专利名称：一个编码冰缘植物冷诱导蛋白的基因及其在抗寒转基因烟草中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个编码冰缘植物冷诱导蛋白的基因，特别是涉及一个编码高山离子 芥冷诱导的DEAD-b0X RNA解旋酶的基因，及其在抗寒转基因烟草中的应用。
背景技术：
DEAD-box RNA解旋酶存在于从原核的细菌到真核的动植物的绝大多数生物中。这 些蛋白能够利用ATP水解释放的能量改变RNA的次级结构或者移走绑定的蛋白，从而帮助 RNA形成正确的折叠形式。DEAD-box RNA解旋酶参与很多的RNA代谢过程，包括转录，前体 RNA的剪切，核糖体生物发生，RNA出核运输，翻译起始，细胞器基因表达，RNA降解等多种生 理过程(Rocak S andLinder P，2004，Nature Rev. Mol. Cell Biol.)。在模式植物拟南芥 中，DEAD-box RNA解旋酶基因组成一个含有58个成员的家族，即AtRHl_AtRH58 (Aubourg S,Kreis M, et al，1999，Nucleic Acides Research)。近年来，人们发现 DEAD-box RNA 解 旋酶参与高等植物胁迫应答，包括低温胁迫，热胁迫，盐胁迫，渗透胁迫以及氧化胁迫。例如 已经发现拟南芥DEAD-boxRNA解旋酶FL2-5A4，PMH1，PMH2,以及大麦DEAD-box RNA解旋酶 HVD1在低温胁迫下表达量增高，在烟草中过表达一个DEAD-box RNA解旋酶PDH45增强了 烟草的耐盐性(Sanan-Mirshra N, Pham X H, Sopory S K, et al，2005，Proc. Natl Acad. Sci.) 0高山离子芥(Chorispora bungeana)是十字花科离子芥属多年生植物，分布在高 海拔亚高山草甸和砾石质山坡上。其生存环境的特点是气候寒冷、土层反复冻融，空气稀 薄、辐射强、劲风。高山离子芥在外部形态结构和生态策略上没有显著的抗性特征，为了耐 受长期低温、反复冻融，强紫外、大风等不利的环境条件，势必通过表达抗性基因来维持自 身的生理代谢和生长发育，以避免或减轻严酷的环境胁迫的危害。因此高山离子芥是理想 的研究植物抗性的的材料。为探索高山离子芥适应低温胁迫的内在机制，本实验室利用蛋白质组学的方法， 分析高山离子芥在低温胁迫(0°c )和常温(20°C )下的蛋白表达差异。用TCA-丙酮法 分别提取无菌苗的总蛋白，进行双向电泳，对凝胶进行胶体考染并脱色，利用PDQUEST8. 0 软件对电泳结果进行分析，发现其中一个蛋白在低温胁迫下(0°C)积累量是正常条件 (20°C )的7倍，质谱分析表明该蛋白属于DEAD-box RNA解旋酶家族，我们将该蛋白命名为 CbDRH(Chorisporabungeana DRH, CbDRH)。我们利用 RACE 技术，获得编码 CbDRH 基因全 cds 区。序列比对分析表明CbDRH与拟南芥AtRH30同源性最高，达90%。目前，在拟南芥中还 未见到关于AtRH30功能的报道。克隆该基因并应用到转基因植物上对于培育抵抗低温的 优良作物具有一定的价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种高山离子芥DRH冷诱导蛋白基因及其编码产物。本发明的另一目的提供高山离子芥DRH冷诱导蛋白基因在抗冻转基因烟草中的应用。(a) 一种高山离子芥 DRH(Chorispora bungeana DRH,CbDRH)基因编码序列，该基 因包含1452个核苷酸，编码484个氨基酸，其分子量为52. 66KD。其核苷酸序列为序列表中 序列(a)所述，以下为核苷酸序列。ATGAGCTCCTATGATCGTAGATTTGCTGATCCGAATTCGTATCGCCAACGCTCTGGCGCCCCAGTTGGTCCATCTCAGCCAATGGATCCTTCTGCTGCACCGTACAATCCACGATACGGTGGTGGTGGTGGATATGGACCGTCTCCTGTAATGGCCGGTGATGGCTCCGGGTATAGTCGGTACCCAGCTTTCCAGCCACCTACTAGTGGTTTCTCCGTTGGTCGCGGCGGAGGAGGAGGAAGAGGCACATATGGTCAATACGGC
