从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法

专利名称：从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法
技术领域：
本发明涉及一种从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法，具 体涉及一种基于microRNA前体二级结构特性的单链cDNA文库分离技术，属于分子生物学 领域。
背景技术：
microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链 RNA分子，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生 成。目前首选的microRNA (miRNA)实验室鉴定方法是对依大小分离的cDNA文库进行测序分 析。最初的试剂盒是用来克隆约22nt的小干涉RNA分子，但似乎对内源性的小RNA分子也 有作用。于是，许多这样的试剂盒也被用来克隆miRNA。克隆小RNA的试剂盒发展很快，当前 许多已知的miRNA就是用这些试剂盒鉴定出来的。所有试剂盒的原理都相同，仅在操作的 细节上有所不同。简而言之，将总RNA样本用变性的聚丙烯酰胺凝胶分离，回收20-25nt大 小的RNA。将5’和3’接头分子(Adapter)连接到RNA上，以接头分子为引物进行RT-PCR， PCR产物克隆到载体，构建cDNA文库。最后将每个克隆进行测序，分析起源于基因组的小 RNA。对于单链的cDNA合成，需要将3’接头连接到成熟的miRNA，引入一个反转录引物 的退火位点。在寡核苷酸的化学合成过程中，为了防止成熟miRNA和接头自我成环，在连接 前小RNA通常要经脱磷酸处理，要在3’接头的3’羟基末端连接上一个非核苷基团。另外 一个很普遍的作法是，将3’接头5’端腺苷酸化，免去了小RNA脱磷酸的步骤。还有的是用 poly(A)连接酶将poly(A)尾巴来代替3’接头分子连接到小RNA分子上，就用oligo(dT) 来当反转录的引物。通过克隆测序发现miRNA共同的局限性是由于小RNA文库中的siRNA(小的干 涉RNA)较多，导致克隆效果大大降低，对于低水平表达，或特定时期，或稀有细胞类型中的 miRNA 难以找到。例如 McDaneld 等(McDaneld，Τ. G, Smith, Τ. P.，Doumit, Μ. Ε.，Miles, J. R. , Coutinho, L. L. , Sonstegard, Τ. S. , Matukumalli, L. K. , Nonneman, D. J. , Wiedmann, R. Τ. MicroRNA transcriptome profiles during swine skeletal muscle development. BMC Genomics. 2009，10 :77_88)用小RNA的cDNA文库测序的方法来研究micorRNA在猪骨 骼肌中的表达，一共做了 5000个克隆测序，在得到的600个不同的克隆序列中，只确认了约 150个已知的microRNA序列和约70个未知的microRNA序列，其余大部分不是microRNA 序列。可见新microRNA的筛选采用小RNA的cDNA文库克隆测序的方法还是可行的，只是 效率较低，测序结果中重复的序列较多。在5000个克隆中仅有约600个不同的小RNA序列 (12% )，而且这600个中也只有一小部分(36% )是miRNA序列。因此需要寻求一种更为有效地分离miRNA前体的方法，以此提高miRNA的克隆测
序效率。

发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用microRNA前体的发夹 二级结构特性来从小RNA合成的cDNA文库分离microRNA前体cDNA的方法。为了达到上述目的，本发明提供了一种从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA 前体cDNA的方法，该方法包括以下步骤将合成的cDNA进行PCR扩增，扩增后将PCR片段 经限制酶酶切，克隆测序；该方法在进行PCR扩增之后、PCR片段酶切之前还需要对所获得 的PCR产物进行microRNA前体片段的不同二级结构单链分离；所述分离过程包括以下步 骤(1)将得到的cDNA片段用5’端带有生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增后得到 的cDNA双链进行变性处理，然后用磁珠技术进行cDNA双链分离；(2)对步骤(1)中得到的单链进行复性，得到具有microRNA前体片段的二级结构 的 cDNA ；(3)通过电泳分离步骤(2)中得到的cDNA，得到具有不同二级结构的单链cDNA，分 别回收，进行PCR反应形成双链。