专利名称：一种在毕赤酵母中有效的表达阳离子抗菌肽的方法
技术领域：
本发明涉及基团工程领域，具体地，本发明涉及一种在毕赤酵母中有效的表达阳 离子抗菌肽的方法。
背景技术：
阳离子抗菌肽(cationic antibacterial peptides)是一般由12 50个氨基酸 残基组成的阳离子型(含过多的赖氨酸和精氨酸)的两性小分子多肽。在动物、植物和微 生物中广泛存在，是宿主免疫防御系统的重要组成部分，其抗菌谱宽、免疫原性低，而且不 易产生耐药性的特点及有抑制癌细胞生长的作用，这使得抗菌肽开发利用成为近年来的研 究热点。但阳离子抗菌肽的开发利用并非易事，抗菌肽天然资源有限，提取非常复杂；化学 合成，不但成本很高，还对环境造成严重污染。因此迫切需要一种廉价安全的生产技术来生 产抗菌肽。基因工程生产方法可能是最经济的获得大量抗菌肽的方法。目前抗菌肽基因工程表达主要在大肠杆菌和酵母菌系统中进行。酵母菌表达体系 具有直接分泌抗菌肽的能力，易于直接从发酵液中分离抗菌肽，相比大肠杆菌表达体系更 易于大规模工业化生产。但是，由于抗菌肽是小分子含有多个碱性氨基酸的碱性多肽，极易 受到蛋白酶的攻击。同时表达的产物往往对宿主细胞有毒性，会直接抑制宿主菌的生长，影 响表达效率。因此抗菌肽的外源表达较其它多肽类药物更为困难。另外，筛选抗茵肽的高 效表达工程菌时，通常采用抗菌肽有特殊的抗菌活性，通过抑菌实验筛选，那么每次就要对 成千上万的转化子进行鉴定，先对每个转化子进行初步筛选，利用抗菌筛选抗菌活性相对 较高的工程菌，再来进行复筛，这样要消耗大量的人力和物力。因此，如何解决抗菌肽免受 蛋白酶的攻击，减少其对宿主细胞的毒害，以及如何筛选高效表达抗菌肽的酵母工程菌成 为了抗菌肽事业发展的瓶颈。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种在毕赤酵母中有效的表达阳离子抗菌肽的方法。根据本发明的在毕赤酵母中有效的表达阳离子抗菌肽的方法包括以下步骤1)改造阳离子抗菌肽或其前体序列，在其两端添加毕赤酵母自身蛋白酶的酶切 位点，并合成改造后的序列；2)将上述合成序列插入毕赤酵母表达载体中，得毕赤酵母表达载体_阳离子抗菌 肽序列的重组表达载体；3)将在毕赤酵母中表达的、表面带负电荷的酸性酶插入到上述重组载体中所述阳 离子抗菌肽序列之后，得毕赤酵母表达载体_阳离子抗菌肽_酶的重组表达载体；4)将上述毕赤酵母表达载体_阳离子抗菌肽_酶重组表达载体在毕赤酵母中表 达。本发明的方法可以通过酸性带负电荷的酶带动阳离子抗菌肽的表达；酸性酶的大量酸 性氨基酸可以中和阳离子抗菌肽的碱性氨基酸，使其免受宿主蛋白酶的攻击；可以直接通 过表达的重组酶的活力的大小来判断抗菌肽产量的高低；同时表达产物和抗菌肽可以同时直接被应用。因此，根据本发明的方法，为了提高融合蛋白的表达量，所使用的与阳离子抗菌肽 融合表达酶首先应为在毕赤酵母中表达、优选高效表达的酶。同时，为了中和阳离子抗菌 肽的碱性氨基酸，所使用酶应为表面静电势低的酸性酶，如酸性木聚糖酶XYL11A，酸性淀粉 酶、酸性甘露聚糖、酸性磷酸酶、酸性葡聚糖酶、酸性果胶酶、酸性蛋白酶，本领域普通技术 人员基于本发明的技术方案可以理解，现有技术中已经公开的可以在毕赤酵母中表达、且 表面静电势低的酸性酶都适于本发明的技术方案。在本发明的具体实施例中，所使用的阳离子抗菌肽为抗菌肽鲎素Tachyplesin I， 但是本领域普通技术人员基于本发明的技术方案可以理解现有技术中已知的其它阳离子 抗菌肽也适于本发明的方法。根据本发明的方法，所述毕赤酵母表达载体可以是本领域公知公用或已知的，如 载体PPIC9。在本发明的一具体实施例中，所使用的酸性木聚糖酶XYL11A，从Bispora sp. MEY-I (CGMCC No. 2500)中克隆得到(该菌株已在中国专利申请CN200810113342. 9中公开)。