专利名称：一种除草剂抗性基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种除草剂抗性基因、其所编码的蛋白质 及利用其制备或培养的转基因质粒、转基因工程菌株、除草剂抗性植物和高抗逆性植物。
背景技术：
目前，开发非选择性广谱除草剂和其相应的抗性植物是杂草控制的主要模式 之一° 对轻苯基丙丽酸双力口氧Bl (4-hydroxy-phenylpyruvate dioxygenase, HPPD ；EC 1. 13. 11. 27)的抑制剂是一类新近开发的白化型除草剂家族，其作用靶标酶HPPD是植物质 体醌生物合成途径的关键合成酶类。其作用机理是，通过对HPPD酶的抑制，减少质体醌和 合成，进一步导致类囊体中类胡萝卜素生物合成减少，引起叶片白化症状，从而达到除草的 目的。随着HPPD酶抑制剂类除草剂的使用，人们开始研究培育抗HPPD抑制剂型除草剂 的转基因作物。目前，主要有三种培育策略，第一种策略是将对抑制剂敏感的基因转入植物 体中超表达(MMatringe etal.，2005)；第二种策略是绕过HPPD的通路，分别由三个酶代 替HPPD催化底物进行反应，以抵消除草剂对HPPD的抑制作用；第三种策略是在转HPPD基 因植物中增加底物水平。以上三种策略不同程度的得到了抗除草剂转基因植株，但是其抗 性效果均不理想，尤其是后两种策略实施起来十分复杂，而多基因的表达水平又很难控制。为此，寻找一种更为有效和便捷的方法制备出抗HPPD抑制剂型除草剂的转基因 作物，成为人们亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种除草剂抗性基因，此除草剂抗性基因为HPPD 抑制剂型除草剂的抗性基因，通过基因工程技术将其导入植物细胞，制备出的转基因植物 对HPPD抑制剂型除草剂具有天然抗性，同时具有高抗逆性。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是一种除草剂抗性基因，其包含SEQ ID NO 1中的碱基序列。一种除草剂抗性蛋白质，其包含SEQ ID NO 2中的氨基酸序列。一种质粒，其包含所述除草剂抗性基因。本发明所述的质粒为植物表达质粒。本发明所述质粒中的除草剂抗性基因处于CaMV35S启动子、NOS终止子的调控之 下。一种基因工程菌株，其包含所述除草剂抗性基因。制备本发明所述的基因工程菌株所使用的细菌为根癌农杆菌LBA4404。一种除草剂抗性植物的培养方法，首先利用Gateway技术将权利要求1所述的 除草剂抗性基因导入植物双元表达载体PGWB2，再利用此植物表达载体转化根癌农杆菌 LBA4404,经卡那霉素抗性和潮霉素抗性筛选获得阳性根癌农杆菌LBA4404，利用其侵染植物无菌苗叶片，再经卡那霉素抗性筛选和植株再生，获得转基因除草剂抗性植株。一种具有高抗逆性的植物的培养方法，首先利用Gateway技术将权利要求1所述 的除草剂抗性基因导入植物双元表达载体PGWB2，再利用此植物表达载体转化根癌农杆菌 LBA4404，经卡那霉素抗性和潮霉素抗性筛选获得阳性根癌农杆菌LBA4404，利用其侵染植 物无菌苗叶片，再经卡那霉素抗性筛选和植株再生，获得具有高抗逆性的植物。采用上述技术方案所产生的有益效果在于利用本发明的基因可以构建对HPPD 抑制剂型除草剂具有天然抗性的作物，从而可以扩大HPPD抑制剂型除草剂的除草谱，同时 提高其使用效率，为我国的农作物田间除草提供一条有效的新途径；同时利用本发明的基 因还可以提高作物的抗盐等逆境胁迫能力。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是转基因烟草PCR分析的结果；图2是在20 μ mol/L DTP胁迫下野生烟草苗的生长情况；图3是在20 μ mol/L DTP胁迫下转基因烟草幼苗苗高情况；图4是在20 μ mol/L DTP胁迫下转基因烟草幼苗根长情况；图5是在20 μ mol/L DTP胁迫下转基因烟草幼苗鲜重情况；图6是在20 μ mol/L DTP胁迫下转基因烟草幼苗叶绿素a含量变化情况；图7是在20 μ mol/L DTP胁迫下转基因烟草幼苗叶绿素b含量变化情况；图8是在20 μ mol/L DTP胁迫下转基因烟草幼苗类胡萝卜素含量变化情况；图9是野生烟草幼苗在含NaCl的培养基中的生长情况；图10是转基因烟草Q在含NaCl的培养基中的生长状况；图11是转基因烟草S在含NaCl的培养基中的生长状况；图12是在NaCl胁迫培养下转化苗鲜重相对增长量情况；图13是在NaCl胁迫培养下转化苗根长相对增长量情况；