其中，步骤(1)中PCR 扩增引物为=F :5，-AAAGATCCTGCAGGTGCGTCA-3，，R 5，-GTCTCTAGCCTGCAGGATCGATG-3，；扩增后得到的cDNA双链变性处理条件为95°C时5min。步骤(2)中单链cDNA复性过程为在以下条件下依次进行94°C时2min，60°C时 30sec，72°C时 lmin，4°C时 5min。步骤(3)中电泳分离采用聚丙烯酰胺电泳或二维电泳，电泳结束后银染。与现有技术相比，本发明提供的单链cDNA文库分离克隆测序方法具有以下有益 效果本发明利用了 miRNA前体的发夹形二级结构特点来分离miRNA前体，提高了 miRNA的 克隆测序效率；同时本发明在电泳时未加任何染料，在电泳结束后再进行银染，保证了具有 不同二级结构的DNA分子达到更好的分离效果。


附图为本发明从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA方法的流程 图。
具体实施例方式实施例11、小 RNA 提取使用罗氏公司的小RNA(<IOObp)提取试剂盒(High Pure miRNA IsolationKit, Cat. No. 05 080 576 001)。具体操作步骤如下1)加400 μ L 20%结合缓冲液(Binding Buffer)到一个2mL的空试管中；2)加1 50mg的肌肉组织样品到试管中，用勻浆机将组织打碎；3)将试管在4°C下，HOOOrpm离心2min，后取上清液约150-188 μ L到另一个新的 1. 5mL的试管中；4)力口 312 μ L 的 Binding Buffer，震动 3X5s ；
5)将试剂盒中的滤管和收集管组装好，将混合液吸入上面的滤管中；6) 13000 Xg离心30s，收集下面收集管中的液体；7)再加200 μ L的结合增强缓冲液(Binding Enhancer)到收集管中，震动3 X 5s ；8)将试剂盒中的滤管和收集管组装好，将混合液吸入上面的滤管中；9) 13000 Xg离心30s，倒掉收集管中的液体；10)力Π 500 μ L的冲洗缓冲液(Wash Buffer)工作液到滤管中；11) 13000 Xg离心30s，倒掉收集管中的液体；12)力卩300 μ L的Wash Buffer工作液到滤管中；13) 13000 Xg离心30s，倒掉收集管中的液体；14) 13000 X g 离心 Imin ；15)将滤管置于一个新的1. 5mL的试管中，加100 μ L洗脱缓冲液(Elution Buffer)(为了提高RNA浓度，加50 μ L Elution Buffer也行，但会损失产量约30 ，在 15 25°C下孵化Imin ；16) 13000 X g 离心 Imin ；17)这样< IOOnt miRNA就提出来了，可以直接做RT-PCR或者保存于_80°C下以2、小 RNA 的细菌碱性磷酸酶(Bacterial Alkaline Phosphatase, BAP)处理小RNA的克隆要使用小RNA克隆试剂盒(Small RNA Cloning Kit)。具体操作步 骤如下1)在1 IOOng的小RNA中加入去核糖核酸酶的双蒸水(RNase freeddH20)，总 量至42 μ L02)在小试管(Microtube)中配制如下反应液Small RNA42 μ L核糖核酸酶抑制剂(RNaseInhibitor) IyL10XBAP Buffer5μ LBAP2 μ LTotal50 μ L3)使用微量移液管(Micropipetman)轻轻混勻后，37°C反应1小时。4)加入50 μ L的RNase free ddH20,将总体积调至100 μ L后，再加入等量的苯酚 /氯仿/异戊醇，在振荡器上振荡5 10秒钟，使其充分混勻。5) 4"C 15，OOOrpm离心5分钟，将上清(水层)转移到新的Microtube中。注意不 要取到中间层。6)再次加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇混勻后，离心回收上层。7)加入等量的氯仿/异戊醇，在振荡器上混勻5 10秒钟。8) 4"C 15，OOOrpm离心5分钟，将上清(水层)转移到新的Microtube中。9)向上清中加入1/10体积的3Μ醋酸钠(Sodium Acetate)、4 μ L的Dr. GenTLE沉 淀载体(Dr. GenTLE Precipitation Carrier)、2. 5倍体积的乙醇，充分混勻。10)-80°C放置1小时后，4°C 15，OOOrpm离心1小时，轻轻倒掉上清，保留沉淀。11)用80%乙醇清洗沉淀。
