专利名称：一种高产4-丁内酰胺水解酶的菌株及利用该菌株制备γ-氨基丁酸的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种高产4-丁内酰胺水解酶的菌株 (Escherichia coli) HHSW-16及利用该菌株制备Y-氨基丁酸的方法。该菌株为大肠埃希 氏菌菌株(Escherichia coli)，命名为HHSW-16，并于保藏日期2010年7月7日，保藏于位 于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 3998。
背景技术：
y -氨基丁酸(γ -aminobutyric acid,简称 GABA)，分子式为 C4H9NO2,相对分子量 为103. 1，白色结晶或结晶性粉末，易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于其他有机溶剂，是一种 天然活性成分，广泛分布于动植物体内。GABA是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动， 具有很高的生理活性。根据目前的研究，发现GABA的生理活性主要表现在以下几方面(1) GABA能结合抗焦虑的脑受体并使之激活，然后与另外一些物质协同作用，阻止与焦虑相关 的信息抵达脑指示中枢；(2)GABA能作用于脊髓的血管运动中枢，有效促进血管扩张，达到 降低血压的目的。(3)GABA能进入脑内三羧酸循环，促进脑细胞代谢，同时还能提高葡萄糖 代谢时葡萄糖磷酸酯酶的活性，增加乙酰胆碱的生成，扩张血管增加血流量，并降低血氨， 促进大脑的新陈代谢，恢复脑细胞功能。(4)GABA作为活性因子，具有良好的生理活性，将其 应用于功能性食品中将大有可为。虽然GABA在自然界的分布很广泛，但将其开发作为保健 食品功能因子无疑还需大量的工作。动植物组织中GABA的含量都较低，例如豆叶中的含量仅为0. 04 μ g/g鲜重，因而 从动植物体内直接提取GABA并作为食品配料的可行性不大，其原因主要是因为GABA存在 量少并且分离困难。根据目前文献报道，Y -氨基丁酸的制备方法主要有以下几种1、化学合成法GABA的化学合成已有百余年历史，主要以邻苯二甲酰亚氨钾和Y-氯丁氰在强烈 条件下(180°C)反应，产物与浓硫酸一起回流，在经过结晶提纯而得。2001年，Abbjasovale 等人(RU 2202538,2001)将α -吡咯烷酮和氢氧化钾作用生成的γ-氨基丁酸钾盐转化为 Y-氨基丁酸。总的来说，化学合成法制备GABA由于在生产工艺中使用了一些腐蚀性较强 的溶剂，反应条件剧烈，以及得率较低等原因，存在一定的安全隐患。上述方法不足在于(1)水解开环反应时间长、转化率不高；(2)反应过程繁琐、中间产生大量的杂质，一次合格率低，综合成本高。(3)分离方法主要采用离子交换树脂法，分离时间长，设备利用率低，成本居高不 下。2、生物合成法1961年，陈志民等(生物化学与生物物理学报，Vol. 1，No. 2，1961)利用大肠杆菌El、E2、E3、E4菌种产生的脱羧酶将L-谷氨酸及钠脱羧制备得γ-氨基丁酸。1989年， 阿诺.舒尔茨等人(中国专利，CN125010L 1989)从E. coli DH-I中分离出一种氨基转移 酶将L-谷氨酸的氨基转移至琥珀酸半醛得到Y-氨基丁酸。1997年，Darijel等人(RU 2143002，1997)用E. coli VKPMB-7460或B-7452产生的转氨酶将L-谷氨酸或其钠盐转 化为Y-氨基丁酸。2002年，江波等人(中国专利，CN1392262,2002)用乳酸菌或乳酸菌 和酵母菌混用产生的脱羧酶将L-谷氨酸或其钠盐转化为Y-氨基丁酸。