图14是在NaCl胁迫培养下转化苗株高相对增长量情况；图15是在NaCl胁迫下转基因烟草幼苗叶绿素a含量变化情况图16是在NaCl胁迫下转基因烟草幼苗叶绿素b含量变化情况；图17是在NaCl胁迫下转基因烟草幼苗类胡萝卜素含量变化情况；
具体实施例方式以下实施例详细的说明了本发明。其中所使用的分子生物学和生物化学方法， 如包含启动子、目的基因、终止子的表达构件的制备、植物转化质粒的构建、目的基因植物 转化技术、植株再生技术等，均为成熟的已知技术；在Ausubel编写的、John Wiley and Sons 公司出版的《Current Protocols in Molecular Biology》禾口 J. Sambrook 等编写的、 Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)出片反白勺〈〈Molecular Cloning :Labortory Manual)), 3rd ED.等文献中均有详细的说明。以下实施例所使用的部分培养基、母液配方如下(I)YEB培养基牛肉膏5g/L，酵母抽提物lg/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgSO42mmol/L, pH7. 2，固体培养基含琼脂15g/L。(2)烟草分化培养基:MS 培养基 +3mg/L 6-BA+O. 2mg/L NAA。(3)烟草生根培养基1/2MS培养基(即大量元素减半的MS培养基)。(4)卡那霉素(Kan)母液100mg/ml，过滤除菌，分装，_20°C保存。(5)羧苄青霉素(Cb)母液50mg/ml，过滤除菌，分装，_20°C保存。(6)链霉素(Sm)母液100mg/ml，过滤除菌，_20°C保存。本发明的具体实施步骤如下1、对HPPD抑制剂型除草剂具有高抗性的黄连(Coptis japonica)培养细胞cDNA 文库的获取本发明所用黄连(Coptis japonica)培养细胞cDNA文库来自京都大学大学院生 命科学研究科。2、黄连(Coptis japonica)HPPD 基因的克隆采用5' RACE法延伸cDNA 5'末端克隆黄连(Coptis japonica)HPPD基因，具体 步骤为，采用Gene Racer (Invitrogen)试剂盒，以试剂盒提供的引物(Gene Racer 5' ρ rimer) 5' -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3 ‘(如 SEQ ID NO 3)和基于 EST 核苷酸序列设计 的引物(Gene-specific reverse primer) 5' -CATGCGTAGCGAACAAATCGGCCGAGGT-3 ‘(如 SEQ ID NO 4)为引物，以黄连(Coptis japonica) ICT1X 5' -RACE cDNA 为模板，用 DNA 聚 合酶(Taq酶)进行5'末端扩增；PCR条件为，94°C 2min、94°C 30sec、72°C lmin，5个循 环；94°C 30sec、70°C lmin，5 个循环；94°C 30sec、64°C 30sec、72°C lmin，25 个循环；最后 延伸72°C 10min、4°C 99min 99sec ；琼脂糖凝胶电泳分离、回收特异PCR扩增产物，连接入 pGEM-Teasy载体，转化E. coli DH5 α感受态细胞，Colony PCR法鉴定阳性重组克隆，提取 重组质粒DNA，进行序列测定，与原质粒DNA序列进行BLAST序列比对分析，得黄连(Coptis japonica) HPPD基因的cDNA碱基序列如SEQ ID NO 1所示。3、植物表达载体的构建利用Gateway技术快速构建植物表达载体，具体步骤为，向黄连(Coptis japonica)HPPD基因开放阅读框架上游5'末端起始密码子ATG之前引入定向克隆所必须 的包含4个碱基对(CACC)的序列，设计正向引物为Topo Fw(24nt) 5' CAC CAT GGT TCC CAG CAC AGC CTC 3'(如 SEQ ID NO 5)，