GGCGGAGGAGGCGGCGGCAGTGGTGGGAATTGGGGAGGACGTGGTGGTGGATCGAATAAAAGAGAGCTAGATAATGTTTCGCTTCCGAAGCAGAATTTTGGGAATCTTGTCCATTTCGAGAAGAATTTCTACGTGGAAAGCCCCGATGTGCAGGCGATGACAGAACAGGATGTTGCGATGTATAGAACCGGGAGGGATATATCCGTTGAAGGTCGTGATGTTCCTAAGCCGATTAGGATGTTCCAAGATGCTAACTTCCCAGATAATATTCTCGAAGCGATTGCTAAGTTGGGATTCACTGAGCCAACACCGATACAATCTCAGGGATGGCCAATGGCTTTGAAGGGTAGGGATCTGATTGGTATTGCTGAGACTGGCTCTGGTAAGACATTAGCTTACTTGTTACCAGCGTTGGTCCACGTAAGCGCACAACCTCGATTGAGTCAAGATGATGGCCCCATTGTGTTAATATTAGCGCCCACTAGAGAATTAGCTGTTCAGATTCAAGAGGAATCAAGGAAATTCGGTCTGCGATCTGGTGTTAGAAGCACTTGTATCTATGGTGGTGCTCCTAAAGGACCTCAGATTCGCGATCTTAGAAGAGGTGTTGAGATTGTAATTGCTACACCTGGTCGTTTGATCGATATGTTGGAGTGTCAACATACTAATTTGAGGAGAGTAACTTACCTCGTGTTAGATGAAGCTGACCGAATGTTAGACATGGGATTTGAACCCCAAATTAGAAAGATTGTATCTCAGATCCGACCTGATAGACAGACGCTGCTTTGGAGT6CAACATGGCCACGAGAGGTTGAATCTCTTGCCAGGCAGTTTCTACGAGATCCATATAAGGCCATTATTGGATCAGCAGATCTAAAAGCTAACCAGTCTATTAATCAAGTAATCGAGATTGTACCAACGCCAGAGAAATACGCCAGGCTTCTTGCACTGCTTAAACAGTTAATGGATGGGAGTAAAATCCTAATATTCGTGGAGACAAAGAGAGGGTGTGATCAAGTGACTAGACAATTGAGAATGGATGGATGGCCAGCTCTAGCCATACACGGTGACAAGAACCAATCGGAAAGAGATCGAGTCTTGTCAGAATTTAAGAGCGGAAGAAGCCCGATAATGACTGCCACTGATGTAGCAGCAAGGGGACTTGGTAGGACAACTGTAACACAATAG(b) 一种高山离子芥DEAD-box RNA解旋酶(CbDRH)蛋白的氨基酸序列，该氨基酸 序列包含DEAD-box蛋白家族特征性的八个保守基序，因此属于DEAD-box蛋白家族成员。 CbDRH氨基酸序列如序列表中序列2所述，以下为氨基酸序列。MSSYDRRFADPNSYRQRSGAPVGPSQPMDPSAAPYNPRYGGGGGYGPSPVMAGDGSGYSRYPAFQPPTSGFSVGRGGGGGRGTYGQYGGGGGGGSGGNWGGRGGGSNKRELDNVSLPKQNFGNLVHFEKNFYVESPDVQAMTEQDVAMYRTGRDISVEGRDVPKPIRMFQDANFPDNILEAIAKLGFTEPTPIQSQGWPMALKGRDLIGIAETGSGKTLAYLLPALVHVSAQPRLSQDDGPIVLILAPTRELAVQIQEESRKFGLRSGVRSTCIYGGAPKGPQIRDLRRGVEIVIATPGRLIDMLECQHTNLRRVTYLVLDEADRMLDMGFEPQIRKIVSQIRPDRQTLLWSATWPREVESLARQFLRDPYKAIIGSADLKANQSINQVIEIVPTPEKYARLLALLKQLMDGSKILIFVETKRGCDQVTRQLRMDGWPALAIHGDKNQSERDRVLSEFKSGRSPIMTATDVAARGLGRTTVTQ.本发明中的cbDRH基因和拟南芥AtRH30的DNA序列具有90%同源性，推测编码相 似功能蛋白质，蛋白序列的同源性也为90%。