12)风干后(注意不要过于干燥)，用14 μ L的RNase free ddH20溶解。13)用微量紫外分光光度计检测RNA质量。3、3，接头分子(Adaptor)的连接1)在Microtube中配制如下反应液。0. 牛血清白蛋白(bovine3μ Lserum albumin, BSA)RNase Inhibitor1 μ L3，Adaptor1 μ LBAP 处理 Small RNA14 μ LTotal19 μ L2)加入30 μ L的Τ4的核糖核酸连接缓冲液(Τ4 RNA Ligation Buffer)，用 Micropipetman混勻(此Buffer比较粘，操作时要注意)。3)加入 1 μ L 的 T4RNA Ligase，用 Micropipetman 充分混勻。4)15°C 反应 1 小时。4、MAGN0TEX-SA 的吸附1)移取 210μ L 的 2XB/W Buffer 到 Microtube 中，再加入 210 μ L 的 RNase free ddH20 配制成 1XB/W Buffer。2)将磁性-生物素-链霉亲和素系统(MAGN0TEX-SA，Magnet Beads)充分混勻后， 取10 μ L至新的离心Microtube中。3)将Tube置于磁力分离架(Magnetight Separation Stand)上，静置30秒钟后
去上清。4)加入IOyL的2XB/W Buffer,在振荡器上轻轻混勻后，置于 MagnetightSeparation Stand 上，静置 30 秒钟。(B/W Buffer 中含有 Tritonx-100，易起 泡，但对反应没有影响。)5)弃上清，加入 50μ L 的 2XB/WBuffer。6)向上述2、的连接反应液中加入50 μ L上述5)中制备的Magnetbeads，充分混 勻。7)25°C静置 1 小时。8)反应结束后,将 Microtube 在 Magnetight Separation Stand 上静置 30 秒钟。9)弃上清后，加入IOOyL的1XB/W Buffer，用Vortex短时间振荡，使Beads混 勻。10)将 Microtube 在 Magnetight Separation Stand 上静置 30 秒钟，弃上清。11)加入100 μ L的RNase free ddH20，轻轻混勻。此水溶液在进行下步实验之前 不要去除。5、5’末端磷酸化1)在Microtube中于冰上配制如下反应液。RNase free ddH2038 μ LRNase Inhibitor1 μ LT4的多聚核苷酸激酶IOyL
(Polynucleotide Kinase, PNK)缓冲液(5XT4PNKBuffer)T4 Polynucleotide Kinase1 μ LTotal50 μ L2)将上述试验操作4的步骤11)中制备的Beads水溶液在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入50 μ L上述1)配 制的反应液，用Micropipetman轻轻混勻。3) 37 °C 反应 30 分钟。4)在 Magnetight Separation Stand 上静置 30 秒、 中。5)弃上清，加入100μ L的1XB/W Buffer，短时间在Vertex上振荡使Beads混勻。6) Microtube ^t Magnetight Separation Stand ±#g 30 禾;Φ.中，青。7)加入IOOyL的RNase free ddH20，轻轻混勻。此水溶液在进行下步实验之前 不要去除。6、5，Adaptor 的连接1)在Microtube中于冰上配制如下反应液，充分混勻。RNase free ddH2014 μ LT4RNA Ligation Buffer*30 μ L0. 1 % BSA3 μ L5，Adaptor1 μ LRNase Inhibitor1 μ LT4 RNALigase1 μ LTotal50 μ L*此Buffer比较粘，操作时要注意。2)将上述实验操作5的步骤7)中制备的Beads水溶液在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入上述1)配制的反应液，用 Micropipetman轻轻混勻，15°C反应1小时。3)力口入50 μ L 的RNase free ddH20充分混勾后，在Magnetight Separation Stand 上静置30秒钟。