专利名称：用于临床检测髓过氧化物酶的试剂盒及其方法
技术领域：
本发明属生物化学、检验试剂技术领域，具体涉及一种用于临床检测髓过氧化物 酶(MPO)的试剂盒及其方法。
背景技术：
髓过氧化物酶(英文名Myeloperoxidase，英文缩写:MP0, EC 1. 11. 1. 7)主要是 由活化的多形核嗜中性粒细胞分泌的糖基化的血红蛋白，是一种过氧化物酶。MPO颜色为绿 色，分子量140kDa，为两个相同单体构成的二聚体，两单体分开后仍有酶的活性。研究证实ΜΡ0是一种白细胞酶，有促炎、促动脉粥样硬化的作用，影响粥样斑块 的稳定性，并通过增大氧化应激而引起急性冠状动脉粥样硬化综合征(ACS)。作为活化粒细 胞的标志物，MPO是ACS危险性分层的良好指标；MPO在慢性肾炎、肾功能不全者和2型糖尿 病等方面也有着重要的检测价值。目前，测定髓过氧化物酶(MPO)的市售试剂盒有两种一种是ELISA法(酶联免疫 吸附测定法)试剂盒，在市场上占主导地位；另一种是次氯酸法试剂盒，利用以下反应测定 MPO的氯化活性
髓过氧化物酶
H202+C1"+H+ - H0C1+H20以上两种试剂盒都是手工法，手工操作准确度有限，且检测周期长、需要样本量 大，不能运用于全自动生化分析仪等缺点，且占主导地位的ELISA法更有价格昂贵、试剂盒 制备工艺复杂、难以工业化生产等缺点，给临床诊断带来很大的不便。因此有必要研究一种 价格合适、样本需要量小、适合于全自动生化分析仪运行的试剂盒，克服上述缺点。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种临床应用方便、检测成本低、需要样本 量少、测定准确度高、可以直接应用于全自动生化分析仪的髓过氧化物酶(MPO)试剂盒。为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为一种用于临床检测髓过氧化物酶 的试剂盒，该试剂盒由以下三种试剂构成，其中试剂1
缓冲液20 --200mmol/L
色原0. 1 5mmol/L
稳定剂1 100g/L
防腐剂0. 1 100g/L
表面活性剂1 100ml/L
盐酸2 20ml/L ；
试剂2
缓沖液20一200ram(’l／L
几。，o．1一lOOmm~ll／L
4一氨基安替比林o．1一lOOmm(’l／L
稳定剂l—lOOg／L
防腐剂o．1一lOOg／L
表面活性剂l—lOOml／L
盐酸2—20ml／L；
试剂3
髓过氧化物酶抑制剂20—lOO u m。l／L
稳定剂l—lOOg／L
防腐剂o．1一lOOg／L
表面活性剂l—lOOml／L。
本发明上述的缓沖液为磷酸盐缓沖液(如磷酸钾缓沖液)、柠檬酸一柠檬酸钠缓沖液、TriS缓沖液、甘氨酸缓沖液、G。。D‘S缓沖液中的一种。
本发明上述试剂l中的色原为Trinder反应505rlm有吸收的色原，如苯酚、愈创木酚或3，5一二氯一2一羟基苯磺酸钠(D}]BS)等。
本发明上述的稳定剂为多元醇、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白(BSA)、甘露醇、二糖及多糖。其中多元醇为甘油、乙二醇、PEG 2000(PEG为聚乙二醇)或者PEG 6000；其中二糖及多糖为蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉。
本发明上述的防腐剂为2一甲基异噻唑酮盐酸(2一甲基一4一异噻唑啉一3一酮盐酸盐CAS26172—54—3，M工T)、叠氮化合物(如叠氮钠)、PC系列防腐剂(如P(；300)。
本发明上述表面活性剂为非离子型表面活性剂，如吐温80(TWeen 80)、曲拉通X—lOO(Trit。n X—lOO，聚乙二醇辛基苯基醚)或乳化剂。P。