在本发明的一具体实施例中，所使用的阳离子抗菌肽为抗菌肽鲎素 TachyplesinI，根据阳离子抗菌肽鲎素Tachyplesin I的前体序列，在抗菌肽成熟多肽末端 添加KEX2酶切位点。以所得到的新的氨基酸序列为模板，根据毕赤酵母密码子的偏爱性设 计含有KEX2酶切位点的Tachyplesin I的前体的基因序列，并送公司合成。在本发明的一具体实施例中，先通过Xho I和EcoR I将含有KEX2酶切位点的 Tachyplesin I的前体的基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9中，得到pPIC9_Tal ；再以 pPIC9-Tal为受体将酸性木聚糖酶xylllA通过EcoR I和Not I连接上去，得到融合表达 载体pPIC9-Tal-xyl，这样，在融合蛋白之间引入酵母菌自身蛋白酶的酶切位点，在分泌表 达融合基因时，将融合基因切割成酸性酶和阳离子抗菌肽。融合表达载体pPIC9-Tal-xyl 用限制性内切酶Bgl II进行线性化后，利用电击法转化毕赤酵母，通过组氨酸营养缺陷型 筛选转化子。转化子被接种到BMGY培养基培养48小时，再转移到诱导培养基BMMY进行诱 导表达。通过木聚糖酶活性检测筛选高产木聚糖酶的转化子。本发明提供的方法是采用含有大量酸性氨基酸的酸性酶和阳离子抗菌肽前体建 成融合蛋白，使其属于同一个基因中。同时在融合蛋白之间引入酵母菌自身蛋白酶的酶切 位点，在分泌表达融合基因时，将融合基因切割成酸性酶和阳离子抗菌肽。本发明的优点主 要有第一、本发明选用的在毕赤酵母中高效表达的酶，因此将其与抗菌肽融合表达时，可 以提高抗菌肽的表达量；第二、高负电荷的酸性酶可以中和阳离子抗菌肽的正电荷，从而可 以使抗菌肽免受宿主蛋白酶的攻击；第三、与酸性木聚糖酶融合表达，也可以减少抗菌肽对 宿主的毒害作用；第四、一分子的酸性酶就对应一分子的融合抗菌肽，这样就可以利用酸性 酶的活性来指示抗菌肽的表达量，简化高表达菌株的筛选；第五、表达产物同时具有酶的活 性和抗菌活性，而这两种活性物质都可以直接用于工业化应用。因此该方法一举多得，具有 很好的应用前景。
图1实施例1中酸性木聚糖酶、抗菌肽的拼接具体过程。
图2抗菌肽活性的测定结果。
重组毕赤酵母菌株巴斯德毕赤酵母Tal-Xyl-46(PiChia pastoris)(保藏编号 CGMCCNo.4024，保藏日期2010年7月21日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会， 保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)。
具体实施例方式实施例1酸性木聚糖酶基因的克隆及序列分析利用总RNA提取试剂盒从Bispora sp. MEY-I中提取总RNA，用于进行RT-PCR。以 5 μ g总RNA为模板oligo (dT)为引物合成cDNA的第一链，利用酸性木聚糖酶XYLllA的上 下游引物xylllA-F和xylllA-R(见表1)PCR扩增获得木聚糖酶基因xylllA的cDNA的全 长片段。将该片段克隆到PEASY-T3载体上，得到PEASY-T3-XylllA，测序证明正确后以此为 模板进行木聚糖酶成熟蛋白基因序列的克隆。根据已克隆的木聚糖酶XYLllA成熟蛋白基因编码序列设计引物XylllA-m-F 和xylllA-m-R，同时在引物的末端引入酶切位点EcoR I和Not I，以经测序正确的 PEASY-T3-XylllA 质粒为模板，进行 PCR 扩增。PCR 反应参数为:95°C 5min ；94 °C 30sec, 62°C 30sec，72°C 90sec，32个循环；72°C IOmin0 PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物。