本发明序列(a)的DNA序列有1452个碱基组成，编码序列表中由483个氨基酸残 基组成的蛋白质序列(b)。双向电泳检测到CbDRH蛋白在低温胁迫下(0°C)积累量是正常 条件(20°C )的7倍。含有本发明基因CbDRH的表达载体及细胞系也在本发明的保护范围之内。利用 PCR技术得到CbDRH基因全cds区，并在两端分别引入Smal和Xbal酶切位点，连接到克隆载 体PMD18-T上，用Smal和Xbal在37°C酶切过夜，回收目的基因片段。将带有35s启动子的 PBI121质粒用同样的方法酶切过夜，并回收酶切产物。将回收的目的基因与回收的PBI121 载体用T4 DNA连接酶于20°C连接过夜，次日将连接体系转化大肠杆菌DH5_a，菌落PCR筛选 阳性克隆并送去测序，经测序鉴定正确的克隆为含有真核表达载体PBI121-35s-CbDRH的 克隆。提取质粒PBI121-35s-CbDRH，通过转化农杆菌LBA4404即得到含有该表达载体的农 杆菌菌株。利用农杆菌介导的转化，将表达载体转入烟草，经过筛选获得组成型表达CbDRH 基因的转基因烟草。检测转基因植株的抗低温能力，结果表明转基因植株的抗低温能力远 大于野生型。在冷胁迫下，转基因烟草的叶绿素含量高于对照，同时，转基因烟草比对照积 累更多的脯氨酸；在短时间冻胁迫(_4°C处理12小时)下，转基因烟草的质膜渗漏率小于 对照。
图1示低温处理前后转CbDRH基因烟草TL3和野生型对照生长状态。a为25°C生 长状态，b为_4°C，处理12hours后生长状态。WT 野生型对照；TL3 转基因植株。图1显 示转入CbDRH基因的烟草在低温下生长状态明显好于野生型对照。-4°C处理12hours，野生 型对照烟草已经萎蔫，而转基因植株生长状态良好。图2示低温处理前后转CbDRH基因植株TL3和野生型对照的质膜离子渗漏率变 化。WT 野生型对照；TL3 转基因植株。25°C下转基因TL3植株的质膜离子渗漏率与野生型 无明显变化；4°C处理3天转基因植株TL3的质膜离子渗漏率与野生型亦无明显变化；_4°C 处理12hoUrs后，野生型对照植株的质膜离子渗漏率是转基因植株TL3的3倍。显示-4°C 低温下野生型对照植株受到的伤害远大于转基因植株。
具体实施例方式在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为高山离子芥(Chorisporabungeana) 禾口烟草(Nicotiana tabacum)。实施例1高山离子芥CbDRH基因克隆1.高山离子芥CbDRH基因3，端扩增1.1.利用Trizol法分离0°C处理一周的高山离子芥叶片中总RNA，其具体方 法是将高山离子芥叶片0. 05g放入研钵，加液氮覆盖材料，迅速用力研成粉末，加入 lml Trizol，研磨至溶化，转移到灭菌的印管中。12000gX5min，4°C离心。取上清，转 移到新的印管中，加五分之一体积的氯仿，剧烈震荡15s，室温放置lOmin，待其分层。 12000gX 15min，4°C。用枪从表面慢慢往下吸，取上层水相转移至另一新的印管中，一般取300-400ul足够(切勿碰到下层)，用枪从表面慢慢往下吸，最后应距下层0. 4cm左右。在ep 管加入等体积异丙醇，混勻，室温放置20min，12000gX10min，4°C。弃上清，加冰浴的75% 乙醇(用DEPC水配)lml，轻轻吹悬吹散。10000gX8min，4°C。弃乙醇，吸干，残余的微量乙 醇空气干燥(不能太干，否则不易溶解)。用20-30ulDEPC水溶解。少量用于电泳检测，其 余-80°C保存。1. 2根据生物信息学提供的序列资料设计以下特异性引物Outer primer 5' -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3，；Inner Primer 5' -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3，1. 3根据TaKaRa的RACE试剂盒设计程序，进行PCR反应。PCR扩增步骤如下