本发明上述试剂3中的MP。抑制剂为本发明的关键所在，该抑制剂必须具有以下特性
(1)特异性高特异性抑制MP。的活力，即不能抑制其他过氧化物酶的活力；
(2)抑制常数K、要低为了防止过高的抑制剂可能引起副反应及控制试剂盒成本，抑制剂的抑制常数K、要低，这样抑制掉99％以上MP。活力所采用的抑制剂浓度低，即采用很低的浓度即可将MP。的活力都抑制掉；
(3)非可逆抑制即抑制剂抑制MP。为非可逆，这样可以保证MP。的活力都被抑制，且采用的抑制剂的浓度也不会太高。
(4)稳定性好为了保证试剂盒在4℃储存一定时间内，该抑制剂具有同样的抑制MP。的活力，抑制剂的稳定性要好。
本发明试剂3中MP。抑制剂采用苯甲酰肼类物质，如4一氨基苯甲酰肼、4一羟基苯甲酰肼、4一氯苯甲酰肼、4一甲氧基苯甲酰肼或3一甲氧基苯甲酰肼等。该类抑制剂特异性强，具有只抑制髓过氧化物酶而不抑制其他非髓过氧化物酶的特性，其对MP。的抑制为非可逆抑制，其抑制机理如下在双氧水的存在下，苯甲酰肼类物质被髓过氧化物酶催化氧化，从而产生一定的自由基，这些自由基可破坏髓过氧化物酶的结构，使其失去活力。而其他的过氧化物酶则没有此特性。
本发明试剂盒中的三种试剂配制工艺如下(1)配制试剂1 在洁净的玻璃容器中首先加入按配方比例已称量好的缓冲液，然 后依次加入色原、稳定剂、防腐剂，加入适量水，然后加入表面活性剂，用盐酸调节PH到pH 6 9，然后搅拌过滤，所得滤液中再加入蒸馏水到定量得试剂1 (即如以IL试剂1为定量， 要求配制过程中各原料加入量满足在IL试剂1中为上述配方比例含量，试剂2和3也满足 上述条件)。(2)配制试剂2 在洁净的玻璃容器中首先加入按配方比例已称量好的缓冲液，然 后依次加入4-氨基安替比林、稳定齐IJ、防腐剂，加入适量水，然后加入H2O2和表面活性剂，用 盐酸调节PH到pH 6 9，然后搅拌过滤，所得滤液中再加入蒸馏水到定量。(3)配制试剂3 在洁净的玻璃容器中首先胺配方比例加入MPO抑制剂，然后依次 加入稳定剂、防腐剂，加入适量水，然后加入表面活性剂，搅拌过滤，所得滤液中再加入蒸馏 水到定量。(4)将上述所配制的试剂灌装分至小瓶，以供医疗检验用将试剂1灌装35mLX 1 瓶备用；将试剂2灌装15mLX 1瓶备用；将试剂3灌装12mLX 1瓶备用。(5)要求配制上述三种试剂的操作过程均在无菌车间里进行，试剂1、2、3均为无 色或者淡黄色透明液体，配制好后在2 8°C保存，可至少稳定1年。本发明要解决的另一个技术问题，是提供一种用于临床检测髓过氧化物酶的方 法，该方法依赖原理如下髓过氧化物酶(MPO)是一种过氧化物酶，可发生Trinder反应
髓过氧化物酶
H2O2+色原+4-氨基安替比林 _^醌类化合物(红色)+H2O而产物醌类化合物(红色)在505nm有吸收光，醌类化合物在505nm下的吸光值 与MPO的活性呈正比；如果为纯的ΜΡ0，没有其它过氧化物酶的干扰，则采用上述反应就可以测定MPO的 活性；而测定样本中除了髓过氧化物酶以外，往往还有其他过氧化物酶存在，我们统称 为非髓过氧化物酶(非ΜΡ0)，考虑到上述非MPO的干扰，采用以下技术原理测定样本中MPO 的活性先采用Trinder反应测定样本中总的过氧化物酶活力，然后加入MPO抑制剂，将样 本中所有MPO的活性全部抑制掉，然后同样采用Trinder反应测定剩余的非MPO活力，总的 过氧化物酶的量减去非髓过氧化物酶的量，就是髓过氧化物酶的量。具体测定髓过氧化物酶的量过程如下第一步，4-氨基安替比林(4-AAP)和色原在过氧化物酶和双氧水的作用下，生成 醌类化合物，在505nm下监测吸光度变化率(速率A)，速率A与总的过氧化物酶的量呈线性 关系；第二步，向上述反应体系中加入MPO抑制剂，同样在505nm下监测吸光度变化率 (速率B)，速率B与非髓过氧化物酶的量呈线性关系。