4)弃上清，加入100μ L的1XB/W Buffer，短时间在Vertex上振荡使Beads混勻。5) Microtube ^t Magnetight Separation Stand ±#g 30 禾;Φ.中，青。6)加入IOOyL的RNase free ddH20，轻轻混勻。此水溶液在进行下步实验之前 不要去除。7、反转录反应1)在Microtube中于冰上配制如下反应液。5X 反转录缓冲液(5XRT Buffer)4μ LdNTP 混合液(dNTP Mixture)4μ LRNase Inhibitor1 μ LPCR-R 和反转录引物(PCR-R&RT-Primer)1 μ L M-MLV反转录酶(M-MLV，莫洛尼鼠白血病逆转录病毒)IyL
PCR-R&RT-Primer 5，-GTCTCTAGCCTGCAGGATCGATG-3，2)将上述实验操作6的步骤7)中制备的Beads水溶液在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入9 μ L的RNase free ddH20，75°C 处理5分钟后，冰上静置1 2分钟。3)再向其Microtube中加入上述1)中配制的反应液11 μ L，均勻混合后42°C反应 1小时。4)在 Magnetight S印aration Stand 上静置 30 秒钟。5)去除上清，加入IOOyL的1XB/W Buffer，短时间在Vertex上振荡使beads混 勻。6) Microtube ^t Magnetight Separation Stand ±#g 30 禾;Φ.中，青。7)加入IOOyL的RNase free ddH20，轻轻混勻。此水溶液在进行下步实验之前 不要去除。8、PCR 扩增1)在Microtube中于冰上配制如下反应液。RNase free ddH2012 μ L2 X PCR Buffer25 μ LdNTP Mixture5μ LPCR 引物(PCR-Primer)F 1 μ LPCR-R&RT-Primer1 μ LTaq 酶1 μ LTotal45 μ L2)将上述实验操作7的步骤7)中制备的Beads水溶液在MagnetightS印aration Stand上静置30秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入5μ L的0. IN NaOH，用手指轻 弹Microtube混勻(注意不能用Micropipetman混勻，因为磁珠会吸附于Tip壁上)。3)25°C放置 5 分钟后，在 Magnetight Separation Stand 上静置 30 秒。4)取上清移至0. 2mLPCR反应管中。5)加入45 μ L上述1)中配制的反应液，充分混勻。6)在Thermal Cycler PCR仪上按以下条件进行PCR反应。94 "C 2min72 °C 3min4 "C ①7)电泳检测PCR产物结果。8)胶回收连接了接头的成熟miRNA片段(较小)和接了接头的miRNA前体片段 (较大)并纯化。这些DNA片段以备用。
94 0C 10 sec
8
9、miRNA前体片段的不同二级结构单链分离1)在Microtube中于冰上配制如下反应液RNase free ddH2012 μ L2 X PCR Buffer25 μ LdNTP Mixture5μ LPCR-Primer-F(5，生物素标记)IyLPCR-Primer-R1 μ LTaq 酶1 μ L回收的miRNA前体片段5yLTotal50 μ LPCR-Primer-F 5PCR-Primer-R 52) PCR反应程序94"C 2min 72 °C 3min4 "C ①3)取5 μ LPCR产物进行电泳检测约120bp。4)如果电泳检测条带较好，再进行以下实验。将PCR产物在PCR仪上进行变性处 理95°C 5min，将PCR产物取出后速置于冰水之中，以后操作都在冰上进行。5) MAGN0TEX-SA 的吸附a、移取 210 μ L 的 2XB/W Buffer 至Ij Microtube 中，再力口入 210 μ L 的 RNasefree ddH20 配制成 1XB/W Buffer。b、将磁性-生物素-链霉亲和素系统(MAGNOTEX-SA，Magnet Beads)充分混勻后， 取10 μ L至新的离心Microtube中。C、将 Tube 置于 Magnetight Separation Stand 上，静置 30 秒钟后去上清。