2005年，焦庆才 等人(中国专利，CN1635128,2005)用Ε. coli ASl. 505产生的脱羧酶酶将L-谷氨酸脱 羧制备得Y-氨基丁酸。2005年，梅乐和等人(中国专利，CN167335L2005)用短乳杆菌 CGMCCN0. 1306产生的谷氨酸脱羧酶将谷氨酸钠脱羧制备得γ-氨基丁酸。2008年，曹郁生等人(中国专利，CN101333548,2008)利用MRS液体培养基将短 乳杆菌活化后，在MRSG发酵培养基中富集培养离心后即为含Y-氨基丁酸的溶液。2009 年，半谷吉识等人(中国专利，CN101389751，2009)通过从未精制的酱油中分离即使在培养 开始时在培养基中共同存在乳酸和食盐的条件下仍然能够生产GABA的乳酸菌凝乳酶乳酸 杆菌(Lactobacillus rermini)，并在将乳酸菌接种到含有L-谷氨酸和/或其盐的培养基 中之后对其进行培养，来获得含有GABA的培养混合物。2010年，李荣杰等人(中国专利， CN101705261A，2010)将经过培养的Y _氨基丁酸生产菌株接种到发酵罐中的发酵培养基 中培养，进行有氧、厌氧两段组合发酵，发酵过程中分段控温，在对氧的需求上采取分段调 控的手段，使得Y-氨基丁酸生产菌株在厌氧状态下代谢产生Y-氨基丁酸。因此相比较 而言，生物法比化学法相比较而言安全度高、产品收率高具有更广阔的应用前景。而目前我 国Y-氨基丁酸的生产成本较高，得率较低，副产物多，不能直接用于食品和医药工业。
发明内容
本发明提供了一种利用高产4-丁内酰胺水解酶的菌株(保藏号CGMCC No. 3998) 制备Y -氨基丁酸的方法，从而提供了一种高效、低成本的酶法制备氨基丁酸的方法。本发明的高产4-丁内酰胺水解酶的菌株(保藏号CGMCC No. 3998)，是从黄泥田、 红泥田、黄泥砂田、泥质田或黄斑田等若干种土壤中采集，采样深度为0 15cm。属大肠杆 菌Escherichia coli菌株，命名为HHSW-16，显微镜观察菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散；有周鞭毛，镜检可见呈圆周运动；发酵产酸产气 ’属 于革兰氏阳性菌，兼性厌氧。该菌株于保藏日期2010年7月7日，保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为=CGMCC No. 3998。本发明的高产4- 丁内酰胺水解酶的菌株(保藏号CGMCC No. 3998)是从土壤中 分理出若干菌种，以α -吡咯烷酮为唯一碳源，在含Na2HPO4 · 12H20、KH2PO4, MgSO4 · 7Η20、 CaCl2 ·2Η20,FeSO4 ·7Η20,ZnSO4,NH4Cl和琼脂的固体培养基中筛选得到到的具有高产4- 丁 内酰胺水解酶的菌株，命名为HHSW-16。本发明的利用高产4-丁内酰胺水解酶的菌株(保藏号CGMCC No. 3998)制备 Y “氨基丁酸的方法，其包括下述步骤(1)摇瓶种子培养将菌株HHSW-16 (保藏号CGMCC No. 3998)接种于如下种子瓶
培养基中碳源为牛肉膏、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖和柠檬酸中的至少一种，浓度5-20g/L;氮源为酵母膏、玉米浆和蛋白胨中的至少一种，浓度10-30g/L;无机盐为 Na2HPO4 · 12Η204-7· 5g/L、KH2PO4 1. 0-2. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5g/L、CaCl2 · 2H20 5-15mg 和 FeSO4 ·7Η202-10π^ ；接种后于 25_45°C、pH6. 