专利名称：一种二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及氯霉素抗体领域，具体涉及一种二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体及其 构建方法和应用。
背景技术：
氯霉素(CAP)是一种可引起人类再生障碍性贫血粒状白细胞缺乏症等严重疾病 的抗生素，自1994年起便被联合国禁止使用，我国亦自2002年起明确规定动物源性食品 中氯霉素残留不得检出(王伊琴，包勇敢，胡烈山，等.ELISA在检测动物组织氯霉素残留 中的应用[J].中国农业通报，2006，22 (4) :26-29.)，但由于廉价高效，目前仍被广泛非法 滥用于养殖业，给人民生命健康和我国动物源性食品相关产品的出口贸易带来了较大的挑 战。特异性抗体在食品有害残留检测中具有重要意义，高质量的抗体是食品有害残留样品 的制备和检测的关键试剂(周宏琛，闫秋成，田晓林，等.动物源性食品安全快速检测与酶 联免疫吸附方法的应用[J].肉品卫生，2005,25(11) :29-32.)。单克隆抗体(MAb)具有特 异性强和亲和力高的优点，但其现有生产技术存在生产成本高、规模难于工业放大和质控 等缺点。基因工程小分子抗体是单克隆抗体的理想替代产品，目前已有众多兽药和农药类 小分子半抗原的基因工程抗体的报道(YAU KY, LEEH，HALL J C. et al. Emerging trends in the synthesis and improvement of hapten-specific recombinant antibodies[J]. Biotechnology Advances, 2003, 21 :599_637. >KRAMER K,HOCK B. Recombinant antibodies for environmental analysis[J]. Anal. Bioanal. Chem. 2003,377,417-426. > H00GENB00M H R. Selecting and screening recombinant antibody libraries[J]. Nature 2005,23, 1105-1116.)。单链抗体(scFv)是一种以柔性接头连接抗体重链和轻链可变区的小分子 基因工程抗体，该类抗体既保留了母本抗体的亲和力又便于基因工程手段生产，因此得到 了较广泛的研究和应用。但该类抗体的二个可变区之间由于缺乏母本抗体那样的链间二 硫键，因此稳定性较差。二硫键稳定的单链抗体(sdsFv)即是通过模拟天然抗体的结构 而在单链抗体基础上引入一对二硫键的构建形式(NISHI K，ISHIUCHI M，M0RIMUNE K，et al. Molecular and immunochemical characteristics of monoclonal and recombinant antibodies selective for the triazine herbicide simetryn and application to environment analysis. J. Agric. Food Chem. 2005，53，5096-5104.)。我们曾报道了抗氯霉 素单克隆抗体可变区基因的克隆(李黄金，赵林，陈伟，等.抗氯霉素抗体可变区基因的克 隆与序列分析[J].现代预防医学，2009，36 (24) =4655-4658.) 0
发明内容
本发明的目的在于根据现有的用于检测氯霉素残留的单链抗体中存在的可变区 之间缺乏二硫键，稳定性较差的问题，提供了一种二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体。本发明另一目的在于提供经过优化的编码上述抗氯霉素单链抗体的cDNA。本发明另一目的在于提供上述抗氯霉素单链抗体的构建方法。
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本发明另一目的在于提供一种含有上述氯霉素单链抗体的试剂盒。本发明还有一个目的在于提供上述氯霉素单链抗体的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现一种二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。