表1扩增木聚糖酶基因所用的引物 木聚糖酶xylllA基因cDNA长618bp，编码205个氨基酸和一个终止密码子，N端 17个氨基酸为预测的信号肽序列(图3-8)，成熟蛋白理论分子量20. 3kDa。成熟蛋白中含 有19个酸性氨基酸，占到氨基酸总数的10%。经表面静电势分析表明，酸性氨基酸主要分 布在木聚糖酶XYLllA的分子表面，即在中性pH条件下XYLllA带有大量的负电荷。木聚糖 酶XYLllA的最适pH为3. 0，且在pH2. 2 4. 5范围内，酶活性均能维持在70%以上，pH在 6.0以上检测不到酶活性。其基因序列如SEQ ID NO. 1所示ATCCCAACCATTGAGAAGCGCAATCCAGGCGGCATCAATTACGTGCAAAATTACAATGGTGATGTTGCA GACTTTCAATACAACGAAGGTGCAGGTACCTACACTTGCAGCTGGGATGGCTCGACTGACTTTGTGGTTGGTCTCGG CTGGTCGACTGGTGCTGCTCGGGACATTACTTACTCAGCTACCTACAATGCGGGCGGGTCGGGTTCTTACCTAGCTG TCTACGGCTGGGTCAACTCACCTCAGGCGGAGTACTACATTGTTGAATCATACGGCGACTACAATCCATGTTCTGAT GCTGAAAGCCTGGGAACCCTCGAATCTGACGGCAGCACTTACACGGTCTGCACGGACACTCGCACCAATGAACCGTC CATCACCGGTACCAGCACGTTCACCCAATATTGGTCAGTCCGTCAGAGCGAACGCACATCGGGGACTGTCACTGTTGGAAACCATTTCAATTATTGGGCGCAGCACGGCTTTGGCGACTCCTACAACTTCCAGGTCATGGCTGTGGAGGCTTTC TCTGGCTCGGGAAGTGCCAGTGTCTCTGTATCTTAG实施例2阳离子抗菌肽鲎素前体的基因及KEX2酶切位点的合成<2_1>抗菌肽基因的人工合成 KR:是酵母自身蛋白酶KEX2的识别位点，在R后端进行切割EA:是酵母自身蛋白酶STE13的识别位点，在A后端进行切割KffCFRVCYRGICYRRCKR 是具有抑菌活性的阳离子抗菌肽鲎素Ta I的序列GKRNEVRQYRDRGYDVRAIPDETFFTRQDEDEDDDEE 抗菌肽前体部分序列按照毕赤酵母密码子的偏爱性，在不改变其氨基酸序列的前提下进行序列改造， 尽量避免富含AT序列的出现，该些序列与mRNA的稳定性有关。并设计两端的多克隆位点 BamH I-Xho I 和 EcoR I，BamH I 和 EcoR I 用于连接 pUC19，而 Xho I 和 EcoR I 用于连接 PPIC9载体。每个引物约为60base以内的引物，互补两个引物有24个以上的碱基能互补配 对。将引物送交上海生工生物工程有限公司进行人工合成，片段的拼接的具体过程根据图 1所示。<2->2寡聚DNA小片段的拼接①将合成的各DNA小片段用去离子水溶解，每IOD用200 μ L水溶解。②磷酸化37°C水浴保温Ih。寡聚片段2 μ LT4多聚核苷酸激酶 3UIOX反应缓冲液IyLATP1 μ L_补水至IOyL③将各基因的DNA小片段按等摩尔比合并成一管。95°C水浴保温5min后退火，自 然冷却至室温。<2-3>退火基因片段的克隆利用BamH I和EcoRI将pUC19载体进行双酶切处理，处理后的载体与选用与片段 两端限制性内切酶相同的酶BamH I和EcoRI，将pUC19载体进行双酶切处理。无菌水适量DNA适量IOXbuffer4μ L
