专利名称：一种广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是用于寄生虫病快速检测技术中的一种广州管圆 线虫环介导等温扩增检测方法。
背景技术：
广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)最早是由我国著名的陈心陶教授 首次在广州家鼠肺血管内发现并命名的。螺、蛞蝓是主要的中间宿主，人因进食了含有广州 管圆线虫幼虫的生或半生的螺肉而感染广州管圆线虫病，又称嗜酸性粒细胞增多性脑脊髓 膜炎。广州管圆线虫幼虫主要侵犯人体中枢神经系统，表现为脑膜和脑炎、脊髓膜炎和脊髓 炎，可使人致死或致残。临床主要症状为急剧的头痛，甚至不能受到任何震动，走路、坐下、 翻身时头痛都会加剧，伴有恶心呕吐、颈项强直、活动受限、抽搐等症状，重者可导致瘫痪、 死亡。诊断治疗及时的情况下，绝大多数病人预后良好。极个别感染虫体数量多者，病情严 重可致死亡，或留有后遗症。广州管圆线虫病广泛流行于我国台湾、广东、浙江、黑龙江等 地，近年来在北京、浙江温州、福建等地均有爆发流行，严重危害人体健康，应引起广泛的重 视。广州管圆线虫感染常用的检测方法包括病原学检查和免疫学诊断，病原学检查主 要是脑脊液中查广州管圆线虫虫体，但概率很小。从我国目前的病例统计看，病原检出率仅 为4. 8% ；免疫学诊断方法中的抗体检测特异性不高，不能区分现症和既往感染，与其他寄 生虫存在着交叉反应，而抗原的检测虽然特异性较强，但敏感性不高。为有效控制广州管圆 线虫病，需要建立高度敏感、特异和简便的检测技术。聚合酶链反应(PCR)具有极高的灵敏 度和特异性，并已应用于多种寄生虫病的诊断，但PCR需要精密仪器的配套使用，无法满足 基层和现场检测的需求。Notomi T等在2000年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环媒恒温扩增 法(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)，胃 HC iH 禾O ffl Bst (Bacillus stearothermophilus)大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物(FIP 由FlC和F2组成；BIP由BlC和B2组成)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的6个 独立区域，在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。LAMP技术从2003年开始逐步用于医学检测，目前主要是应用于病原微生物的检 测和传染性疾病的诊断，应用环介导等温DNA扩增技术(LAMP)快速检测广州管圆线虫18s rRNA基因目前国内外文献尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于环介导等温DNA扩增技术(LAMP)检测广州管圆线 虫高灵敏度、高特异性的检测方法，使其操作简便、成本低廉，结果易于观察，适用于广州管 圆线虫的现场快速检测。本发明是根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理，针对广州管圆线虫的特异性片段设计4条引物，识别靶序列的6个区域，利用BstDNA酶的链置换特性，在等温条件下生成 大量重复的茎环状结构；设计扩增广州管圆线虫18s rRNA基因的4条特异性引物FIP :5’ -CCTGGTGGTGCCATTCCGTCTCTTTCGGTTCCTGGGGTAG-3，BIP :5’ -GCCCGGACACCGTAAGGATTGCACCACCAACCACCAAAT-3，F3 :5’ -TTGTCGAGGAGCTTCCCG-3’B3 5' -CACCAACTAAGAACGGCCAT-3’提取样品DNA后，环介导等温扩增(LAMP)反应体系扩增靶DNA，LAMP检测体系由 一套设计的引物、10XLAMP反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成，并对 LAMP反应条件进行优化，特异性和重复性检验证实该方法可靠性强。本发明的广州管圆线虫LAMP检测试剂包括LAMP反应液，与4条LAMP引物共同构 成LAMP检测体系，25 μ 1 LAMP检测体系的具体配置为25ul LAMP反应体系的具体配置