一种编码权利要求1所述二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体的cDNA，其特征在于其 核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体的构建方法是以抗氯霉素抗体可变区基 因为模板，通过引物突变PCR在轻链和重链的可变区分别加入一个半胱氨酸定点突变，以 重叠延伸PCR组装成二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体基因，将该基因转导入大肠杆菌表达 系统中，表达的蛋白即为二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体。一种试剂盒，该试剂盒中包含二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体。单链抗体(scFv)是目前得到广泛应用的基因工程抗体类型，该类抗体是以 (Gly4Ser)JMf Vh和\片段连接起来而形成的单链小分子抗体。众多的研究结果表明， scFv类小分子抗体拥有与母本单抗相似、甚至更高的亲和力。二硫键稳定的单链抗体 (sdsFv)是为了提高scFv的稳定而在V1^P Vl间引入一对二硫键的改良型。目前在sdsFv 中的二硫键位置主要是Vh44和Vutltl，分别位于Vh的FR2区和\的FR4，均为非抗原识结合， 所以此处引入二硫键对抗体的亲和力影响不大。我们通过以KABAT数据库比对单抗V区氨 基酸保守序列进行推断，得出先前克隆的抗氯霉素抗体V基因的突变位点为Vh49和Vu2tl,并 以此为基础构建sdsFVCAP。与scFV 类抗体一样，sdsFv 也有 VH-linker_VL 和 Vflinker-V11 二种构建形式。有 研究表明，以前种形式构建的sdsFv亲和力高于后者形式的，但表达水平远低于后者的。在 本发明中所构建的sdsFV。^基因不能独立表达，但当融合于Trx的3’端时可高效表达，表 明该基因的5’端序列影响转录或翻译。当通过同义突变将该基因的5’端30bp内的GC含 量从60%降低到30%时即实现了高效表达，表明5’端序列GC含量过高是sdsFV ^基因 低表达的关键原因，至于是否为所有VH-linker-\类构建的低表达原因尚需进一步研究。大肠杆菌高效表达产物一般为不溶的包涵体蛋白，包涵体蛋白的复性是关键工艺 之一。sdsFV。AP_2基因表达产物也为包涵体蛋白，当我们对该产物变性后采用常规的稀释复 性法进行复性操作时发现绝大部分目的蛋白被聚沉了，这可能与在VirIinker-VJ旬引入了 二硫键有关。当采用环糊精分子伴侣系统进行复性时即解决了沉淀问题，所获复性产 物的与母本抗体的亲和力基本一致，表明SdsFVfflp蛋白得到了较好的复性。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明以抗氯霉素抗体可变区基因为模板，通过引物突变PCR在轻链和重链的可 变区分别加入一个半胱氨酸定点突变，以重叠延伸PCR组装成二硫键稳定的抗氯霉素单链 抗体基因，将该基因转导入大肠杆菌表达系统中，表达出二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体。 由于引入了一对二硫键的构建形式，使抗体的稳定性提高，从而可以取代单克隆抗体用于 氯霉素残留的检测。同时，通过降低5’端序列中的GC含量对目的基因进行优化，解决了天 然V基因组装产物在大肠杆菌系统中的低水平表达问题。
图1为抗氯霉素抗体V区半胱氨酸突变位点；图2 为重叠延伸 PCR 组装 SdSFvc^1，其中，1 为 ScFvcap ； 2 为 VH_CAP_Linker ； 3 为 Linker-VL_CAP ；M 为 IOObp DNA ladder ；图3为^评^^“基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达；其中，1为未诱导的含有 pET2Ia-ScFvc^1的宿主细胞；2为诱导的含有pETZla-scFv^^的宿主细胞；3为未诱导 的含有pETSZa-scFv^H的宿主细胞；4为诱导的含有pETSZa-scFv。^的宿主细胞；M为 marker ；图4为8(1评\ _2基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，其中，1为宿主细胞；2为未 诱导的含有pET21a-SCFVeAP_2的宿主细胞；3为未诱导的含有pETSZa-scFv。^的宿主细胞； 4为诱导的含有pET21a-SCFVeAP_2的宿主细胞；5为诱导的含有pETSZa-scFv^H的宿主细 胞；M 为 marker ；图5为sdsFV。AP_2基因表达产物分离纯化，其中，1为总蛋白；2为超声破碎宿主细胞 得到的上清；3为超声破碎宿主细胞得到的沉淀；4为纯化的包被蛋白；5为复性的SCFvcap。