一种调控水稻株型的方法

专利名称：一种调控水稻株型的方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种分子设计方法调控水稻株型的方 法。本发明的方法是，通过特异表达基因OsTBl的启动子调控水稻OSa-miR156e基因或其 同源基因的表达，达到调控水稻株型的目的，利用该方法在转基因水稻和转基因水稻种子 中的应用，塑造水稻理想株型，提高水稻产量。
背景技术：
水稻作为重要的粮食作物，世界上三分之一以上的人口以其为主食。同时，由于 水稻具有基因组小、精细的遗传和物理图谱、相对容易的转基因技术及与其它禾本科作物 的共线性，而被视作基因组研究和遗传改良的模式植物。为解决人口增长与耕地面积减少 的矛盾，提高水稻单位面积产量仍是人们面临的严峻挑战。近年来，随着水稻功能基因组 研究的深入，许多控制水稻产量的功能基因被分离克隆，如Gnla(Ashikari等，Cytokinin oxidase regulates rice grain production. Science, 2005, 309 :741_745),GW2(Song等， A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3ubiquitin ligase. Nat Genet,2007, 39 :623_630), GS3(Fan 等，GS3, a major QTL for grain lengthand weight and minor QTL for grain width and thickness in rice, encodes a putative transmembraneprotein. Theor Appl Genet, 2006,112 1164-1171), Ghd7 (Xue 等，Natural variation in Ghd7 is animportant regulator of heading date and yield potential in rice. Nat Genet, 2008,40 :761_767),qSW5(Shomura等，Deletion in a gene associated with grain size increased yields during ricedomestication. Nat Genet, 2008, 40 1023-1028), GIFl(Wang Control of rice grain-filling andyield by a gene with a potential signature of domestication. Nat Genet, 2008, 40 :1370-1374),GW5(Weng等，solation and initial characterization of Gff5,a major QTL associated with rice grainwidth and weight. Cell Res, 2008,18 :1199_1209), 这些控制水稻产量的功能基因主要是通过控制穗形态和种子大小，表现出重大的育种应用 前景。然而，水稻产量性状的遗传改良取决于穗型、粒型、分蘖数、株型等一系列因素。株 型育种被认为是提高水稻产量的重要方法，50,60年代的矮化育种就是株型育种在提高产 量方面的一个很好的例子。早在1994年，国际水稻所(IRRI)提出了水稻理想株型育种， 即基于减少分蘖总数、提高成穗率、株型紧凑、塑造穗大粒多等等的一类新株型(NPT)的指 导思想(Khush G S. Breaking the yield frontier of rice. Geo Journal，1995，35 (3) 329-332)。我国的“水稻超高产育种计划”实质也离不开株型问题。水稻的单株分蘖数是影响水稻株型的重要因子，而在产量构成的三要素即穗数、 每穗粒数和粒重中，穗数的多少在很大程度上受制于分蘖的发生量，因而分蘖是影响水稻 和小麦等主要农作物单株产量的重要农艺性状之一。水稻分蘖是一个复杂的农艺性状。 一般认为，分蘖数目是受多基因控制的数量性状，其遗传力较低，光照、灌溉、肥料、温度等 都环境因素会对它有很大影响。在控制水稻分蘖基因鉴定方面，Wu等应用动态基因定位法在重组自交系群体中定位了 5个数量性状座位(quantitative trait locus, QTL) (ffu 等，Time-Related Mapping of Quantitative Trait Loci Underlying Tiller Number in Rice. Genetics, 1999,151 =297-303) 0至今已发现了大量的影响分蘖数目的数量性状 位点(QTLs)，但大部分只是初步定位，只有少部分克隆到基因。