(1)Outer PCR 反应。反应体系为，模板，2ul ;1 X cDNA dilution bufferll,8ul ；Gene specific outer primer(lOuM),2ul ；3' RACE outer primer(lOuM),2ul ； 10XLA PCR Buffer II (Mg2+free) ,4ul ；MgCl2 (25mM), 3ul ；LA Taq (5U/ul)，0. 25ul ；ddH20，28. 75ul ；反 应条件为，94°C，3min ；94°C，30s ；55°C，30s 72°C，lmin(30 循环)；72°C，10min ；4°C保存。
(2)Inner PCR 反应。反应体系为，Outer PCR 产物，lul ;dNTPmixture (2. 5mM each) ,8ul ； 10XLA PCR Buffer II (Mg2+free), 5ul ；MgCl2 (25mM), 5ul ；LA Taq (5U/ul), 0. 5ul ；Gene specific innerprimer(lOuM),2ul ；3' RACE inner primer(lOuM),2ul ;ddH20, 26. 5ul。反 应条件为，94°C，3min ；94°C，30sec ；55°C，30s ；72°C，lmin(30 循环)，72°C lOmin ；4°C保存。2.高山离子芥DRH基因5，端扩增2. 1去磷酸化处理按下列组分配制去磷酸化反应Total RNA(lug/ul) 2ul ； RNase inhibitor(40U/ul) :lul ；lOXAlkaline phosphatasebuffer(MgCl2 free) :5ul ; Alkaline phosphatase (calfintestine)(16U/ul),0. 6ul ；RNase free ddH20 :up to 50ul ； 50°C反应1小时。向上述反应液中加入20ul的3M CH3C00Na(PH5. 2)，130ul的RNasefree ddH20后，充分混勻。加入200ul的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25 24 1)，充分混 勻后13000Xg室温离心5min。将上层水相转移到新的Microtube中。加入200ul的氯仿， 充分混勻后13000Xg室温离心5min。将上层水相转移到新的Microtube中。加入2ul的 NAcarrier后均勻混合。加入200ul的异丙醇，充分混勻后，冰上冷却lOmin。13000Xg 4°C 离心20min，弃上清。加入500ul的70%冷乙醇(RNase free ddH20配制)漂洗，离心5min， 弃上清后干燥。加入7ul的RNase free ddH20溶解沉淀，得到CIAP-treated RNA。2. 2 “去帽子”反应配制“去帽子”反应液CIAP-treated RNA :7ul ； RNase inhibitor(40U/ul) lul ；10 X Tap reaction buffer :lul ；Tobaccoacid pyrophosphatase (0. 5U/ul) :lul。37°C反应 1 小时此反应液中 CIAP/TAP-treated RNA，取 5ul用于5’ RACE-Adaptor连接反应，剩余的5ul保存于_80°C。2.3 5，RACE-Adaptor 的连接。配溶液。CIAP/TAP-treated RNA :5ul ； 5，RACE-Adaptor (15ul) :lul ；RNase free ddH20 :4ul ；65°C保温 5min 后冰上放 2min，然后 加入下列试剂RNase inhibitor (40U/ul) :lul ；5XRNA Ligation buffer :8ul ；40% PEG 6000 :20ul ；T4 DNA ligase(40U/ul) :lul。16°C反应 1 小时。向上述反应液中加入 20ul 的 3M CH3C00Na (PH5. 2)，140ul 的 RNase free ddH20 后，充分混勻。加入 200ul 的苯酚 / 氯 仿/异戊醇(25 24 1)，充分混勻后13000Xg室温离心5min。将上层水相转移到新的 Microtube中。加入200ul的氯仿，充分混勻后13000Xg室温离心5min。将上层水相转移