反向引物为ORF的3 ‘端序列Topo Rv(30nt) 5' CTA TGC AGC AAC AAC ATT AGC TTT GGC CTC 3'(如 SEQ ID NO 6)，PCR扩增黄连(Coptis japonica)HPPD基因开放阅读框架的平末端产物(PCR扩增 条件为 94°C 2min、94°C 15sec、58°C 30sec、68°C 1. 5min，30 个循环，68°C 5min)，之后转化大 肠杆菌获得含有黄连(Coptis jap0niCa)HPPD基因开放阅读框架的入门克隆，选择适用于 Gateway技术的植物双元表达载体pGWB2作为目的载体，利用LR重组反应将入门克隆中的 黄连(Coptis japonica)HPPD基因开放阅读框架引入表达载体。4、根癌农杆菌LBA4404的转化(1)根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备①挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基(含链霉素125 μ g/
5ml)中，28°C过夜培养；②取过夜培养的菌液500 μ 1接种于YEB(含链霉素125 μ g/ml)液体培养基中 28 °C振荡培养至0D600为0. 5 ；③ 5000rpm，离心 5min ；④加IOml 0. 15M NaCl悬浮农杆菌细胞，5000rpm，离心5min ；⑤Iml预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，24h内使用，或分装成每管200 μ 1，液 氮中速冻lmin，-70°C保存备用。(2)植物表达载体向根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的转化取200 μ 1感受态细胞，加入Iyg构建好的植物表达载体质粒DNA，液氮中速 冻lmin，37°C水浴5min，然后加入Iml YEB培养基，28°C慢速振荡培养4h ；IOOOrpm离心 30sec，弃上清，加入0. Iml YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有50 μ g/ml Kan,50y g/ml 潮霉素和125 μ g/ml Sm的YEB平板上，28°C培养约48h。(3)阳性克隆的鉴定挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养基中，28°C振荡过夜培养；小量提 取质粒DNA，以植物表达载体质粒DNA为模板进行PCR扩增鉴定(PCR扩增条件为94°C 2min、 94°C 40sec、50°C 50sec、72°C 1. 5min，30 个循环，72°C IOmin)，阳性克隆 _80°C保存菌种。5、转基因烟草植株的获得与筛选(1)根癌农杆菌LBA4404的培养①挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落，接种在20ml含125mg/L Sm和 50mg/L Kan+50mg/L潮霉素的YEB液体培养基中，28°C，180rpm振荡培养过夜；②活化过夜的农杆菌按1 50的比例接种在相同的YEB液体培养基中，继续培养 至对数生长期；③5000rpm离心5min，收集菌体，用1/2MS液体培养基(即大量元素减半的MS培 养基)悬浮至0D600 = 0. 2 0. 5，准备感染用。(2)外植体的侵染及共培养①取烟草无菌叶片，切成4 6mm的叶盘(或用打孔器制取)，叶盘外植体浸入农 杆菌菌液中，感染IOmin 20min，取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液；②将浸染过的外植体接种在MS培养基上，暗培养3d。