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体的构建1.材料与方法1. 1 材料抗CAP Mab 粗制品、含抗 CAP 的 VH(FJ477893)和 VL(FJ477894)基因的质粒 1 18-11-￥11与？1 18-11-\、氯霉素-卵清蛋白偶联物(CAP-OVA)、大肠杆菌DH5 α等均由本 室制备或保存。大肠杆菌BL21 (DE3)、表达载体pET21a和pET32a均为N0VAGEN公司产品， PMD18-T、Taq 酶、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、DNA lader, TaKaRa MutanBEST Kit 等均 购自大连宝生物工程有限公司，DNA回收试剂盒购自百泰克生物技术有限公司，HisTrap FF 柱(Iml)、HiTrap Protein G 柱(Iml)、HRP-anti_His6 tag 禾口 HRP-goat-anti-mouse IgG 均为GE公司产品，BCA试剂盒为广州美津生物技术有限公司产品。1.2引物设计与合成V基因定点突变用引物VH-ml的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示，VH_m2的核苷 酸序列如SEQ ID NO 5所示，Vfml的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示，VL_m2的核苷酸序 列如SEQ ID NO 7所示。sdsFvCAP组装用引物A(VH5，)的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所 示，B(VH3，-linker)的核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示，C(Linker_VL5，)的核苷酸序列如 SEQ ID NO 10所示，D(Vl3')的核苷酸序列如SEQ ID NO 11所示，E的核苷酸序列如SEQ ID N0:12所示。所有引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。1.3V基因定点突变采用TaKaRa MutanBEST Kit按厂家说明进行。Vh突变模板为pMD 18_T_VH，引物 为 VH-ml 和 VH-m2 ;VL 突变模板为 PMD18-T_Vl，引物为 Vfml 和 Vl-iii2。1. 4sdsFVCAP基因组装与克隆
以上述突变Vh和VJ3CR产物为模板，以引物A与B扩增VH-linker，以引物C与D 扩增 linker-VL。PCR 反应参数为 94°C 5min，94°C 30s, 55 °C 30s, 72°C 30s，共 25 个循环， 72°C 7min。扩增产物以(ff/V)琼脂糖凝胶电泳分离后用DNA回收试剂盒按照厂家说明 书进行目的片段回收。回收片段经适当稀释后进行下述二步扩增反应第一步，Va-Iinker 和Iinker-VL进行重叠延伸，反应条件为94°C 5min，94°C lmin，72°C 1.5min，共5个循环； 第二步，以引物A和D或E和D配对进行常规PCR扩增，反应条件为94°C 5min,94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 1. 5min，共 25 个循环，72°C 7min。A-D 引物对扩增产物以 NdeI-HindIII 双 酶切后按常规方法[8]克隆于表达载体pET21a的相同位点，得表达载体pET21a-SdSFVfflP ； E-D引物对扩增产物以Nc0I-HindIII双酶切后克隆于pET32a的相同位点，得融合表达载 体pET32a-SdSFV。AP。所有表达载体的构建均以大肠杆菌DH5 α为宿主菌，所获表达载体委 托深圳华大基因有限公司进行目的基因表达盒序列分析。经序列分析确证后的表达载体质 粒转化表达宿主菌大肠杆菌BL21 (DE3)，得sdsFveAP工程菌。1. 5sdsFVCAP基因表达诱导SCFvcap工程菌接种于含50 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基，37°C振荡培养过夜，按 1% (V/V)比例转接新鲜LB培养基，继续培养2. 5h，加入IPTG至终浓度lmmol/L进行表达 诱导,共诱导4h。6000r/min离心5min收集菌体。1. 