BamH IIOUEcoR IIOU_总体积40 μ L37°C保温1. 5h后，电泳回收质粒载体，并与退火基因片段进行连接，转化大肠杆 菌JM109感受态细胞，阳性克隆子通过测序确定Tal序列。实施例3融合基因Tal-xyl表达质粒载体的构建首先将含有KEX2酶切位点的Tachyplesin I前体的基因连接到毕赤酵母表达载 体pPIC9上，得到pPIC9-Tal，即先通过Xho I和EcoR I限制性内切酶处理pUC19_Tal和 PPIC9，电泳后回收载体pPIC9和Tal片段，连接转化后挑选出pPIC9_Tal阳性克隆子。再 利用同样的方法，将酸性木聚糖酶xylllA连接到pPIC9-Tal上，即通过EcoR I和Not I限 制性内切酶处理pPIC9-Tal和PCR扩增得到的酸性木聚糖酶xyl IlA的成熟蛋白区域，电泳 后回收载体pPIC9_Tal和xylllA片段，连接转化后得到融合表达载体pPIC9-Tal-Xyl，并 利用酶切验证的方法挑选出pPIC9-Tal-xyl阳性克隆子，进一步通过测序验证序列的正确 性，用于下一步的转化。融合基因Tal-xyl的全基因序列如SEQ ID NO. 2所示AAGAGAGAAGCTGAAGCCGAAGCCGAAGCCAAGTGGTGTTTTAGAGTCTGCTACCGTGGTATTTGTTAC CGTAGATGTAAGAGAGAGGCAGAGGCAGAAGCTGGTAAGAGAAACGAGGTTAGACAATACAGAGACAGAGGTTACGA CGTTAGAGCCATTCCAGACGAGACCTTCTTCACCAGACAAGACGAGGACGAAGATGACGATGAGGAAGAATTCATCC CAACCATTGAGAAGCGCAATCCAGGCGGCATCAATTACGTGCAAAATTACAATGGTGATGTTGCAGACTTTCAATAC AACGAAGGTGCAGGTACCTACACTTGCAGCTGGGATGGCTCGACTGACTTTGTGGTTGGTCTCGGCTGGTCGACTGG TGCTGCTCGGGACATTACTTACTCAGCTACCTACAATGCGGG CGGGTCGGGTTCTTACCTAGCTGTCTACGGCTGG GTCAACTCACCTCAGGCGGAGTACTACATTGTTGAATCATACGGCGACTACAATCCATGTTCTGATGCTGAAAGCCT GGGAACCCTCGAATCTGACGGCAGCACTTACACGGTCTGCACGGACACTCGCACCAATGAACCGTCCATCACCGGTA CCAGCACGTTCACCCAATATTGGTCAGTCCGTCAGAGCGAACGCACATCGGGGACTGTCACTGTTGGAAACCATTTC AATTATTGGGCGCAGCACGGCTTTGGCGACTCCTACAACTTCCAGGTCATGGCTGTGGAGGCTTTCTCTGGCTCGGG AAGTGCCAGTGTCTCTGTATCTTAG融合基因Tal-xyl的蛋白序列如SEQ ID NO. 3所示KREAEAEAEAKWCFRVCYRGICYRRCKREAEAEAGKRNEVRQYRDRGYDVRAIPDETFFTRQDEDEDDD EEEFIPTIEKRNPGGINYVQNYNGDVADFQYNEGAGTYTCSWDGSTDFVVGLGWSTGAARDITYSATYNAGGSGSYL AVYGWVNSPQAEYYIVESYGDYNPCSDAESLGTLESDGSTYTVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYWSVRQSERTSGTVTVGNHFNYWAQHGF⑶SYNFQVMAVEAFSGSGSASVSVS实施例4 融合基因Tal-xyl转化毕赤酵母<4-1>重组表达载体的线性化(1)线性化的质粒更容易整和到酵母染色体中，所以先要使重组体质粒线性化。取 100 μ L 大提质粒 pPIC9-Tal-xyl 用 BglII 酶切。酶切体系为无菌水适量DNA100 μ L