7到新的Microtube中。加入2ul的NAcarrier后均勻混合。加入200ul的异丙醇，充分混勻 后，冰上冷却lOmin。13000Xg 4°C离心20min，弃上清。加入500ul的70%冷乙醇(RNase free ddH20配制)漂洗，离心5min，弃上清后干燥。再加入6ul的RNase free ddH20溶解 沉淀，得到ligated RNA。2. 4 反转录反应。反应体系为ligated RNA，6ul ；Random primer (50uM),0. 5ul ； 5XM-MLV Buffer, 2ul ；dNTP mixture (lOmM each), 1 U 1 ；RNase inhibitor (40U/ul), 0. 25ul ；Reverse transcriptase M-MLV(RNaseH-) (200U/ul)，0. 25ul。反应条件为30°C， lOmin ；42°C, 1 小时；70°C，15min。保存于 _20°C。2. 5PCR反应。根据3，端测序结果，用Primer Premier软件设计5，端特异引 物。(l)Outer PCR 反应。反应体系为5，特异性 out primer (10uM), 2ul ；5' RACE out primer (lOuM)，2ul ;cDNA 模板，lul;10XLA PCR Bufferll (Mg2+free), 5ul ；LA Taq(5U/ ul) ,0. 5ul ；MgCl2 (25mM), 5ul ；dNTP (2. 5mM) ,8ul ；ddH20，26. 5ul。反应条件为 94 °C, 2min ； 94°C，30s ；72°C，2min (5 循环)；94°C，30s ；70°C，2min (5 循环)；94°C，30s ；66°C，30s ；70°C 2min(30 循环)；68°C，lOmin ;4°C 保存。(2) Inner PCR 反应。5’特异性 inner primer (lOuM), 2ul ；5' RACE Inner primer (lOuM), 2ul ；Outer PCR 反应液，lul ;LA Taq (5U/ul), 0. 5ul ； dNTP (2. 5mM) ,8ul ； 10 X LA PCR Buffer II (Mg2+free)，5ul ;MgCl2 (25mM)，5ul ;ddH20， 26. 5ul。反应条件为:94°C,30s ；65°C，30s ；68°C，2min(30 循环)；68°C，5min ；4°C保存。3.基因拼接3，端基因测序结果与5，端基因测序结果通过DNA MAN软件拼接，得到基因cDNA 序列全长。4.基因全长cDNA序列扩增利用cDNA为模板，引物如下CbDRH-上 CCATGGAAATGAGCTCCTATGATCGTAGAT，CbDRH-下 CTCGAGTTGTGTTACAGTTGTCCTACCAAGT。PCR 反应体系为CbDRH-上，lul ；CbDRH-下，lul ； 10 X Taq buffer, 2. 5ul ； cDNA 模板，lul ；dNTP，2ul ；Taq, lul ；MgCl2 (25mM), 2ul ；ddH20，14. 5ul。PCR 反应条件为95°C， 3min ；95°C，40s ；60°C，40s ；72°C 2min (30 循环)；4°C，⑴。扩增得到的CbDRH基因自起始密码子至终止密码子总长1452个碱基，编码483个