John Doebley等在1997 年利用转座子标签法分离到一个玉米主茎腋生分枝数相关基因TBI (John Doeb等，The evolution of apical dominance in maize. Nature, 1997,386 485~488 ；Martienssen R.， The origin of maize branches out. Nature，1997，386 :443.)。Schumacher K 等 1999 年 克隆到了控制番茄侧枝发生基因 LS(Schumacher 等，The lateral suppressor (LS) gene of tomato encodes a new member of the VHIID protein family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1999，96 :290_295)。2003年Greb T等克隆到拟南芥的侧枝抑制基因LAS(Greb 等，Molecular analysisof the LATERAL SUPPRESSOR gene in Arabidopsis reveals a conserved control mechanism for axillarymeristem formation. Genes Dev. ,2003,17 1175-1178.)。而水稻分蘖控制基因MOCl的克隆是近年来在植物形态建成特别是侧枝形 成研究领域中最重要的进展之一 (Li X et al.，Control of tillering inrice. Nature, 2003,422 :618-621)。此外，株高、穗大小、成穗率、分蘖角度、茎杆强度和叶片夹角等也是衡 量水稻等农作物株型的指标。小分子RNA是当今的一个研究热点，迄今为止在许多植物中都发现了编码miR156 的小分子RNA基因，该基因家族含有多个成员，如水稻oSa-miR156基因家族有12个成员 osa-miR156a-—osa_miR1561。同一 miRNA基因家族的成员其编码的成熟的小分子RNA 序列基本相同，且生物学功能也基本相同。研究表明，编码小分子RNA的基因miR156在 拟南芥、玉米、水稻生长发育过程中发挥着重要的作用。组成型超量表达miR156基因， 植株顶端优势变弱，花器官发育异常，花序(穗)变小，株高矮化，分枝增多，加速叶片生 长速度和叶片数量形成一个丛生的表型，延缓生长发育过程，推迟开花等(Schwab R et al.，Specificeffects of microRNAs on the plant transcriptome. Dev Cell,2005, 8 :517_527 ；Chuck G et al.，The heterochronic maize mutant Corngrassl results from overexpression of a tandem microRNA. NatGenet，2007，39 :544_549 ；Xie et al. ， Genomic organization, differential expression, andinteraction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors and microRNA156 in rice. Plant Physiol，2006，142 :280_293)。由此可见，miR156基因在调控植物的株型方面发挥了重要 作用。虽然OSa-miR156e基因超量表达可以提高水稻的分蘖数，但是分蘖数太多 不能形成理想的株型，组成型表达oSa-miR156e基因同时还会影响水稻的穗型和育 性，过量表达OSa-miR156e基因会使水稻穗型变小，育性降低甚至不育，从而造成减产 (Xie et al. , Genomic organization, differential expression, andinteraction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors and microRNA156 in rice. Plant Physiol, 2006,142 =280-293) 本发明通过特异性表达基因OsTBl的启动子驱动 OSa-miR156e的表达，可以增加水稻植株的有效分蘖数，优化水稻株型，进而提高单株产量。水稻OsTBl基因是控制分蘖的一个重要基因(Takeda T et al.，The OsTBl gene negatively regulateslateral branching in rice. Plant J，2003，33 :513_520)。