速率A减去速率B的值与MPO的量呈线性关系。测定髓过氧化物酶的量具体步骤为(1)取试剂1与待测样本以一定比例混勻，孵 育一定时间，再加入试剂2，然后测定总过氧化物酶的活力；(2)然后向步骤(1)的体系中加入试剂3，试剂3中的髓过氧化物酶抑制剂抑制了 髓过氧化物酶的活力，测定出此时非髓过氧化物酶的活力；(3)将步骤(1)操作所得的总过氧化物酶的活力减去步骤(2)所得的非髓过氧化 物酶的活力，即得出髓过氧化物酶的活力。上述步骤测定过程，主要采用速率法测定样本速率。本发明突出的实质性特点及显著进步主要表现在1.本发明的试剂盒，特别是试剂3中所采用的髓过氧化物酶抑制剂——苯甲酰胼 类物质，抑制MPO所需要的浓度很低，半数抑制浓度IC5tl很小，均小于10 μ mol/L,当抑制剂 浓度为20 100 μ mol/L，样本中99%以上的MPO均被抑制掉，这样确保了最终结果的准确 度。试剂盒在4°C 1年的观察实验表明，苯甲酰胼类物质稳定性可以达到试剂盒的稳定性要 求。因此，本发明采用的髓过氧化物酶抑制剂特异性强、抑制力高、抑制常数Ki低、稳定性 好的髓过氧化物酶抑制剂，因此，制备出的试剂盒准确度高，重复性好，试剂盒稳定性也好， 如在2 8 °C保存至少稳定1年。3.本发明的液体试剂盒可应用于全自动生化仪，因此不同于市售ELISA与次氯酸 法检测时耗时长，采用本发明的试剂盒可在短时间内处理大量样本，而且可以随到随做。4.本发明制造工艺简便，适合工业化生产；5.本发明因可以工业化生产，且所涉及的原料等较为便宜，故试剂盒整体成本低， 检验成本低。6.本发明所采用的方法学与目前市场上的ELISA及次氯酸法完全不同，是一种新 的方法学，可定量检测样本中髓过氧化物酶的浓度，为检测髓过氧化物酶开辟了一种全新 的方法。
具体实施方式
实施例1
试剂1
Tris缓冲液200mmol/L
苯酚2mmol/L
甘油10g/L
叠氮钠0. lg/L
吐温80lml/L
盐酸5ml/L
试剂2
Tris缓冲液200mmol/L
H2O2lOmmol/L
4_氨基安替比林2mmol/L
甘油lOg/L
叠氮钠0．1g／L
吐温80lml／L
盐酸5ml／L
试剂3
4一羟基苯甲酰肼25 u mol／L
甘油10g／C
叠氮钠0．1g／L
吐温80lml／L
测定样本时，采用速率法，温度为37℃，主波长为505nm，反应方向向上(正反应)，加样步骤如下
标本(样本)25 u L
试剂1 140 u L
混匀，置37℃孵育90秒
试齐0 260 u L
混匀，孵育120秒，读此时吸光度Al，再孵育180秒，
读取此时吸光度A2，计算速率A一(A2一A1)／时间。
试齐0 346 u L
混匀，孵育120秒，读吸光度A3，再孵育180秒读取吸
光度A4，计算速率B一(A4一A3)／时间。
A速率一速率A一速率B[Oloo] 采用全自动生化仪操作，仪器会根据定标结果和所检测的速率自动计算出样本中髓过氧化物酶的浓度。
实施例2
试剂l[O104] 磷酸钾缓沖液100mmol／L[O105] 愈创木酚5mmol／L
甘露醇10g／C
PC300lg／c[O108] 曲拉通X一10010ml／L
盐酸10ml／L
试剂2
磷酸钾缓沖液150mmol／L
几0，15mm01／C
4一氨基安替比林5mmol／L
甘露醇log／c
PC300lg／c
曲拉通X一100lOml／L
盐酸lOml／L
试剂3
3一甲氧基苯甲酰肼40 u mol／L
甘露醇log／c
PC300lg／c
曲拉通X一100lOml／L
实施例2的测定方法与实施例l相同。
实施例3
试剂l
GOOD’S缓沖液lOOmmol／L
DHBS5mm01／c
BSAlg／c
MIT0．1g／c[olao] 乳化剂OPlml／L
盐酸20ml／L
试剂2
GOOD’S缓沖液lOOmmol／L[ol34] H2027mmol／L[ol35] 4一氨基安替比林5mmol／L