(3)选择培养将共培养的外植体转移到含500mg/L Cb和100mg/L Kan分化培养基上，25°C，光 照培养。(4)继代培养每隔2-3周继代一次，并逐渐降低Cb的浓度至200mg/L。(5)生根培养待培养筛选的抗性芽长至1 1. 5cm时，切下并转入含有200mg/LCb和100mg/L Kan的生根培养基上诱导生根，获得具有卡那霉素抗性的转基因植株。6、转基因烟草PCR分析采用SDS法小量提取烟草基因组DNA，具体步骤为，将烟草组织0.5g放于研钵中， 液氮研磨至粉末状，将粉末转入Eppendorf管中，向管中加入800 μ L SDS裂解缓冲液，震荡混勻，65°C水浴20min，向上述Eppendorf管中加入250 μ L 5mol/L的乙酸钾，震荡混勻，冰 浴5min, 12000rpm，4°C离心15min，将上清液置于新的Eppendorf管中，12000rpm，4°C离心 5min，将上清液置于新的Eppendorf管中，加入600 μ L异丙醇，12000rpm离心5min，弃上清 液，沉淀用70%乙醇漂洗2次(每次加70%乙醇600 μ L)，12000rpm离心5min，提取的DNA 干燥后溶于200 μ L TE缓冲液或40 μ L无菌双蒸水中，_20°C保存备用，取5 μ L提取的基因 组DNA进行电泳检测基因组完整性。以重组质粒DNA为模板进行PCR扩增作为阳性对照，以野生型烟草基因组DNA为 模板进行PCR扩增作为阴性对照；按照下表在12. 5μ L体系下依次加以下成分表1转基因烟草PCR分析的反应体系 按以下程序进行PCR扩增94°C预变性5min ；94°C变性15s ；60°C退火30s ；72°C延 伸1. 5min ；循环30次；72°C延伸5min ；4°C保温。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果参看附图1，携带有外源基因的转基因 烟草可以扩增出与质粒扩增产物大小一致的约1.3kb的目的条带，而作为对照的未转化野 生型烟草中没有相应大小的产物，转化率达到80%。7、转基因烟草除草剂抗性分析取转基因烟草种子分装于1. 5mL Eppendorf管中，按表2方法消毒表2种子消毒方法 消毒后，用无菌水反复冲洗3次，种植于1/2MS培养基(即大量元素减半的MS培 养基)中，封口膜封口，28°C光照培养。取20d的生长状态均一的转基因烟草小苗带根种植到HPPD抑制剂型除草剂DTP 浓度为20 μ mol/L的1/2MS培养基(即大量元素减半的MS培养基)中，光照培养45d后观 察烟草苗生长情况，并测定烟草苗跟长、苗高、苗重、丙二醛和类胡萝卜素含量变化。本实验以野生烟草做对照实验，结果如下在20 μ mol/L DTP胁迫45d后，野生烟草苗生长情况如附图2所示，野生幼苗生长 缓慢，苗的根部几乎未生长且呈现褐色，有部分苗的根出现褐色愈伤组织，叶片小而严重白 化，部分叶片已经枯萎；转化烟草幼苗能够保持基本正常生长，根、茎、叶生长基本未受太大 影响，整体状况明显优于野生；经测量，转化烟草苗平均株高达到未转化烟草苗株高的2倍左右(如图3)，根长达 到未转化烟草苗的6倍(如图4)，鲜重约达到未转化烟草苗的2倍(如图5)；经检测，转化苗Q和S叶绿素a含量分别达到野生苗的9. 5倍和18倍，见图6 ；叶 绿素b含量达到4. 8倍和8. 8倍，见图7 ；类胡萝卜素含量达到5倍和8. 4倍，见图8。8、盐胁迫对转基因烟草幼苗生长影响将经常规消毒萌发的转基因烟草幼苗转接到含NaCl浓度分别为0，0. 3%,0. 5%, 0.8%，1.0%的1/21^培养基(即大量元素减半的MS培养基)中，一月后观察幼苗生长情 况并测定鲜重、苗高、根长等生理指标。