OsTBl基因是通过与玉米的分枝基因TBl的序列同源性比较而分离克隆的(Jchh Doebley et al. , The evolution of apical dominance in maize. Nature,1997,386 :485_488 ; Martienssen R. , The origin of maize branches out. Nature, 1997, 386 :443),它们都编 码一个预测的转录因子含有一个DNA结合模体basic helix-loop-helix type也称为TCP domain。超量表达OsTBl导致水稻分蘖数急剧下降，基本不产生分蘖，或只有1_2个分蘖， 但是剥开叶片能看到茎节上的腋芽，说明腋芽的形成没有受到影响，只是不能伸长形成正 常的分蘖。OsTBl基因的突变体fine culm l(fcl)植株表型发生显著变化，分蘖数明显增 多，是正常水稻分蘖数的3倍以上。OsTBl基因的突变体fcl和正常的野生型水稻一样分蘖 数也受种植密度的影响。该基因是一个特异表达基因，主要在腋芽中表达，另外在茎顶端生 长点基部，茎髓的维管组织和叶片连接处的维管组织也有表达。为了深入开发miR156基因在调控水稻株型中的作用，培育理想株型的水稻品种， 本发明利用OsTBl基因的启动子特异表达模式调控水稻OSa-miR156e基因或其同源基因 的表达模式来改良水稻的重要农艺性状，如分蘖数，株高，穗大小，结实率，成穗率等农艺性 状，达到改良水稻株型的目标。本发明采用分子设计育种的方法调控水稻株型，有望在水稻 株型育种中应用，塑造理想株型，达到增产的目的。

发明内容
本发明的目的是在于提供了一种利用分子育种技术调控水稻株型的方法，在水稻 育种中应用侧生分生组织特异表达基因OsTBl启动子调控水稻OSa-miR156e基因或其基因 家族的其它同源基因的表达模式达到调控水稻株型的目的。本发明的另一个目的是将上述方法在在转基因水稻作为调控水稻株型的应用。本发明采用分子设计育种的方法改良水稻株型，有望在水稻株型育种中应用，塑 造理想株型，达到增产的目的。实现本发明的简要过程如下1、构建OsTBl启动子驱动osa_miR156e基因的载体pTBl:156e本发明所用的特异表达基因OsTBl的启动子，主要在腋芽中表达，另外在茎顶端 生长点基部，茎髓的维管组织和叶片连接处的维管组织也有表达(Takeda等，The OsTBl gene negatively regulates lateralbranching in rice.Plant J，2003，33 :513_520)。 已知水稻osa-miR156基因家族有12个成员osa_miR156a-—osa_miR1561，本发明选其中的 一个成员osa-miR156e基因(其DNA序列见SEQ ID NO :2所示，序列长度为390bp)将其构 建到PCAMBIA1300 vector载体上(见图1)。再将水稻基因OsTBl的启动子(其DNA序列见SEQ ID NO :1所示，序列长度为 2779bp)通过酶切和连接的方法构建到遗传转化载体中。申请人:将构建好的载体命名为pTBl: 155e。2、遗传转化采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Wu等，Development of enhancer trap lines for functionalanalysis of the rice genome. Plant J, 2003, 35 :418_427)。^！夺上 述pTBl:156e载体导入到水稻品种“中花11”中。遗传转化结果共得到40株转化(转基 因)苗(见图2)。
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3. OsTBl启动子调控下的osa_miR156e基因的表达情况用 stem-loop RT-PCR 的方法(Chen等，Real-time quantification of microRNAs by stem-loopRT-PCR. Nucleic Acids Res，2005，33 :el79)检测 OsTBl 启动子调控下的 osa-miR156e基因的表达情况，结果发现OSa-miR156e在转基因水稻植株所有部位都有提 高，但以叶鞘，茎，分蘖芽中的表达量提高比较明显(见图3)。4、对水稻株型的改良和应用从所有转基因植株中挑选出表型最好的1个TO代单株种植下一代。在不同的种 植密度下考察转基因水稻单株的分蘖数和产量等农艺性状。发现OSa-mirl56e基因组成型 表达的水稻分蘖数目太多，无效分蘖多，植株矮，穗短，着粒稀，结实率低，产量下降，而经过 OsTBl启动子特异表达OSa-miR156e基因后，相比组成型表达OSa-miR156e基因的植株分蘖 数减少，但无效分蘖明显减少，株高变高、穗变大、结实率提高，整体株型得到改善，产量也 显著提高(图4)。本发明的优点和效果1、首次通过特异表达基因OsTBl的启动子调控水稻oSa-miR156e基因，或其基因 家族的其它同源基因，或其功能类似物的表达模式，来调控水稻株型。2、本发明采用分子设计育种的方法改良水稻株型，有望在水稻株型育种实践中应 用，塑造理想株型，达到增产的目的。