BSAlg／c[ol37] MIT0．1g／L[ol38] 。Plml／L
盐酸20ml／L
试剂3
4一氨基苯甲酰肼30 u mol／L
BSAlg／L
MIT0．1g／L
乳化剂OPlml／L
实施例3的测定方法与实施例l相同。
以上实施例是对本发明的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明的精神和权力保护范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围。
权利要求
一种用于临床检测髓过氧化物酶的试剂盒，其特征是该试剂盒由以下三种试剂构成，其中试剂1缓冲液20～200mmol/L色原 0.1～5mmol/L稳定剂1～100g/L防腐剂0.1～100g/L表面活性剂1～100ml/L盐酸 2～20ml/L；试剂2缓冲液20～200mmol/LH2O2 0.1～100mmol/L4 氨基安替比林0.1～100mmol/L稳定剂1～100g/L防腐剂0.1～100g/L表面活性剂1～100ml/L盐酸 2～20ml/L；试剂3髓过氧化物酶抑制剂20～100μmol/L稳定剂1～100g/L防腐剂0.1～100g/L表面活性剂1～100ml/L。
2.根据权利要求1所述的测定髓过氧化物酶的试剂盒，其特征在于所述的缓冲液为 磷酸盐缓冲液、柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、GOOD ‘S缓冲液中的一种。
3.根据权利要求1所述的测定髓过氧化物酶的试剂盒，其特征在于所述试剂1中的 色原为苯酚、愈创木酚或3，5- 二氯-2-羟基苯磺酸钠。
4.根据权利要求1所述的测定髓过氧化物酶的试剂盒，其特征在于所述的髓过氧化 物酶抑制剂为4-氨基苯甲酰胼、4-羟基苯甲酰胼、4-氯苯甲酰胼、4-甲氧基苯甲酰胼或 3-甲氧基苯甲酰胼。
5.根据权利要求1所述的测定髓过氧化物酶的试剂盒，其特征在于所述的稳定剂为 多元醇、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白、甘露醇、二糖或多糖。
6.根据权利要求1所述的测定髓过氧化物酶的试剂盒，其特征在于所述的防腐剂为 2-甲基异噻唑酮盐酸、叠氮化合物或PC系列防腐剂。
7.根据权利要求1所述的测定髓过氧化物酶的试剂盒，其特征在于所述的表面活性 剂为吐温80、曲拉通X-100或乳化剂OP。
8.一种用于临床检测髓过氧化物酶的方法，其特征在于检测步骤如下(1)取试剂1与样本以一定比例混勻，孵育一定时间，加入试剂2，测定总过氧化物酶的 活力；(2)然后向步骤(1)的体系中加入试剂3，试剂3中的髓过氧化物酶抑制剂抑制了髓过 氧化物酶的活力，测定出此时非髓过氧化物酶的活力；(3)将步骤(1)操作所得的总过氧化物酶的活力减去步骤(2)所得的非髓过氧化物酶 的活力，即得出髓过氧化物酶的活力。
9.根据权利要求8所述的用于临床检测髓过氧化物酶的方法，其特征在于采用速率 法测定样本速率。
全文摘要
本发明公开一种用于临床检测髓过氧化物酶的试剂盒及其方法，属生物化学、检验试剂领域。本发明所提供的试剂盒由三试剂构成。本发明采用特异性高、抑制力强、抑制常数Ki低的髓过氧化物酶抑制剂抑制样本中髓过氧化物酶的活力，分别测定总过氧化物酶与非髓过氧化物酶的活力，两者之差即得髓过氧化物酶活力。本发明所提供的试剂盒具有检测成本低、需要样本量少、测定准确度高、操作简便、易于推广等优点。
文档编号C12Q1/28GK101914611SQ201010233190
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月21日 优先权日2010年7月21日
发明者胡治宝, 贾江花, 邹炳德 申请人:宁波美康生物科技有限公司