IOXbuffer 40 μ LBglII5μ L_总体积400 μ L37°C温浴2_3h，电泳检测是否酶切完全。(2)将400 μ L酶切产物依次用等体积的酚氯仿、氯仿抽提，再加入1/10体积的 乙酸钠(PH 5. 2)及2-3倍体积的无水乙醇沉淀，高速离心，用70%乙醇漂洗，真空干燥，置 于_20°C待用<4-2>毕赤酵母感受态细胞的制备(1)挑取YPD平板上的毕赤酵母GS115单菌落于50mL YPD液体培养基中，30°C、 300rpm摇床过夜；(2)将摇床过夜的新鲜GS115菌液按1 5/1000比例接种于500mL YPD中，30°C、 300rpm 摇床培养至 OD600 = 1. 3 1. 5 ；(3)菌液预冷后转移至预冷的离心管中，4°C、1500Xg离心5min，弃上清，菌体用 500mL预冷的无菌水重悬；(4) 40C、1500 X g离心5min，菌体用250mL预冷的无菌水重悬；(5) 4°C、1500 Xg离心5min，菌体用20mL预冷的lmol/L山梨醇溶液重悬；(6)41、1500\8离心51^11，菌体用ImL预冷的山梨醇溶液重悬，备用。<4-3>电击转化(1)将线性化的质粒溶于10 μ L无菌水，取80 μ L已制备好的感受态细胞与之混 合，并将其转至0. 2cm冰浴的电转化杯中，冰浴5min ；(2)调整好基因导入仪的参数(置于PIC档)，电转杯置电击仪电击转化；(3)立即往转化杯中加入ImL预冷的lmol/L山梨醇溶液；(4)混勻后涂布于RDB平板上，每个RDB平板上约涂200 μ L 300 μ L ；(5)倒置于30°C培养箱中培养2 4天，至菌落长出。实施例5 木聚糖酶表达菌株的筛选<5-1>转化子的筛选及诱导表达(1)用灭过菌的牙签从长有转化子的RDB板上挑取单菌落，按照编号点到相应编 号的MD平板上，每个平板上点100个单菌落；(2)将点有转化子的MD平板置于30°C培养箱中培养1 2天，至菌落长出。(3)按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3mL BMGY培养基的离心管中， 30°C、260rpm 摇床培养 48h ；(4)将摇床培养48h的菌液3，000 Xg离心15min，去上清，离心管中再加入ImL含 有0. 5%甲醇的BMMY培养基，在30°C、260rpm诱导培养；(5)诱导培养48h后，3，000 Xg离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出具 有较高木聚糖酶活性的转化子。<5_2>木聚糖酶活性的测定木聚糖酶酶活力测定采用DNS法。具体方法如下在pH 3. 0，50°C条件下，向试管 中加入900 μ L 1 %燕麦木聚糖底物，置于60°C水浴预先保温5min，加入100 μ L适当稀释的酶液，于60°C水浴准确保温lOmin，加入1. 5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却到室温后 540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1 μ mol还原糖
的酶量。DNS试剂50g 3，5_二硝基水杨酸溶于4L水中，不断搅拌，缓缓加入80g NaOH,使 之完全溶解，继续搅拌，将1500g酒石酸钾钠分数次少量加入，并小心加热，溶液最高温度 不超高45°C。冷却至室温后定容至5L。如果溶液不澄清，用Whatman 1号滤纸过滤，然后 棕色瓶室温贮藏。共筛选了 100株转化子，其中46株有木聚糖酶活性，选取酶活力最高的三个酵母 菌46#、50#、和58#进行50ml摇瓶水平的诱导表达，其木聚糖酶活性分别为83U/ml，80U/ml， 和74U/ml，将木聚糖酶活性为83U/ml的菌株进行保藏，保藏编号为CGMCCNo. 4024。