氨基酸。实施例2.转基因烟草的获得构建真核表达载体PBI121-35S_CbDRH，转化农杆菌LBA4404，利用叶盘法转化烟 草。具体方法如下从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3ml YEP液体培养基 中(Rif 40u g/ml, Kan 100 u g/ml)于恒温摇床上 28 °C，180rpm 暗培过夜至 0D 600 为 0. 6-0. 8。摇培过夜的菌液按-2%的比例，转入新配置的含有相应抗生素的YEP培养 基中，在与上述相同的条件下培养6h左右，0D600为0. 5左右。5000rpm离心十分钟收 集菌沉淀，用50mlYEP液体培养基重悬沉淀。取野生型烟草无菌苗的幼嫩叶片，去主脉， 将叶片剪成0. 5cm2的小块，放入菌液中，浸泡lOmin(其间不断摇动菌液使其侵染充分)。 取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。将侵染后的烟草叶片接种在MS+KT(2.0ug/ml)+IAA(1.0ug/ml)固体培养基上，28°C暗培养三天。将黑暗中共培养2_4天的烟草叶片 转移到 MS+KT(2. Oug/ml)+IAA(l. Oug/ml) +Kan (lOOug/ml) +Cef (200ug/ml)中，用封 口膜封 好培养皿，在光照为30001uX、28°C、16h/8h光暗条件下选择培养。约2_3周后，待不定芽长 到1cm左右时，切下不定芽并转移到MS+Kan(200ug/ml)+Cef (200ug/ml)上进行生根培养，
获得完整植株。提取转化烟草的总DNA，PCR检测CbDRH基因是否转入，对扩增出合适条带的植株 进一步提取总RNA，获得cDNA，以cDNA为模板进一步进行PCR检测，鉴定转化成功的转基因 植株。结果发现T2，T3，T6，T8，T13为转基因植株。实施例3转基因烟草的抗寒性检测选取转基因植株TL3，作为抗寒性检测的对象(野生型作为对照)，将其置于_4°C 处理12h，观察植株生长状态，并测定质膜离子渗漏率。结果发现，野生型在处理后明显萎 蔫，而转基因植株尚保持较好的生活力(图1)，转基因植株的质膜渗漏明显小于野生型(图 2)。表明转基因烟草的抗低温能力高于野生型。
权利要求
一种高山离子芥冷诱导基因CbDRH，其核苷酸序列如序列表中序列1所示1)序列表中序列1的DNA序列；ATGAGCTCCTATGATCGTAGATTTGCTGATCCGAATTCGTATCGCCAACGCTCTGGCGCCCCAGTTGGTCCATCTCAGCCAATGGATCCTTCTGCTGCACCGTACAATCCACGATACGGTGGTGGTGGTGGATATGGACCGTCTCCTGTAATGGCCGGTGATGGCTCCGGGTATAGTCGGTACCCAGCTTTCCAGCCACCTACTAGTGGTTTCTCCGTTGGTCGCGGCGGAGGAGGAGGAAGAGGCACATATGGTCAATACGGCGGCGGAGGAGGCGGCGGCAGTGGTGGGAATTGGGGAGGACGTGGTGGTGGATCGAATAAAAGAGAGCTAGATAATGTTTCGCTTCCGAAGCAGAATTTTGGGAATCTTGTCCATTTCGAGAAGAATTTCTACGTGGAAAGCCCCGATGTGCAGGCGATGACAGAACAGGATGTTGCGATGTATAGAACCGGGAGGGATATATCCGTTGAAGGTCGTGATGTTCCTAAGCCGATTAGGATGTTCCAAGATGCTAACTTCCCAGALAATATTCTCGAAGCGATTGCTAAGTTGGGATTCACTGAGCCAACACCGATACAATCTCAGGGATGGCCAATGGCTTTGAAGGGTAGGGATCTGATTGGTATTGCTGAGACTGGCTCTGGTAAGACATTAGCTTACTTGTTACCAGCGTTGGTCCACGTAAGCGCACAACCTCGATTGAGTCAAGATGATGGCCCCATTGTGTTAATATTAGCGCCCACTAGAGAATTAGCTGTTCAGATTCAAGAGGAATCAAGGAAATTCGGTCTGCGATCTGGTGTTAGAAGCACTTGTATCTATGGTGGTGCTCCTAAAGGACCTCAGATTCGCGATCTTAGAAGAGGTGTTGAGATTGTAATTGCTACACCTGGTCGTTTGATCGATATGTTGGAGTGTCAACATACTAATTTGAGGAGAGTAACTTACCTCGTGTTAGATGAAGCTGACCGAATGTTAGACATGGGATTTGAACCCCAAATTAGAAAGATTGTATCTCAGATCCGACCTGATAGACAGACGCTGCTTTGGAGTGCAACATGGCCACGAGAGGTTGAATCTCTTGCCAGGCAGTTTCTACGAGATCCATATAAGGCCATTATTGGATCAGCAGATCTAAAAGCTAACCAGTCTATTAATCAAGTAATCGAGATTGTACCAACGCCAGAGAAATACGCCAGGCTTCTTGCACTGCTTAAACAGTTAATGGATGGGAGTAAAATCCTAATATTCGTGGAGACAAAGAGAGGGTGTGATCAAGTGACTAGACAATTGAGAATGGATGGATGGCCAGCTCTAGCCATACACGGTGACAAGAACCAATCGGAAAGAGATCGAGTCTTGTCAGAATTTAAGAGCGGAAGAAGCCCGATAATGACTGCCACTGATGTAGCAGCAAGGGGACTTGGTAGGACAACTGTAACACAATAG2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；3)该基因的读码框为自5’端第1到第1452位碱基。
2.含有权利要求1所述基因的表达载体。
3.根据权利要求1所述的高山离子芥冷诱导基因CbDRH，其特征在于所述与植物抗寒 有关的基因CbDRH，具有序列表中序列1的DNA序列。
4.一种由序列表中序列1的DNA序列所述的核苷酸序列所编码的蛋白质，其氨基酸残 基序列如序列表中序列2所示序列表中序列2所述氨基酸序列MSSYDRRFADPNSYRQRSGAPVGPSQPMDPSAAPYNPRYGGGGGYGPSPVMAGDGSGYSRYPAFQP PTSGFSVGRGGGGGRGTYGQYGGGGGGGSGGNWGGRGGGSNKRELDNVSLPKQNFGNLVHFEKNF YVESPDVQAMTEQDVAMYRTGRDISVEGRDVPKPIRMFQDANFPDNILEAIAKLGFTEPTPIQSQGffP MALKGRDLIGIAETGSGKTLAYLLPALVHVSAQPRLSQDDGPIVLILAPTRELAVQIQEESRKFGLRSG VRSTCIYGGAPKGPQIRDLRRGVEIVIATPGRLIDMLECQHTNLRRVTYLVLDEADRMLDMGFEPQIRKIVSQIRPDRQTLLWSATWPREVESLARQFLRDPYKAIIGSADLKANQSINQVIEIVPTPEKYARLLALLKQLMDGSKILIFVETKRGCDQVTRQLRMDGWPALAIHGDKNQSERDRVLSEFKSGRSPIMTATDVAARGLGRTTVTQ。
5.将含有权利要求1所述基因的表达载体PBI121-35S-CbDRH转化农杆菌LBA4404，利用叶盘法转化烟草获得转基因烟草。其在烟草抗寒育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个高山离子芥冷诱导基因CbDRH，编码产物及其在抗寒转基因烟草中的应用。高山离子芥冷诱导的基因CbDRH是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。由上述基因CbDRH编码的蛋白质，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。该基因在低温下蛋白水平上调了7倍，转入CbDRH基因的转基因烟草在低温下比野生型烟草具有更高的抗寒性。这对于培育抗低温的优良作物具有重要的理论及实际意义。
文档编号C12N9/00GK101979582SQ20101023498
公开日2011年2月23日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者关淼, 向云, 孙正龙, 安黎哲, 张华 , 杨玉, 白慕群, 盛红梅, 陈书燕 申请人:兰州大学