F3、B30. 1 0. 2μΜ
FIP, BIP1. 2 1· 6μΜ
dNTP1. 4 2. 8mM
Mg2+6 16mM
反应缓冲液 IOXThermoPol Reaction Buffer
链置换 DNA 聚合酶 BstDNA polymerase8U
舌甘菜碱betaine1. 0 1· 6M
本发明所述广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法，反应条件为63°C恒温60分
钟，80°C 5分钟终止反应。由于LAMP的扩增效率非常高，产生大量的焦磷酸镁，可直接通过肉眼观察是否有 白色的焦磷酸镁沉淀来判断是否生成焦磷酸离子，出现白色沉淀为阳性结果，未出现白色 沉淀为阴性结果。或者通过SYBR Green I染色剂颜色变化来判断靶基因是否存在，反应后 的混合液中加入染色剂SYBR Green-Ι,出现绿色的为阳性结果，橙色的是阴性结果。另一种检测结果的方法是取反应后的混合液2 μ 1，加入0. 5μ 1溴酚蓝上样缓冲 液，在2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压为ΙΟΟν，时间为30min，溴化乙锭(EB)染色后在紫外灯 下观察，出现梯度条带为阳性结果，如未出现则为阴性结果。本发明在定性检测时可不需任何特殊设备。该方法与常规检测方法相比，具有操 作简便快速、敏感特异、无需特殊仪器、检测时间比普通PCR短等特点，适合于广州管圆线 虫病现场快速检测。
1、图1是LAMP检测广州管圆线虫的敏感性试验，采用SYBR Green I染色方法检 测。1)是阴性对照，2)阳性对照，3)是IOOpg模板DNA，4)是IOpg模板DNA，5)是Ipg模板 DNA, 6)是 IOOfg 模板 DNA，7)是 IOfg 模板 DNA，8)是 Ifg 模板 DNA，9)是 0. Ifg 模板 DNA， 10)是O.Olfg模板DNA。从结果可看出，LAMP检测广州管圆线虫的最低检测量是lfg。2、图2是LAMP检测广州管圆线虫的敏感性试验，采用电泳方法检测。1)是DNA 标志物DL2000，2)是阴性对照，3)是阳性对照，4)是IOOpg模板DNA，5)是IOpg模板DNA，
46)是 Ipg 模板 DNA，7)是 IOOfg 模板 DNA，8)是 IOfg 模板 DNA，9)是 Ifg 模板 DNA，10)是 0. Ifg模板DNA，11)是0. Olfg模板DNA。从结果可看出，LAMP检测广州管圆线虫的最低检 测量是lfg。3、图3是LAMP检测广州管圆线虫的特异性试验，采用SYBR Green I染色方法检 测。1)是阴性对照，2)是广州管圆线虫DNA样本，3)是疟原虫DNA样本，4)是弓形虫DNA 样本，5)是血吸虫DNA样本，6)是异尖线虫DNA样本。从结果可看出，广州管圆线虫样本显 示为阳性，其他样本均为阴性，表明与其他寄生虫无交叉反应。4、图4是LAMP检测广州管圆线虫的特异性试验，采用电泳方法检测。1)是DNA标 志物DL2000，2)是阴性对照，3)是广州管圆线虫DNA样本，4)是疟原虫DNA样本，5)是弓形 虫DNA样本，6)是血吸虫DNA样本，7)是异尖线虫DNA样本。从结果可看出，广州管圆线虫 样本显示为阳性，其他样本均为阴性，表明与其他寄生虫无交叉反应。
具体实施例方式以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和 权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。如无特别指明，实验所用的引物由上海生工生物技术有限公司合成；BstDNA聚合 酶(大片段购自New England公司；甜菜碱(Betaine)、Mg2+购自SIGMA公司。实施例一、特异性DNA序列查找从美国基因数据库-GENBANK检索获得广州管圆线虫18s rRNA基因序列，登录号 为AY295804. 1，针对该保守靶序列进行LAMP引物设计，该特异性靶序列为1attaagccatgcatgaggagttcagctttaagtgaaactgcgaacggctcattagagcag
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二、引物的设计
LAMP方法中的引物设计是LAMP法实现扩增的关键所在，应用PrimerExplorerV3