序列表SEQ ID NO 1是本发明克隆的水稻基因的OsTBl启动子，其DNA序列长度 为 2779bp。序列表SEQ ID NO :2是本发明克隆的osa_miR156e基因，其DNA序列长度为 390bp。图1.是报道的pCAMBIA1300载体(质粒)图。图2.转pTBl:156e的植株株型出现明显的改变，图中a_g是不同转基因植株株 型出现不同程度的改变，h为分蘖情况对比，i为穗大小对比，所有图片左边为对照“中花11 号”，右边为本发明获得的转基因植株。图3、采用stem-loop RT-PCR的方法检测OsTBl启动子调控下的osa_miR156e基 因的表达情况，结果发现OSa-miR156e在转基因植株的所有部位都有提高，以叶鞘，茎，分 蘖芽中的表达量提高比较明显。图4、本发明的转基因植株农艺性状考种结果，图4A-G为3种不同密度条件下种植 结果。图4A 株高(cm)；图4B 单株分蘖数；图4C 穗长(cm)；图4D 单株产量，单位克； 图4E 每穗颖花数；图4F 育性；图4G 单株有效穗数。X轴数字代表种植密度(cmXcm)。
具体实施例方式实施例1.构建水稻基因OsTBl启动子驱动osa_miR156e基因的载体pTBl: 156emiR156组成型表达对水稻株型有重要影响分蘖数大量增加，植株变矮，抽穗变 迟，穗变小等，结实率降低，产量下降。本发明通过特异表达启动子驱动miR156在侧生分生 组织等部位表达，希望提高水稻分蘖能力，而对其他性状没有影响，达到改良株型的目的，进而应用于水稻育种实践。所用的特异表达基因OsTBl的启动子，主要在腋芽中表达，此外在茎顶端生长点 基部，茎髓的维管组织和叶片连接处的维管组织也有迹量表达。水稻osa-miR156 基因家族有 12 个成员 osa_miR156a-—osa_miR1561，选其中的 osa-miR156e 基因构建到 pCAMBIAUOO vector 上(图 1)。PCR扩增引物如下(为了对片段克隆，在引物中加入了相应酶切位点，引物的下划 线部分是酶切位点)TEV-L(SalI) 5' CTTGTCGACactggcaagactatcagaattc 3，，TER-R(SphI) :5， gccaagcttGCATGCctgcag 3，。PCR反应体系的总体积为 50 μ l，pUmiR156e质粒(Xie 等，Genomic organization, differentialexpress ion, and interaction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors andmicroRNA156 in rice.Plant Physiol,2006,142 280-293) 1 μ 1(约lOOng)作为PCR扩增的模板，LA Taq酶0. 5 μ 1 (购自宝生物工程(大连) 有限公司)，2XGC buffer I 25 μ l,2mM dNTP 8 μ l、10uM 引物各 2 μ 1、加 ddH20 至 50 μ 1。反应程序为94°C变性5min，94°C 45s、55°C 45s、72°C lmin、33 cycles，72°C延伸 7min,扩 2 管。扩增片段纯化回收收集PCR产物于1. 5ml离心管纯化，加等体积24 1氯仿异 戊醇，轻摇5分钟，12000rpm离心15分钟，吸上清，加2倍体积95%乙醇，1/10体积3M醋酸 钠(PH5. 2)，_20°C放置30分钟，12000rpm离心20分钟，弃上清，加500μ1 75%乙醇放置 5min，12000rpm离心5分钟，弃上清，晾干，加75 μ 1 ddH20溶解。酶切和纯化回收将纯化的PCR产物及pC1300载体酶切，体系总体积100 μ 1， PCR产物或载体质粒75μ1，限制性内切酶Sail 30U，限制性内切酶SphI 30U，10XH buffer 10μ 1，加ddH20到100μ 1，37°C酶切5小时。纯化酶切产物，方法同上，最后加10μ 1 ddH20溶解。连接反应10μ1 PCR酶切纯化产物全部用于连接反应，载体0.5μ l，2u T4 ligase，5Xbuffer 3 μ 1，总15 μ 1体积，连接24小时。取1 μ 1连接产物，电压1800V，电 转化到大肠杆菌DH10B，加800 μ 1 LB,复苏45分钟，取200 μ 1涂于含卡那霉素的LA平板， 37°C，过夜。挑单克隆，扩大培养抽质粒，酶切验证结果正确，酶切方法同上。PCR验证，体系 程序同上。挑阳性克隆抽质粒备用。再把OsTBl启动子插入到上面构建好的载体中，方法如下PCR扩出OsTBl启动子区2779bp长的DNA片段，PCR扩增引物如下(为对片段克隆，在引物中加入了相应酶切位点，引物的下划线 部分是酶切位点)OsTBlS(SalI) 5' CTTGTCGACgcgttgctgctgctactgct 3，，OsTBlA(SacI) :5， CTTGAGCTCccttcgacgagacgatgacg 3，。PCR反应体系的总体积为50 μ 1，日本晴水稻BAC a0041G12质粒1 μ 1 (约IOOng)、 LA Taq 酶 0. 5μ l(Takara 公司)、2XGC bufferl 25 μ l,2mM dNTP 8 μ l、10uM引物各 2 μ 1、 加 ddH20 至 50 μ 1。
