数在30-50之 间，25°C培养4天后得到单菌落(纯培养)。6、转化子的分子验证转化子单菌落摇菌培养4天，一部分用于提取基因组DNA，另一部分用于提取总 RNA。用OMEGA公司真菌基因组提取试剂盒，提取转化子的基因组DNA，在潮霉素磷酸转移酶基因内部设计引物，以转化子基因组DNA为模板，采用PCR方法对阳性转化子进行分子 验证(图3)。7、基因表达鉴定这个过程大约需要7天。用步骤6培养好的菌株进行总RNA提取。用上海朗顿真菌RNA小量提取试剂盒，提取阳性转化子总RNA。用promega公司的 RT-PCR反应系统(K1002S)，进行反转录和RT-PCR，未转化的尖孢镰刀菌EPSPs突变体为对 照，进行基因表达半定量鉴定。在导入的外源基因内部设计引物进行PCR扩增结果表明，导 入的新的高抗草甘膦的基因在CAMV35S启动子的控制下实现了正常表达，而对照尖孢镰刀 菌EPSPs突变体未扩增出任何条带。8、基因功能鉴定这个过程大约需要6天。但可以和分子验证、基因表达鉴定同时进行。尖孢镰刀菌EPSPs突变体在基本培养基(MM)中不能生长，而转入高抗草甘膦基 因的阳性转化子则能够生长。将经过鉴定的阳性转化子分别接种在含有0，20，50，80，100， 120，150，200，250，300mM草甘膦浓度的基本培养基中，25°C培养3天，通过检测孢子浓度， 进行目的基因的功能鉴定。结果表明，在草甘膦浓度为200mM时，阳性转化子仍然能够正常 生长，250mM时生长缓慢，说明其耐草甘膦的水平在200-250mM之间。9、基因表达和功能评估综合分析评估EPSP合酶基因的表达和功能请况说明，构建的植物表达载体 CAMV35S启动子可以正常启动外源基因的表达，新的高抗草甘膦基因的具有抗性功能，可以 用于植物的转基因育种。实施例2来自原核生物的新的与抗盐相关基因的表达和功能鉴定本发明从极端耐腐蚀异常球菌中获得了一个全局调控基因IrrE，该基因可以提高 大肠杆菌的耐盐能力。采用本发明提供的方法可以快速对该基因在真核生物中的表达和功 能进行快速鉴定。操作步骤如下1、植物表达载体的构建1. 1以D. radiodurans Rl的基因组DNA为模板，对IrrE基因的开放阅读框进行 PCR扩增，所使用的5'端引物添加25个碱基与CAMV35S启动子3'末端互补，3'末端引物 引入HindIII酶切位点；1.2设计引物扩增CAMV35S启动子，5'端引物引入BamHI酶切位点，3'端引物添 加25个碱基与EPSP合酶基因阅读框的5'端互补；1. 3利用融合PCR技术将CAMV35S启动子序列与IrrE基因的开发阅读框相连，得 到带有CAMV35S启动子的IrrE基因片段；1. 4将步骤3获得的带CAMV35S启动子的IrrE基因片段，用BamHI和HindIII酶切 后，连入相同酶切的载体pET28a得到重组质粒pETIrrE并将其转化大肠杆菌BL21 (Promega 公司)；1. 5将pETIrrE和植物表达载体pCAMBIA1300分别用BamHI和HindIII酶切，回 收目的片段并连接，转化大肠杆菌，得到带有CAMV35S启动子的IrrE基因的植物表达载体 (图 1)。2、农杆菌的转化
3、侵染尖孢镰刀菌前农杆菌的培养操作方法同实施例1，但尖孢镰刀菌菌株使用野生型。4、侵染前尖孢镰刀菌的准备5、尖孢镰刀菌的遗传转化6、转化子的分子验证4、5、6三项操作方法同实施例1。7、基因表达鉴定转IrrE基因阳性转化子单菌落总RNA提取，使用TRIzol试剂(GIBC0-BRL), RNase-free DNase (TaKaRa公司)被用于去除DNA污染。用promega公司的RT-PCR反应系 统(K1002S)，进行反转录和RT-PCR，野生型尖孢镰刀菌为对照，进行基因表达半定量鉴定。 在导入的IrrE基因内部设计引物进行PCR扩增结果表明，导入的新的IrrE基因在CAMV35S 启动子的控制下实现了正常表达，而对照尖孢镰刀菌野生型未扩增出任何条带。8、基因功能鉴定野生型尖孢镰刀菌菌株在液体基本培养基(MM)中能够正常生长。将经过鉴定的 阳性转化子(以野生型菌株为对照)，分别接种在含有0，10，15，20，25，30，40，50，75，IOOmM NaCI浓度的液体基本培养基中，25°C培养4天，通过检测孢子浓度，进行目的基因的功能鉴 定。结果表明，野生型菌株在NaCI浓度为15mM时，生长速度受到抑制，25mM以上时不能生 长。而转基因阳性转化子在25mM时生长基本正常，其完全被抑制的盐浓度在30mM以上，说 明其IrrE基因的导入提高了尖孢镰刀菌的耐盐水平(图4)。表1本发明方法进行基因表达和功能鉴定所需时间
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权利要求
一种在真菌中表达外源基因的方法，其特征是利用尖孢镰刀菌识别CaMV35S启动子，并启动基因表达。
2.权利要求1所述的方法，其操作步骤如下1)将目的基因克隆至带有CaMV35S启动子的植物表达载体上；2)将步骤1)所得的载体转化导入农杆菌中；3)用步骤2)所得到的农杆菌侵染尖孢镰刀菌，筛选获得阳性转化子；4)对步骤3)所述阳性转化子中含有的目的基因进行表达和功能鉴定。
3.权利要求2所述的方法，步骤1)所述植物表达载体是PBI121或pCAMBIA系列；
4.权利要求2或3所述的方法，步骤3)用潮霉素抗性为筛选标记。
5.一种在真菌中表达高抗草甘膦的EPSP合酶基因和功能快速鉴定的方法，主要操作 步骤如下1)将EPSP合酶基因的开放阅读框序列5'端连接CAMV35S启动子，3'端连接nos终 止子；2)将连接好的完整的EPSP合酶基因克隆至pCAMBIA1300的多克隆位点；3)得到的重组质粒(表达载体)转化导入农杆菌AGL-I中；4)用含有重组质粒的农杆菌侵染尖孢镰刀菌草甘膦抗性缺失的突变体菌株，用潮霉素 抗性标记筛选阳性转化子，并获得单孢培养；5)在潮霉素磷酸转移酶基因内部设计引物，采用PCR方法对阳性转化子进行分子验证；6)分别提取转化子的基因组DNA和总RNA进行基因表达鉴定；7)在含有草甘膦的基本培养基平板上，进行目的基因的功能鉴定。
全文摘要
本发明涉及一种植物转基因育种方法，利用尖孢镰刀菌识别CaMV 35S启动子在真菌中表达外源基因，快速鉴定基因功能。本方法简便、快速，缩短了植物转基因育种的进程，24天内可以完成基因的表达和功能初步鉴定。
文档编号C12N15/54GK101914567SQ20101023272
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者张维, 徐荣旗, 林敏 , 陆伟 申请人:中国农业科学院生物技术研究所