0-7. 5、摇床转速 140-250rpm 下培养 18-24h ；(2)发酵培养将上述步骤(1)培养好的HHSW-16菌株再接种到如下发酵培养基 中碳源为玉米芯水解液、牛肉膏、乳糖和柠檬酸中的至少一种，浓度20-30g/L ；氮源为酵 母膏、玉米浆、蛋白胨中的至少一种，浓度10-30g/L ；无机离子为Na2HPO4 ·12Η20 5. 0-8. Og/ L、KH2P04 1. 0-2. 5g/L、MgS04 ·7Η20 0· 2_0· 5g/L、CaCl2 ·2Η20 5_15mg和FeSO4 ·7Η20 2-10mg ; 并于发酵罐中30-45°C、pH 6. 5-7. 5下通无菌空气培养24_48h ；(3)酶促反应发酵结束后，离心收集菌体；并将湿菌体细胞加入到含α -吡咯烷 酮的转化液中，在温度为28 45°C，ρΗ值6. 0 8. 0条件下进行酶促反应12 24h ；(4)分离纯化将上述步骤(3)反应液离心得溶液，经浓缩、脱色、结晶、干燥后得 到Y-氨基丁酸成品。优选的本发明的利用高产4-丁内酰胺水解酶的菌株制备Y-氨基丁酸的方法中， 所述步骤(2)中的菌株接种量为1-5% ；所述步骤(2)中无菌空气以通风比为1 0.8 1.2 (ν/ν)的通风速率流入发酵培养基中，所述通风比是料液体积与每分钟通气量的比值； 所述步骤(3)转化液中α-吡咯烷酮的浓度为20_400g/L。本发明与现有技术相比具有以下优点(1)本发明的保藏号为CGMCC No. 3998的HHSW-16菌株是以吡咯烷酮为唯一碳源， 从土壤中筛选出具有较高立体选择性的拆分内酰胺的菌株；(2)本发明筛选出的保藏号为CGMCC No. 3998的菌株HHSW-16，在优选的培养基 中可以高产率的产出4-丁内酰胺水解酶，使反应有较高的转化率和高的反应速度，对底物 α -吡咯烷酮的转化率达98%以上，产物γ -氨基丁酸的收率达90%以上。(3)本发明利用高产4- 丁内酰胺水解酶的菌株HHSW-16 (保藏号为CGMCC No. 3998)制备Y-氨基丁酸的方法，采用α-吡咯烷酮作为制备原料，反应条件温和，4-丁 内酰胺酶水解专一性强，转化率高，解决了生产过程中副产物多，得率低，分离不完全的缺 陷。(4)本发明的利用高产4-丁内酰胺水解酶的菌株HHSW_16(保藏号为CGMCC No, 3998)制备Y-氨基丁酸的方法具有原料价格低廉，转化时间短，操作简便，产品纯度高，生 产效率高等优点，还避免了传统方法中的腐蚀性溶剂的使用，保护了环境。
具体实施例方式实施例1一种高产4- 丁内酰胺水解酶菌株HHSW-16 (保藏号CGMCC No. 3998)的筛选从黄泥田、红泥田、黄泥砂田、泥质田和黄斑田等若干土壤中采集，采样深度为 0 15cm。将采集的土壤制成土壤稀释液后，涂布平板培养。然后挑取不同的菌落，以 α -吡咯烷酮为唯一碳源，先于下述琼脂斜面保藏培养基中进行培养每升含含酵母提取 物 0. lg，可溶性淀粉 0. lg，胰蛋白胨 0. lg, Na2HPO4 · 12H20 1. 5g，KH2PO4 1. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 2g, CaCl2 · 2H20 IOmg, FeSO4 · 7H20 7mg, ZnSO4 0. lmg, NH4Cl 2g，琼脂 20g, pH 7. O。