本实验以以野生烟草幼苗做对照实验，结果如下烟草种子在盐胁迫下萌发结果表明，转基因烟草种子萌发及生长情况在各个盐 浓度梯度下均好于相应条件下野生烟草种子；当盐浓度升高到时，转化种子发芽率为 50%以上，而野生烟草种子发芽率低于20% ；野生烟草幼苗在含NaCl的1/2MS培养基(即大量元素减半的MS培养基)中生长 情况如附图9所示，在生长过程中，野生幼苗根系生长受到抑制，并且幼苗随盐浓度的增加 和培养时间延长而逐渐变黄直至枯萎死亡；参看附图10和附图11，图中，A-E为转基因烟草1在NaCl浓度分别为0，0.3%， 0.5%,0.8%,1.0%的培养基中的生长状况；F-J为转基因烟草苗2在NaCl浓度分别为0， 0.3%,0. 5%，0. 8%，1. 0%的培养基中的生长状况；可见，在NaCl浓度低于0. 5%情况下， 转化苗根系发达、叶片绿色、生长状态正常；盐浓度提高到时，转化苗出现生长缓慢现 象但是依然保持绿色；在NaCl胁迫培养下的转化苗鲜重相对增长量明显高于是野生苗相对增长(如图12)；同样，在NaCl胁迫条件下的转化苗根长(如图13)和株高(如图14)相对增长也明显 高于野生苗相对增长；在盐胁迫下，转化烟草苗叶绿素a和b的含量随着盐浓度的增高而略有降低，但幅 度很小；而对照野生苗叶绿素a和b的含量在盐浓度为0. 3%时已经降到很低，约为转化苗 的1/60和1/220，见图15和16 ；盐胁迫下，类胡萝卜素含量野生型低至检测不到，而转化型 基本能够保持不变，见图17 ；结果证明转基因烟草具有优良的抗盐胁迫性。本发明采用烟草为样本进行了试验，其对于水稻、玉米、大豆、小麦等作物同样适 用。本发明所述的HPPD抑制剂型除草剂主要包括吡唑类、异噁唑类和三酮类除草剂。上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一 限制条件。
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权利要求
一种除草剂抗性基因，其特征在于包含SEQ ID NO1中的碱基序列。
2.—种权利要求1所述的除草剂抗性基因编码的除草剂抗性蛋白质，其特征在于包含 SEQ ID NO 2中的氨基酸序列。
3.一种质粒，其特征在于包含权利要求1所述的除草剂抗性基因。
4.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于其为植物表达质粒。
5.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于其除草剂抗性基因处于CaMV35S启动子、 NOS终止子的调控之下。
6.一种基因工程菌株，其特征在于包含权利要求1所述的除草剂抗性基因。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌株，其特征在于制备此基因工程菌株所使用的 细菌为根癌农杆菌LBA4404。
8.一种除草剂抗性植物的培养方法，其特征在于首先利用Gateway技术将权利要求1 所述的除草剂抗性基因导入植物双元表达载体PGWB2，再利用此植物表达载体转化根癌农 杆菌LBA4404，经卡那霉素抗性和潮霉素抗性筛选获得阳性根癌农杆菌LBA4404，利用其侵 染植物无菌苗叶片，再经卡那霉素抗性筛选和植株再生，获得转基因除草剂抗性植株。
9.一种具有高抗逆性的植物的培养方法，其特征在于首先利用Gateway技术将权利 要求1所述的除草剂抗性基因导入植物双元表达载体PGWB2，再利用此植物表达载体转化 根癌农杆菌LBA4404，经卡那霉素抗性和潮霉素抗性筛选获得阳性根癌农杆菌LBA4404，利 用其侵染植物无菌苗叶片，再经卡那霉素抗性筛选和植株再生，获得具有高抗逆性的植物。
全文摘要
本发明公开了一种除草剂抗性基因及其应用，包括SEQ ID NO1中的碱基序列；还包括一种除草剂抗性蛋白质，其包含SEQ ID NO2中的氨基酸序列；还包括一种植物表达质粒，其包含所述除草剂抗性基因。此除草剂抗性基因为HPPD抑制剂型除草剂的抗性基因，通过基因工程技术将其导入植物细胞，制备出的转基因植物对HPPD抑制剂型除草剂具有天然抗性，同时具有抗盐等高抗逆性。
文档编号C12N15/29GK101892247SQ20101023862
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月21日 优先权日2010年7月21日
发明者于静娟, 吴科瀛, 梁玉玲, 管延英 申请人:河北大学