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反应程序为94°C变性5min，94°C 45s、60°C 70s,72°C 3min、33cycles，72°C延伸 7min，扩增2管。PCR产物纯化回收方法同上。酶切和纯化同收把纯化的PCR产物及上面构建好的载体酶切，反应体系总体 积100 μ 1，PCR产物或载体质粒75 μ 1，限制性内切酶Sail 30U,限制性内切酶SacI 30U， IOXT buffer 15 μ 1, BSA 10 μ 1，加 ddH20 到 100 μ 1，37°C 酶切 5 小时。纯化酶切产物，方 法同上，最后加IOyl ddH20溶解。连接反应10μ1 PCR产物全部用于连接反应，载体0. 5μ1，2υ Τ4 ligase, 5Xbuffer 3 μ 1，总15 μ 1体积，连接24小时。取1 μ 1连接产物，电压1800V，电转到大 肠杆菌DH10B，加800 μ 1 LB，复苏45分钟，取200 μ 1涂于含卡那霉素的LA平板，37°C，过 夜。挑单克隆，扩大培养抽质粒，酶切验证，酶切方法同上。PCR验证，体系程序同上。挑阳 性克隆，把构建好的载体电转农杆菌EHA105，抽质粒，PCR验证，挑选正确克隆，取750 μ 1 含构建好载体的农杆菌菌液加等体积的50%甘油混勻，-70°C保存。构建好的载体命名为 pTBl:156e。由本实验室测序验证测序引物为TEV :5，cgaatc tcaagc aatcaa gcat 3，。测序 结果完全正确，测序序列如下GGAGGCAACCCGCTGGGGGGGCCCTCATGCGCATTTAATCATTTCTTTTAAGCAAAAGCAATTTTCTGA AAATTTTCACCATTTACGAACGATAGCCGGTACCTAAATCCACTGGCCGGTGGACCGGTCCGGTGTGCACGCCTCAGCTTCTCGACCGCGA TCCGTCGCCGTGTGGTTGGTGTACGTTGCGGTCTCTTCACGCGCTCGCGCGCGCGGCGAGGTATGTGTGTGTCCGCGGGTTTCATCGTGGG GGTGTGAGCTAGCTAGCTAGGCGAGCGTGAGTGGGTGTGGAGGATGGCGGTGTCTCCGGCCGGCGGGCGGGCGGGCCGGTGGCGCGAGGTG ACAGAAGAGAGTGAGCACACGGCCGGGCGTGACGGCACCGGCGGGCGTGCCGTCGCGGCCGCGTGCTCACTGCTCTTTCTGTCATCCGGTG CCGGCCGTTTTCTCCCCCTCCCGCGGCTAGCTAAGCTGGCCTCTCGGCCCCTCGCCGGCCGGCCGGTCGCTGACGGAATCCCCTGTACTGC TCCGCGCGCCATGAGCTGTTCC GAGTCTCTAGGCTCTTTAGATTAATTCGATCCCCTCTTCTCCGGCGCAATCGTGCATAGGCGCAGTTGC CAGGGGATCCTCTAGAGTCCGCAAAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTCTATTTTTCTCCAGAATAATGTGTGAGTAGTT CCCAGATAAAGGGAATTAGGGTTCTTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATAC TTCTATCAATAAAATTTTCTAAATTCCTAAAACCAAAAATCCAGTGACCTGCCAGGCAATGCAAGCTTTGCCATGCCTTGCAGGTTCGACT CTAGCAGGCAGCAGGCATCATTCAATATTCTGATTCCTTAAATTTAAGATACGAGCAGGCCATGACAGTCCCTTCTGGAAAGTTACAACCC CCTTGAAGTCTAAACAGGTCAACCAAGTTACCACAGAAGTTAGGCAAAAGGCCGAATTCCGGAATTCGGCCATATCCAACAATGGCATTGA