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再接种于下述液体产酶培养基中每升含Na2HPO4 · 12H20 7g，KH2P042g, MgSO4 · 7Η200· 4g，CaCl2 · 2Η20 10mg，FeSO4 · 7Η20 8mg，NH4Cl 2g，α -吡咯烷酮 5g，葡萄糖 5g，pH值7. O。30°C,200r/min培养48h ；取0. 4mL用水稀释6倍，以空白培养基为对照测量 其在620nm处的吸光度(OD值)。测定结果表1所示。于4°C，4500r/min离心15min后收集菌体。用0. 05mol/L磷酸钠缓冲液(ρΗ7. 0) 配制α -吡咯烷酮溶液25g/L，调pH为7. 0，加25mL至湿菌体中，震荡，倒入大试管，30°C， 200r/min,转化24h，4000r/min离心lOmin，取上清液用HPLC法测定转化率，从而得到高产 率菌株HHSW-16。结果表1所示。表1不同菌株培养48h后的OD值和产酶转化率 实施例2本发明的利用高产4- 丁内酰胺水解酶的菌株HHSW-16 (保藏号CGMCC No. 3998) 制备Y-氨基丁酸的方法1、将斜面培养的菌株HHSW-16接种一环于如下种子瓶培养基中牛肉膏5g/ L,葡萄糖5g/L，可溶性淀粉lg/L，酵母膏3g/L，玉米浆10g/L，蛋白胨5g/L。无机离子 成分=Na2HPO4 · 12H20 4. 5g/L ；KH2PO4 1. Og/L ；MgSO4 · 7H20 0. lg/L ；CaCl2 · 2H20 5mg ； FeSO4 · 7H204mg。30°C培养 18h，pH 控制在 6. 5，摇床转速 180rpm。2、待摇床种子瓶培养好后，将培养好的HHSW-16菌株再以的接种量接种到如 下发酵培养基中玉米芯水解液30g/L，牛肉膏5g/L，乳糖5g/L，酵母膏5g/L，玉米浆15g/ L，蛋白胨 10g/L。无机离子成分=Na2HPO4 ·12Η20 5. 0g/L ；KH2PO4 1. 0g/L ；MgSO4 ·7Η20 0. 2g/ L ；CaCl2 ·2Η20 5mg ；FeSO4 ·7Η20 4mg。添加氨水或氢氧化钠将发酵体系pH值控制在7. 0左 右。在10L发酵罐中30°C培养24h，发酵过程中将无菌空气以通风比为1 0.8(v/v)的通 风速率流入发酵培养集中，搅拌速度为200rpm。3、发酵结束后，4°C 4500rmp/min离心15min收集菌体。称取3g湿菌体细胞加入 到500mL的转化液中，转化液含25g的α -吡咯烷酮，500mL pH6. 8转化液30°C反应12h。 反应液中Y-氨基丁酸浓度为5.8%，对α-吡咯烷酮摩尔转化率为96.7%。4、将反应液4000rpm/min离心15min得Y-氨基丁酸溶液。把Y-氨基丁酸溶液通过反渗透装置浓缩，得到初步浓缩的Y-氨基丁酸水溶液；加入活性炭在温度50°C下保持 20min，过滤得到脱色的Y-氨基丁酸水溶液；经蒸发器浓缩，加入两至三倍体积的95%的 乙醇，搅拌均勻，放冰箱静置过夜；析出的晶体过滤后用酒精反复洗涤干燥后得25g γ-氨 基丁酸，摩尔收率为86. 34%。实施例3本发明的利用高产4- 丁内酰胺水解酶的菌株HHSW-16 (保藏号CGMCC No. 3998) 制备Y-氨基丁酸的方法1、将斜面培养的菌株HHSW-16接种一环于如下种子瓶培养基中牛肉膏7.5g/ L,柠檬酸5g/L，可溶性淀粉2g/L，酵母膏5g/L，玉米浆10g/L，蛋白胨5g/L。无机离子 成分=Na2HPO4 · 12H20 5. Og/L ；KH2PO4 2. Og/L ；MgSO4 · 7H20 0. 2g/L ；CaCl2 · 2H20 7mg ； FeSO4 · 7H206mg。35°C培养 20h, pH 控制在 7. 0，摇床转速 220rpm。2、待摇床种子瓶培养好后，将培养好的HHSW-16菌株再以2. 5%的接种量接种到 如下发酵培养基中玉米芯水解液35g/L，牛肉膏5g/L，葡萄糖5g/L，酵母膏10g/L，玉米浆 20g/L，蛋白胨 5g/L。