d、加入IOyL的2XB/W Buffer,在振荡器上轻轻混勻后，置于 MagnetightSeparation Stand 上，静置 30 秒钟。(B/W Buffer 中含有 Tritonx-100，易起 泡，但对反应没有影响。)e、弃上清，加入 45 μ L 的 2 X B/WBuffer。f、向上述4的变性PCR产物中加入45 μ L上述e中制备的Magnet beads,充分混 勻。g、25°C静置 1 小时。h、反应结束后，将 Microtube 在 Magnetight Separation Stand 上静置 30 秒钟。i、吸取上清到一个新的PCR管(存起备用)后，加入IOOyL的lXB/WBuffer，用 Vortex短时间振荡，使Beads混勻。
9
-AAAGATCCTGCAGGTGCGTCA-3‘ -GTCTCTAGCCTGCAGGATCGATG-3‘
940C 30 sec、 600C 30 sec 720C 30 sec
35 cycles
Microtube ^t Magnetight Separation Stand30 禾;Φ.中，青。k、加入100 μ L的RNase free ddH20,轻轻混勻。此水溶液在进行下步实验之前不
要去除。6)将上述操作制备的Beads水溶液在Magnetight Separation Stand上静置30 秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入5μ L的0. IN NaOH，用手指轻弹Microtube混勻 (注意不能用Micropipetman混勻，因为磁珠会吸附于Tip壁上)。25°C放置5分钟后，在 Magnetight Separation Stand上静置30秒。取上清移至0. 2mLPCR反应管中。7)将上述的 PCR 管置于 PCR 仪中-MV 2min，60°C 30sec，72°C lmin，4°C 5min。使 得miRNA的发夹前体形成。8)将上述的PCR产物进行未变性的聚丙烯酰胺电泳或二维电泳，银染(注意要用 银染，EB不能染单链DNA)，拍照。9)将电泳结果进行分析，跑在最前面的为引物二聚体，发夹结构的单链DNA在中 间，非发夹结构的单链DNA在最后。10)分别将凝胶中不同位置的DNA进行回收，回收滤液后进行乙醇沉淀。11)以回收的单链DNA为模板，还是用原来的引物，进行PCR反应，得到双链后，电 泳纯化回收PCR产物，乙醇沉淀。10、PCR片段的Sse8387 I酶切及克隆测序由于克隆的片段较小，易产生假阳性，故需要进行酶切后再用专用的载体进行克 隆，以提高克隆效率。1)在Microtube中配制如下反应液。dH2034 μ LIOXM Buffer5μ L0.1% BSA5μ L上述实验操作9-11)的PCR产物 5 μ LSse8387I(10U/y L)1 μ LTotal50 μ L2) 37 °C 过夜反应。3)力口入 5μ L 的 3Μ NaOAc (ρΗ5. 2) ,125 μ L 的 100% 乙醇混勻后，_80°C 放置 30 分钟。4) 40C 15，OOOrpm离心15分钟后，轻轻倒掉上清。5)用80%乙醇清洗沉淀。6)风干后(注意不要过于干燥)，将沉淀用5 μ L的TE Buffer溶解。7)加入 1 μ L 的 6X 载样缓冲液(Loading Buffer) (36% Glycerol、30mMEDTA、 0. 05% ΒΡΒ、0. 050% XC)进行15%的聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamidegel)(未变性)电 泳(Marker :20bp DNA Ladder)。8)BPB泳动至4/5胶长时即停止电泳。把胶放入新配制的染色液EtBr中进行染 色。9)用干净刀片，把目的片段切出。目的片段长度是RNA长度+PCR PrimerF+RT-Primer之和再用Sse8387I酶切后的片段长度(Sse8387 I酶将切去22bp)。例如RNA长度为70mer，PCR片段长度为120bp ；用Sse8387I酶切后的长度为98bp。10)在0. 5mL Microtube底部用18G的针扎一个孔，插入1. 5mL或者2mL Microtube内，用封口膜等把配套的Microtube固定。11)将切取的胶块放入配套好的0. 5mL Microtube底部，4°C 15，OOOrpm离心2min。 通过本方法能把胶破碎，破碎胶将移至下部管的底部。如果0. 5mL管底部还有胶残留，可以 再离心2min。12)取出 0.5mL Microtube,在下部 Microtube 中力口 入 50 100 μ L 的 IXMBufferdOmM Tris-HCl，ρΗ7· 5，IOmM MgCl2，ImM DTT,50mM NaCl)。 