8GGCGAATTCGTAAATCCATGGTCCATAAGCCGTGATCCTCGGTGTGGAAGAAGTCTGTATGATACCGmiRNA基因是一种不编码蛋白质的基因，不需要通过蛋白质行使功能，它通过自身 转录的RNA剪切出成熟的小RNA分子行使功能。实施例2.遗传转化和OsTBl启动子调控下的osa-miR156e基因的表达采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Wu等，Development of enhancer trap lines forfunctional analysis of the rice genome. Plant J, 2003,35 :418_427)将 pTBl: 156e载体导入水稻品种“中花11”上。1)愈伤诱导(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0. 15%氯化汞15 分钟；(2)灭菌水洗种子4-5次；(3)将种子放在诱导培养基上；(4)置于黑暗处培养5周，温度25-27°C。2)愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温 度 25-27 0C ο3)预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度 25-27 °C。4)农杆菌培养(1)在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA105两天，温 度 28 0C ；(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28°C摇床上培养2-3小时。5)农杆菌侵染(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；(2)调节农杆菌的悬浮液至OD6tltl 0. 8-1. 0 ；(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度 19-20 "C。6)愈伤洗涤和选择培养(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；(2)浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30分钟；(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。筛选标记为潮霉素。(抑制 农杆菌用头孢霉素，第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)。7)分化(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天；(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(20001x)下培养，温度26V，5-7 周。8)生根(1)拔出分化好的幼苗，剪掉分化时产生的根；(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26°C。9)移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的儿天保 持水分湿润。遗传转化结果共得到转化苗40株。转pTBl:156e的水稻植株株型出现明显的改变，如分蘖数，株高，穗大小等都出现 变化。株型的改变程度有强有弱，展现出与OSa-miR156e基因表达量的剂量强度的相关性 (见图2)。OsTBl启动子调控下的osa-miR156e基因的表达情况用stem-loop RT-PCR的方法检测OsTBl启动子调控下的osa_miR156e基因的表 达情况，结果发现oSa-miR156e在所有部位都有提高，但在叶鞘，茎，分蘖芽中的表达量提 高比较明显(图3)。实施例3.转pTBl 156e的水稻植株对株型的改良和应用在所有转pTBl 156e的转基因植株中挑选出表型最好的1个TO代单株种植下一 代。在不同的种植密度下考察单株的分蘖数、产量等农艺性状(图4)。种植设计种植材料选取1个单拷贝株系，对照种为ZHll及组成型超表达oSa-miR156e植 株种植密度3种(1)稀植8 寸 X8 寸(26. 7cmX26. 7cm)(2)正常密度5 寸 XX8 寸(I6· 7cmX26. 7cm)(3)密植5 寸 X5 寸(16. 7cmX16. 7cm)每个小区种植3-5行，每行10株。2个试验重复。考种取小区中间一行的第3 到第7株，连续取5株。考察性状的方法株高单株最高穗颖尖到地面的高度单株有效穗数单株每穗实粒数超过5粒的穗数每穗实粒数株实粒数除以单株有效穗数穗长从穗颈节到穗颖尖的单株平均穗长结实率株总实粒数除以单株总颖花数乘以100%每穗颖花数株总颖花数除以单株有效穗数穗着粒密度颖花数除以平均穗长千粒重单株实粒重除以单株实粒数再乘以1000单株产量单株全部实粒重实施结果如下相比组成型超表达OSa-mirl56e，在pTBl特异性启动子驱动下对水稻株型有明 显的改良。OSa-mirl56e组成型表达植株的分蘖数目太多，无效分蘖多，植株矮，穗短， 着粒稀，结实率低，产量下降。