无机离子成分=Na2HPO4 · 12H20 7. 5g/L ；KH2PO4 2. 5g/L ；MgSO4 · 7H20 0. 4g/L ；CaCl2 · 2H20 6mg ；FeSO4 · 7H20 5mg。添加氨水或氢氧化钠将发酵体系pH值控制在 7.0左右。在IOL发酵罐中37°C培养36h，发酵过程中将无菌空气以通风比为1 1.0(v/ ν)的通风速率流入发酵培养集中，搅拌速度为260rpm。3、发酵结束后，4°C 4500rmp/min 15min离心收集菌体。称取3g湿菌体细胞加入 到500mL的转化液中，转化液含50g的α -吡咯烷酮，500mL pH7. 0转化液中35°C反应24h。 反应液中Y-氨基丁酸浓度为11.8%，对α-吡咯烷酮摩尔转化率为98.3%。4、将反应液4000rpm/min离心15min得Y -氨基丁酸溶液。把Y-氨基丁酸溶液通 过反渗透装置浓缩，得到初步浓缩的Y-氨基丁酸水溶液；加入活性炭在温度50°C下保持 20min，过滤得到脱色的Y-氨基丁酸水溶液；经蒸发器浓缩，加入两至三倍体积的95%的 乙醇，搅拌均勻，放冰箱静止过夜；析出的晶体过滤后用酒精反复洗涤干燥后得56g γ -氨 基丁酸，摩尔收率为93.3%。实施例4本发明的利用高产4- 丁内酰胺水解酶的菌株HHSW-16 (保藏号CGMCC No. 3998) 制备Y-氨基丁酸的方法1、将斜面培养的菌株HHSW-16接种一环于如下种子瓶培养基中牛肉膏5g/L，葡 萄糖7. 5g/L，可溶性淀粉2g/L，酵母膏5g/L，玉米浆10g/L，蛋白胨10g/L。无机离子成分 Na2HPO4 · 12H20 5. 0g/L ；KH2PO4 2. 0g/L ；MgSO4 · 7H20 0. 5g/L ；CaCl2 · 2H20 7mg ；FeSO4 · 7H20 6mg。40°C培养24h，pH控制在7. 5，摇床转速250rpm。2、待摇床种子瓶培养好后，将培养好的HHSW-16菌株再以5%的接种量接种到如 下发酵培养基中玉米芯水解液40g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖5g/L，酵母膏15g/L，玉米浆 20g/L，蛋白胨 10g/L。无机离子成分Na2HPO4 · 12H20 8. 0g/L ；KH2PO4 2. 5g/L ；MgSO4 · 7H20 0. 8g/L ；CaCl2 ·2Η20 6mg ；FeSO4 ·7Η20 IOmgo添加氨水或氢氧化钠将发酵体系pH值控制在 7.0左右。在10L发酵罐中40°C培养48h，发酵过程中将无菌空气以通风比为1 1.2(v/ ν)的通风速率流入发酵培养集中，搅拌速度为400rpm。3、发酵结束后，4°C 4500rmp/min离心15min收集菌体。称取3g湿菌体细胞加入到500mL的转化液中，转化液25g的α -吡咯烷酮，500mL pH6. 8转化液37°C反应30h。反 应液中Y-氨基丁酸浓度为23%，对α-吡咯烷酮摩尔转化率为95.8%。
4、将反应液4000rpm/min离心15min得Y -氨基丁酸溶液。把Y-氨基丁酸溶液通 过反渗透装置浓缩，得到初步浓缩的Y-氨基丁酸水溶液；加入活性炭在温度50°C下保持 20min，过滤得到脱色的Y-氨基丁酸水溶液；经蒸发器浓缩，加入两至三倍体积的95%的 乙醇，搅拌均勻，放冰箱静止过夜；析出的晶体过滤后用酒精反复洗涤干燥后得IlOgY-氨 基丁酸，摩尔收率为91. 63%。
权利要求