13) 25°C放置1小时(中间反复颠倒混合数次)。14)把胶液加入SUPREC-01中，4°C 15，OOOrpm离心2min，回收滤液后进行乙醇沉淀。15)将纯化后的PCR Sse8387I酶切片段和50ng Pst I酶切后的Vector (pUCl 18 Pst I/BAP)适量混合后，加入等量的 Solution I 中(DNA Ligation Kit Ver. 2. 0), Solution I请于冰中融解。16°C反应30分钟。16)取连接液的一部分转化至 E. coli JM109 Competent Cells 中。①全量(10 μ L)加入至100 μ L的JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。②42°C加热90秒钟后，再在冰中放置1-2分钟。③加入890 μ L的SOC培养基，37°C振荡培养60-120分钟。SOB 培养基配制每升培养基，在950mL去离子水中加入胰化蛋白胨 20g酵母提取物 5gNaCl0. 5g摇动容器使溶质完全溶解。力Π IOmL 250mmol/L KCl溶液(将1. 86gKCl用IOOmL 去离子水溶解即配成250mmol/L KCl溶液)。用5mol/LNa0H调pH值至7. 0。用去离子水 定容至1L。在15psi (1. 05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。该溶液在使用前，加入5mL灭 菌的2mol/LMgC12[2mol/L MgC12溶液的配制方法如下用90mL去离子水溶解19g MgCl2, 用去离子水调整体积为IOOmL,在15psi (1. 05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min]。SOC 培养基SOC培养基除含有20mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同。SOB培养基经 高压灭菌后冷至60°C或60°C以下，加20mL除菌的lmol/L葡萄糖溶液(lmol/L葡萄糖溶液 的配制方法是用90mL去离子水溶解18g葡萄糖，完全溶解后，用去离子水定容至IOOmL, 用0. 22 μ m滤器过滤除菌)。④8000rmp，离心lmin，轻轻吸去800 μ L上清液，留下约200 μ L上清液， 用灭菌枪头重悬沉淀，将菌混勻，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷 (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β -D-galactopyranoside,X-Gal)、异丙基-B-D-硫代半乳 糖苷(IS0PR0PYL B-D-I-THI0GALACT0PYRAN0SIDE, IPTG))、Amp 的 L-琼脂平板培养基上分 两次涂板培养12 20h，形成单菌落。LB/Amp/X-Gal/IPTG 平板培养基
组份浓度1% (W/V)0. 5% (W/V)1% (W/V)0. lmg/mL0. 5% (ff/V)0. 04mg/mL1. 5% (ff/V)配制量IL配制方法a、称取下列试剂，置于IL烧杯中。TryptoneIOgYeast Extract 5gNaCl IOgb、加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。c、滴加 5NNa0H 溶液(约 0. 2mL)，调节 pH 值至 7.0。d、加水离子水将培养基定容至IL后，加入15gAgar。e、高温高压灭菌后，冷却至60°C左右。f、加入 ImL Ampicillin (100mg/mL)、ImL IPTG (24mg/mL)、2mL X-Gal (20mg/mL)后 均勻混合。g、铺制平板(30 35mL培养基/90mm培养基)。h、4°C保存平板。⑤将平板用封口胶封住，放入4°C冰箱中显色lh，计数白色、蓝色菌落。⑥用灭菌枪头挑选白色菌落放入已加入10 μ L灭菌超纯水的PCR管中，取1_2 μ L 悬液作为模板，使用菌液PCR法等确认载体中插入片段的长度大小。⑦取重组阳性菌落悬浊液5 μ L放入2mL SOC液体培养基(含AmplOOug/mL)， 37°C、振荡培养12-20h。17)涂平板后进行37°C过夜培养，挑取阳性克隆进行PCR鉴定。PCR鉴定引物用 BcaBEST Sequencing Primers 或 M13Primers，不易产生假阳性。