而经过OsTBl启动子特异表达后，虽然单株分蘖数下降从109. 10个降至32. 80个，但比野生型(未转基因)单株的分蘖数明显增多。相比组成型 表达osa-mirl56e的植株，转化pTBl 156e植株无效分蘖少，株高变高从62. 65cm提高到 94. 28cm ；穗变大，每穗粒数从9. 40粒增加到73. 04粒；结实率的提高从59. 46%提高到 85. 69% ；整体株型得到改善，单株产量从11. 02克提高到51. 41克(见图4)。由此可见， 通过侧生分生组织特异表达基因OsTBl的启动子驱动OSa-miR156e的转基因方法，是一条 有效改良水稻株型的策略，具有提高水稻产量的潜力。相比野生型(未转基因)水稻品种“中花11”，在种植密度为26. 7cmX26. 7cm的 条件下，转pTBl:156e的植株分蘖数明显增多，由平均每株分蘖数21. 50个提高到了 32. 80 个(图4)，但平均单株产量为51. 41g，比野生型水稻品种“中花11”的57. 87g略有降低。 分析其原因，主要是在该统一密度的种植密度下，转pTBl:156e的植株由于分蘖数增多，单 株获得的水肥、光照条件不够，导致其穗长变短，每穗粒数急剧下降。由于转pTBl:156e的 植株具有明显增加水稻有效分蘖数的效果，且植株结实率基本正常，因此在合理的稀植和 水肥条件下，转pTBl: 156e的植株的增产效果将更加明显。附录农杆菌介导的遗传转化试剂和配方(1)试剂和溶液缩写6-BA(6-BenzyIaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)； NAA (Napthalene aceticacid,萘乙酸)；IAA(Indole-3_acetic acid,吲哚乙酸)；2， 4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二tti fi ZiSI) ；AS (Acetosringone, ΖλΜ 香酮)；CH (Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)； DMSO (Dimethyl S μ lfoxide，二甲基亚砜)；N6max (N6 大量成分溶液)；N6min (N6 小量成分 溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmin (MS小量成分溶液)(2)组织培养的溶液配方l)N6max 母液[10 倍浓缩液(IOX)]
0130]硝酸钾(KNO3)28. 3g
0131]磷酸二氢钾(KH2PO4)4. Og
0132]硫酸铵((NH4)2SO4)4. 63g
0133]硫酸镁(MgSO4· 7H20)1. 85g
0134]氯化钙(CaCl2· 2H20)1. 66g
0135]逐一溶解，然后在20-25°C下定容至1000ml。
0136]2)N6min 母液[100 倍浓缩液(100X)]
0137]碘化钾(KI)0. 08g
0138]硼酸(H3BO3)0. 16g
0139]硫酸锰(MnSO4· 4H20)0. 44g
0140]硫酸锌(ZnSO4· 7H20)0. 15g在20_25°C下溶解并定容至1000ml。3)Fe2EDTAC存液(100X)在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO4 · 7H20) 2. 78g在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70°C，然后加入乙二铵四乙酸 钠(Na2EDTA · 2H20) 3. 73g
田在它们都溶解后混合在一起，70°C水浴中保持2小时，定容至1000ml，4°C保存备Ztj。
4)维生素贮存液(100X)
烟酸(Nicotinic acid)0. Ig
维生素 Bl (Thiamine HCl)0. Ig
维生素 B6(Pyridoxine HCl)0. Ig
甘氨酸(Glycine)0. 2g
肌醇(Inositol)IOg
加水定容至1000ml，4°C保存备用O
5) MSmax 母液(IOX)
硝酸铵(NH4NO3)16. 5g
硝酸钾19. Og
磷酸二氢钾1.7g
硫酸镁3. 7g
氯化钙4. 4g
在20-25°C下溶解并定容至1000ml。
6) MSmin 母液(100X)
碘化钾0. 083g
硼酸0. 62g
硫酸锰(MnSO4 · 4H20)2. 23g
硫酸锌(ZnSO4 · 7H20)0. 86g
钼酸钠(Na2MoO4 · 2H20)0. 025g
硫酸铜(CuSO4 · 5H20)0. 0025g
氯化钴(CoCl2 · 6H20)0. 0025g
在20-25°C下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-D 贮存液(lmg/ml)
2,4-D lOOmg.
Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25 °C下保存。
8)6-BA 贮存液(lmg/ml)
6-BA IOOmg.
Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25 °C下保存。
9) NAA 贮存液(lmg/ml)
NAA IOOmg.
Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4°C保存备用。
10) IAA 贮存液(lmg/ml)
IAA IOOmg.
Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4°C保
存备用。
0181]11)葡萄糖贮存液(0. 5g/ml)
0182]葡萄糖 125g
0183]蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4°C保存备用。
0184]12) AS 贮存液
0185]AS0. 392g
0186]DMSOIOml
0187]分装至1. 5ml离心管内，4°C保存备用。
0188]13) IN氢氧化钾贮存液
0189]氢氧化钾 5.6g
0190]蒸馏水溶解定容至100ml，在20-25 °C下保存备用。
0191]14)KT 贮存液(lmg/ml)
0192]KT IOOmg.
0193]Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在 20-25 °C下保存。(3)培养基配方
1)诱导培养基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2EDTA 贮存液(100X)IOml
维生素贮存液(100X)IOml
2，4-D贮存液2. 5ml
脯氨酸(Proline)0. 3g
CH0. 6g
蔴糖(Sucrose)30g
Phytagel3g
加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)继代培养基
N6max 母液(IOX)100ml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)IOml
维生素贮存液(100X)IOml
2，4-D贮存液2. Oml
脯氨酸0. 5g
CH0. 6g
蔗糖30g
Phytagel3g
加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸(100°C )并定容至1000ml， 分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。


3)预培养基 N6max 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 贮存液(100X) 维生素贮存液(100X)
12. 5ml
1.25ml 2. 5ml
2.5ml
2，4-D贮存液
CH
蔗糖
琼脂粉(Agarose)
0. 75ml 0. 15g 5g
1.75g
加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。 使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 μ 1 AS贮存液，分装倒入
培养皿中(25ml/皿)
4)共培养基 N6max 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 贮存液(100X) 维生素贮存液(100X)
12. 5ml
1.25ml 2. 5ml
2.5ml
2，4-D贮存液 CH 蔗糖 琼脂粉
0. 75ml 0. 2g 5g
1.75g
加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。 使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 μ 1 AS贮存液，分装倒入
培养皿中(25ml/皿)
5)悬浮培养基 N6max 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 贮存液(100X) 维生素贮存液(100X) 2，4-D贮存液 CH 蔗糖
5ml 0. 5ml 0. 5ml Iml 0. 2ml 0. 08g 2g
加蒸馏水至100ml，调节pH值到5. 4，分装到两个IOOml的三角瓶中，封口灭菌。 使用前加入Iml葡萄糖贮存液和100 μ 1 AS贮存液。 6)选择培养基
N6max 母液(IOX)25ml
N6mix 母液(100X)2. 5ml
1413/14 页MSmax 母液(IOX)50mlMSmix 母液(100X)5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)5ml维生素贮存液(100X)5ml蔗糖20gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 8。煮沸(100°C )并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。10) LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)蛋白胨2. 5g酵母粉1. 25g氯化钠2. 5g琼脂粉3.2g蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后20_25°C保存备用。
权利要求
一种调控水稻株型的方法，其特征在于，利用特异表达基因OsTB1的启动子调控水稻osa miR156e基因的表达模式，通过农杆菌介导的转化方法，实现控制水稻株型的目的，所述启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，所述osa miR156e基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO2所示。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及一种利用分子设计调控水稻株型的方法，本发明的特征是，通过特异性表达基因OsTB1的启动子调控水稻osa-miR156e基因，或其基因家族的其它同源基因osa-miR156a-osa-miR156l的表达模式达到调控水稻株型的目的。本发明所述的启动子的DNA序列如SEQ ID NO1所述。osa-miR156e基因的DNA序列如SEQ ID NO2所述。本发明采用分子设计育种的方法调控水稻株型，有望在水稻株型育种中应用，塑造理想株型，提高水稻产量。
文档编号C12N15/113GK101928726SQ20101023420
公开日2010年12月29日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者吴昌银, 张启发, 陈志辉 申请人:华中农业大学