实施例6 抗菌肽活性的测定先前的研究已经确定阳离子抗菌肽Tal对细菌和真菌都有非常好的抑菌 效果，例如大肠杆菌JM109 (Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella sp.)、痢疾 志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、普通变形菌(Proteus vulgaris)、副溶血弧菌 (Vibro parahaemolyticus) > Zj W. ^ ^ ^tl tf M (Acinetobacter calcoaceticus)、金黄 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),黑曲霉 (Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黄曲霉(Aspergillus flavo)、 留 (Aspergi 1 lustamarii) > # ffi β (Aspergillus clavatus) >(Aspergillus fumigatus)、绿色木霉(Trichoderma viride)等均具有较好的抑菌活性。为了进一步验证 木聚糖酶表达量较高的三株重组酵母菌同样也具有较高的抗菌活性，利用打孔法测定鲎素 Tal对细菌的抗菌活性。具体地，大肠杆菌JM109活化培养后，稀释菌液至数量级为107mL， 吸取100 μ L稀释液，均勻涂布LB固体平板，并在平板上打孔，在孔中加入发酵液80微升， 适宜温度培养16h，测抑菌圈直径，通过抑菌圈直径的大小来确定重组酵母菌抑菌活性的大 小。由图2的结果可以确定，其中抗菌活性能力和木聚糖酶活性的高低是相符合的，抑菌能 力最强的也是CGMCCNo. 4024 (图中4炉)。
权利要求
一种在毕赤酵母中有效的表达阳离子抗菌肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)改造阳离子抗菌肽或其前体序列，在其两端添加毕赤酵母自身蛋白酶的酶切位点，并合成改造后的序列；2)将上述合成序列插入毕赤酵母表达载体中，得毕赤酵母表达载体 阳离子抗菌肽序列的重组表达载体；3)将在毕赤酵母中表达的、表面带高负电荷的酸性酶插入到上述重组载体中所述阳离子抗菌肽序列之后，得毕赤酵母表达载体 阳离子抗菌肽 酶的重组表达载体；4)将上述毕赤酵母表达载体 阳离子抗菌肽 酶重组表达载体在毕赤酵母中表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阳离子抗菌肽为鲎素TachyplesinI。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面带高负电荷的酶为选自酸性木 聚糖酶、酸性淀粉酶、酸性甘露聚糖、酸性磷酸酶、酸性葡聚糖酶、酸性果胶酶、酸性蛋白酶 之一或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毕赤酵母表达载体为载体PPIC9。
5.一种高效表达的表达阳离子抗菌肽鲎素Tachyplesin I的毕赤酵母，其保藏编号为 CGMCC No. 4024。
全文摘要
本发明涉及基团工程领域，具体地，本发明涉及一种在毕赤酵母中有效的表达阳离子抗菌肽的方法。本发明的方法可以通过酸性酶带动阳离子抗菌肽的表达；酸性酶的大量酸性氨基酸可以中和阳离子抗菌肽的碱性氨基酸，使其免受宿主蛋白酶的攻击；可以直接通过表达的重组酶的活力的大小来判断抗菌肽产量的高低；同时表达产物和抗菌肽可以同时直接被应用。
文档编号C12N1/19GK101914565SQ201010239550
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者史秀云, 姚斌, 孟昆, 杨培龙, 柏映国, 王亚茹, 石鹏君, 罗会颖, 袁铁铮, 黄火清 申请人:中国农业科学院饲料研究所