6sdsFVCAP包涵体蛋白分离纯化经表达诱导所获菌体按10% (W/V)悬浮于含500mmol/L NaCl的20mmol/L磷 酸钠缓冲液(PH7. 5)，于冰浴中以300瓦输出功率间歇式超声破碎lOmin，12000r/min离 心IOmin0所获沉淀分别用含2% (V/V)TritonX100、500mmol/LNaCl和不同浓度尿素的 20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)洗涤，最后所获离心沉淀按湿重的1 % (W/V)悬浮 于变性缓冲液(含8mol/L尿素、1 % (V/V) β -巯基乙醇和500mmol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl 缓冲液，pH8. 0)，37°C水浴 3h, 12000r/min 离心 lOmin，所获上清以 HisTrap FF 柱 参照厂家说明进一步纯化，其中平衡缓冲液为含20mmol/L咪唑的变性缓冲液，洗脱缓冲液 为含300mmol/L咪唑的变性缓冲液。1. 7scFVCAP包涵体蛋白的复性变性的目的蛋白参照β-环糊精人工伴侣系统[9]以含18mmol/Li3-环糊精的 20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)进行稀释复性，稀释后的蛋白质溶液中SDS的终浓度控 制为2mmol/L，β -环糊精的终浓度为8mmol/L。稀释液在室温下磁力搅拌过夜。以0. 45 μ m 纤维素膜过滤法去除可见沉淀，以S印hadex G25(GE公司产品)柱按30% (V/V)上样体积 将上述复性产物的缓冲液置换为20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7. 5)。1. 8蛋白质SDS-PAGE与凝胶扫描分析参照常规方法进行各种样品的SDS-PAGE。菌体培养物或纯化过程中的蛋白样品以 2倍上样缓冲液煮沸5min，还原电泳上样缓冲液不含β-巯基乙醇。电泳所获凝胶以“天能 牌”凝胶密度扫描仪按厂家说明进行拍照和表达水平或蛋白质纯度分析。1.9蛋白质浓度测定采用BCA试剂盒参照厂家说明进行，以小牛血清白蛋白为标准品。1. 10抗体亲和力常数测定参照Batty等非竞争性ELISA法[1°]进行，以sdsFVfflP样品和母本单抗4D10平
6行分析，酶标二抗分别为HRP-anti-His6 tag和HRP-goat-anti-mouse IgG。为使母本单 抗与待测SdsFv。AP样品纯度基本一致，将抗CAP Mab粗制品(经辛酸硫酸铵法制备)以 HiTrap Protein G柱按照厂家说明书进行纯化，其中柱平衡缓冲液为20mmol/L磷酸钠缓冲 液(PH7. 4)，洗脱缓冲液为lOOmmol/L的甘氨酸-HCl (pH2. 7)，目的峰样收集于预置中和缓 冲液lmol/L Tris-HCl (ρΗ9· 0)。亲和力常数测定时以1 μ g/ml、2 μ g/ml和4 μ g/ml等三个 不同浓度的CAP-OVA(抗原)包被酶标板，供试抗体经浓度测定后倍比稀释。以抗体的摩尔 浓度(mol/L)为横坐标、以OD45tl值为纵坐标作图，找出其ODmax值，并求出OD450 = 1/2 ODfflax 时相对应的抗体浓度[Ab] 1/2，按公式Ka= (n-l)/[2(n[Ab]1/2' -[Ab]1/2)]分别求出二种抗 原浓度之间的Ka值，其中η为抗原高低浓度之比，[Ab]1/2'为较低浓度抗原对应的[Ab]1/2。 所得三个Ka值的算术平均值即为抗体的亲和常数，单位为摩尔浓度的倒数，即L/mol。2结果与分析2. IV基因突变与组装参照文献报道的半胱氨酸引入位点分别对抗氯霉素抗体Vh和\基因进行定点突 变，突变V基因经测序确证后采用重叠延伸PCR法组装成VH-linker-\型sdsFVeAP，其中的 linker序列为(Gly4Ser)3。突变的氨基酸残基位点如图1所示，Vh的突变位点为第2框架 区的第49位氨基酸，与Kabat数据库Vh的保守序列第44位氨基酸残基相对应；\的突变位 点为第4框架区的第120位氨基酸，与\的保守序列第100位氨基酸残基相对应。SdsFVfflp 基因组装结果如图2所示，经重叠延伸PCR所得sdsFVCAP基因片段与理论大小一致，大小约 为790bp，经序列分析与设计序列一致，定名为sdsFV。^ (GenBank ID ⑶258050)。专利中， 单纯基因序列的表示有一个专门的序列表格式，不可以放到说明书附图中。2. 2sdsFVCAP-l基因克隆与表达上述sdsFVcn基因组装产物克隆于表达载体pET21a和pET32a，以便在宿主菌大 肠杆菌BL21(DE3)中进行独立表达或融合表达。