一种高产4 丁内酰胺水解酶的菌株，该菌株来源于黄泥田、红泥田、黄泥砂田、泥质田或黄斑田土壤中，并通过筛选分离而得，其特征在于属于革兰氏阳性菌，兼性厌氧，显微镜观察菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散；有周鞭毛，镜检可见呈圆周运动；发酵产酸产气；属大肠埃希氏菌菌株(Escherichia coli)，命名为HHSW 16，保藏号为CGMCC No.3998。
2.一种利用权利要求1所述的菌株制备Y-氨基丁酸的方法，其特征在于包括下述 步骤(1)摇瓶种子培养将菌株HHSW-16接种于如下种子瓶培养基中碳源为牛肉膏、葡萄 糖、可溶性淀粉、乳糖和柠檬酸中的至少一种，浓度5-20g/L ；氮源为酵母膏、玉米浆和蛋白 胨中的至少一种，浓度 10-30g/L ；无机盐为 Na2HPO4 · 12H204_7. 5g/L、KH2PO4 1. 0-2. 5g/L、 MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5g/L、CaCl2 · 2H20 5_15mg 和 FeSO4 · 7H202_10mg ；接种后于 25-45°C > pH6. 0-7. 5、摇床转速 140-250rpm 下培养 18_24h ；(2)发酵培养将上述步骤(1)培养好的HHSW-16菌株再接种到如下发酵培养基中碳 源为玉米芯水解液、牛肉膏、乳糖和柠檬酸中的至少一种，浓度10-60g/L;氮源为酵母膏、 玉米浆、蛋白胨中的至少一种，浓度10-50g/L ；无机离子为Na2HPO4 · 12H20 5. 0-8. Og/L、 KH2PO4 1. 0-2. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2-0. 5g/L、CaCl2 · 2H20 5_15mg 和 FeSO4 · 7H20 2-lOmg ； 并于发酵罐中30-45°C、pH 6. 5-7. 5下通无菌空气培养24_48h ；(3)酶促反应发酵结束后，离心收集菌体；并将湿菌体细胞加入到含α-吡咯烷酮的 转化液中，在温度为28 45°C，ρΗ值6. 0 8. 0条件下进行酶促反应12 24h ；(4)分离纯化将上述步骤(3)反应液离心得溶液，经浓缩、脱色、结晶、干燥后得到 Y-氨基丁酸成品。
3.根据权利要求2所述的制备Y-氨基丁酸的方法，其特征在于所述步骤(2)中的 菌株接种量为1_5%。
4.根据权利要求2所述的制备Y-氨基丁酸的方法，其特征在于所述步骤(2)中无 菌空气以通风比为1 0.8 1.2(v/v)的通风速率流入发酵培养基中。
5.根据权利要求2所述的制备Y-氨基丁酸的方法，其特征在于所述步骤(3)转化 液中α “吡咯烷酮的浓度为20_400g/L。
全文摘要
本发明公开了一种利用高产4-丁内酰胺水解酶的菌株HHSW-16制备γ-氨基丁酸的方法，该菌株属大肠杆菌菌株(Escherichia coli)，命名为HHSW-16，于2010年7月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3998。该菌株是从黄泥田、红泥田、黄泥砂田、泥质田或黄斑田土壤中采集、培养筛选得到。利用该菌株HHSW-16制备γ-氨基丁酸的反应条件温和，对底物α-吡咯烷酮的转化率达98％以上，产物γ-氨基丁酸的收率达90％以上，转化时间短，操作简便，产品纯度高，避免了传统方法中的腐蚀性溶剂的使用，保护了环境。
文档编号C12R1/19GK101921720SQ20101023296
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月19日 优先权日2010年7月19日
发明者刘洋, 白莹, 秦秀秀, 蒋光玉, 郑向辉 申请人:安徽华恒生物工程有限公司