18)经PCR鉴定后的阳性克隆经扩培后，培养的菌液(ImL左右)送上海 Invitrogen公司进行测序。测序结果PCR鉴定得到的136个阳性单克隆的菌液，有111个阳性单克隆的菌液 测序成功，其中有3个序列为重复序列，共测得108个不重复序列。实施例2采用本方法来研究猪的miRNA，分离回收了凝胶中两个不同区的cDNA单链，恢复 为双链后再进行克隆测序。测序结果用BioEdit和RNAfold软件分析后，发现A区和B区 克隆测序结果中发夹序列的比率明显不同。在A区的63个测序结果中，所有序列几乎全部 为“三叶草”型二级结构，无一基本符合miRNA前体的发夹型二级结构标准。这说明，这一区 的小RNA多不是miRNA前体。而在B区的45个测序结果中，共找到了 5个基本符合miRNA
蛋白胨(Tryptone)
酵母提取物(Yeast Extract)
NaCl
氨苄青霉素(Ampici 11 in) IPTG X-Gal
琼脂粉(Agar)前体发夹型二级结构的序列，但其他大部分序列仍不符合miRNA前体发夹型二级结构的定 义要求(表1)。A区和B区的发夹结构序列数目经SPSS 13.0软件的卡方检验表明差异显 著(P<0. 05) (N = 108，最小期望频数为2. 08，2X2表格采用连续校正的卡方值为5. 039， 双尾 P 值为 0. 025 < 0. 05)。
表IA区和B区的单克隆测序结果对比 结果表明，这种方法完全可以将不同二级结构的小RNA cDNA单链分离回收，具有 明显的效果。
权利要求
一种从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法，包括以下步骤将合成的cDNA进行PCR扩增，扩增后将PCR片段经限制酶酶切，克隆测序，其特征在于该方法在进行PCR扩增之后、PCR片段酶切之前还需要对所获得的PCR产物进行具有microRNA前体片段的不同二级结构单链分离；所述分离过程包括以下步骤(1)将得到的cDNA片段用5’端带有生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增后得到的cDNA双链进行变性处理，然后用磁珠技术进行cDNA双链分离；(2)对步骤(1)中得到的cDNA单链进行复性，得到具有microRNA前体片段的二级结构的cDNA；(3)通过电泳分离步骤(2)中得到的cDNA，得到具有不同二级结构的单链cDNA，分别回收，进行PCR反应形成双链。
2.根据权利要求1所述的从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的 方法，其特征在于步骤(1)中PCR扩增引物为F :5’ -AAAGATCCTGCAGGTGCGTCA-3’，R 5’ -GTCTCTAGCCGCAGGATCGATG-3’。
3.根据权利要求1所述的从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方 法，其特征在于步骤(1)中的cDNA双链变性处理条件为95°C时5min。
4.根据权利要求1所述的从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的 方法，其特征在于步骤(2)中单链复性为在以下条件下依次进行94°C时2min，6(TC时 30sec，72°C时 lmin，4°C时 5min。
5.根据权利要求1所述的从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方 法，其特征在于步骤(3)中电泳分离采用聚丙烯酰胺电泳或二维电泳，电泳结束后银染。
全文摘要
本发明公开了一种从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法，包括以下步骤将cDNA进行PCR扩增；得到的cDNA片段用5’端带有生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增后得到的cDNA双链进行变性处理，然后用磁珠技术进行cDNA双链分离；对分离得到的cDNA单链进行复性，形成具有具有不同二级结构的单链cDNA，分别回收，进行PCR反应形成双链；将PCR片段经限制酶酶切，克隆测序。本发明采用的测序方法能够更为有效地提高miRNA克隆测序的效率。
文档编号C12N15/10GK101914524SQ20101023566
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者刘红林, 周波 申请人:南京农业大学