表达诱导结果如图3所示，结果表明，在强 启动子T7驱动下，SCIsFVqum基因不能有效单独表达，但当其5’端融合于硫氧环蛋白(Trx) 基因之后时即可高效表达，表达产物大小约为45KD，与理论值一致。通过PCR引物对SCIsFVqum基因5’端进行同义突变，以便优化目的基因。将 30bp序列内所有密码子中的第3位碱基G或C全部置换成A或T，得到同义突变型基因 sdsFVCAP_2 (GenBank ID :GU258050)。所获 sdsFVCAP_2 基因 5，端 30bp 序列内的 GC 含量由 60% 降至36 %，克隆于表达载体pET21a后独立表达时即可高效表达(图4)，表达产物大小约为 28KD，与理论值一致，表达水平与融合表达相似，达到30%以上。2. 3sdsFVCAP-2基因表达产物分离纯化与分析sdsFVCAP_2基因表达产物分离纯化结果如图5所示。结果表明，sdsFVeAP_2基因表 达产物主要以包涵体蛋白存在，因为目的大小的蛋白主要出现在菌体超声破碎沉淀中。包 涵体经含2mol/L尿素的缓冲溶液简单洗涤后纯度达到90%以上，但所获包涵体蛋白经变 性后以HisTrap预装柱进行基于His标签的亲和层析纯化并未见纯度显著提高。包涵体蛋 白可完全被8mol/L尿素溶液裂解，变性蛋白采用常规的稀释复性法复性时绝大部分目的 蛋白被聚沉，但采用环糊精分子伴侣系统复性未见显著沉淀。所获复性溶液与纯度相 近(90%)的母本抗体所进行的平行分析结果表明，SdSFvau^f氯霉素的亲和力与母本抗体 4D10的相似，二者的亲和力常数分别为7. OX 10_9L/mOl和4. 5X 10_9L/mOl。
权利要求
一种二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO1所示。
2.一种编码权利要求1所述二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体的cDNA，其特征在于其核 苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.权利要求1所述二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体的构建方法，其特征在于是以抗氯 霉素抗体可变区基因为模板，通过引物突变PCR在轻链和重链的可变区分别加入一个半胱 氨酸定点突变，以重叠延伸PCR组装成二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体基因，再通过引物 突变PCR在目的基因的5’端30bp序列内引入同义突变，以降低该序列内的GC含量，将该 基因转导入大肠杆菌表达系统中，表达的蛋白即为二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体。
4.一种试剂盒，其特征在于所述试剂盒中包含权利要求1所述二硫键稳定的抗氯霉素 单链抗体。
5.权利要求1所述二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体在残留氯霉素的检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体及其构建方法和应用。本发明抗氯霉素单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明以抗氯霉素抗体可变区基因为模板，通过引物突变PCR在轻链和重链的可变区分别加入一个半胱氨酸定点突变，以重叠延伸PCR组装成二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体基因，通过引物突变PCR在基因的5’端30bp序列内引入同义突变后，将基因转导入大肠杆菌表达系统中，表达的蛋白即为二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体。本发明抗氯霉素单链抗体通过模拟天然抗体的结构，在单链抗体的基础上引入一对二硫键的构建形式，可以提高抗体的稳定性。本发明二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体可以取代单克隆抗体用于氯霉素残留检测。
文档编号C12N15/70GK101935350SQ20101023695
公开日2011年1月5日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者唐伟, 李黄金, 柴伟佳, 赵林, 陈伟 申请人:广东药学院