软件设计引物。LAMP扩增的靶序列长度控制在300bp以下，LAMP最少需要4条引物，分别 是正向内引物FIP，由F2区段(与靶基因F2c区段完全互补)和Flc区段(同靶基因3’末 端的Flc序列相同)组成；正向外引物F3(与靶基因F3c区段完全互补)；反向内引物BIP， 由B2区段(与靶基因3’末端的B2c区段完全互补)和Blc区段(同靶基因3’末端Blc 序列完全相同)组成；反向外引物B3(与靶基因B3c区段完全互补)。各区段的设计规则 与PCR相同。内引物长度通常超过40个碱基，外引物为20个碱基左右。除了引物的长度、 碱基组成外，需要考虑引物与靶序列的环状结构等。三、LAMP1、广州管圆线虫基因组DNA提取实验室建立广州管圆线虫的动物感染模型。使 用Takara公司的基因组提取试剂盒提取广州管圆线虫的基因组DNA，分光光度分析A260/ A280 > 1. 8，为检测体系提供模板，-80°C冰箱中储存备用。2、LAMP反应的条件反应体系包括引物FTP、BIP、F3、B3 ；dNTP、Mg2+、链置换型DNA聚合酶(BstDNA polymerase)、Betaine、核酸模板，终体积25 μ 1。LAMP反应在60 65°C恒温条件下进行。 最佳反应条件因引物的效率和模板DNA质量变化而不同，因此通过比较试验确定最佳反应 时间、反应温度和试剂浓度。每个反应设立阴性与阳性对照。3、反应的敏感性、特异性分析将广州管圆线虫基因组DNA梯度稀释后进行LAMP检测，由最低DNA检出量分析反 应的敏感性，由图1，图2可知，LAMP方法的最低检测量为Ifg ；以广州管圆线虫、疟原虫、弓形虫、血吸虫、异尖线虫等五种寄生虫核酸为模板检 测体系的特异性。LAMP检测体系的特异性良好，与疟原虫、弓形虫、血吸虫、异尖线虫DNA没 有交叉反应，可以特异性地检测广州管圆线虫，参见图3，图4。4、LAMP反应的鉴定分析(1)直接观察LAMP反应中核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应 溶液中的Mg2+结合，产生副产物-焦磷酸镁白色沉淀。它有极高的特异性，可以用肉眼观察 或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度判断扩增与否。
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(2)显色反应直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green-I，无扩增反应的管子呈 橙色，有扩增反应的管子将变为绿色。(3)琼脂糖凝胶电泳取反应后的混合液2μ 1，加入0. 5μ 1溴酚蓝上样缓冲液，在 2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压为ΙΟΟν，时间为30min。EB染色剂染色后在紫外灯下观察。 LAMP反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔 处开始的拖尾条带现象。5、根据优化结果，确定了最佳的LAMP检测体系，在实际操作中可以存在一定的浮 动范围，具体如下F3、B30. 1 ~ 0. 2μΜ
FIP, BIP1. 2 1· 6μΜ
dNTP1. 4 2. 8mM
Mg2+6 16mM
反应缓冲液 IOXThermoPol Reaction Buffer
链置换 DNA 聚合酶 BstDNA polymerase8U
舌甘菜碱betaine1. 0 1· 6M
权利要求
一种广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于根据恒温核酸扩增方法的技术原理，针对广州管圆线虫的特异性片段设计4条引物，识别靶序列的6个区域，利用BstDNA酶的链置换特性，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构；设计扩增广州管圆线虫18s rRNA基因的4条特异性引物为FIP5’ CCTGGTGGTGCCATTCCGTCTCTTTCGGTTCCTGGGGTAG 3’BIP5’ GCCCGGACACCGTAAGGATTGCACCACCAACCACCAAAT 3’F35’ TTGTCGAGGAGCTTCCCG 3’B35’ CACCAACTAAGAACGGCCAT 3’提取样品DNA后，环介导等温扩增(LAMP)反应体系扩增靶DNA，环介导等温扩增(LAMP)检测体系由一套设计的引物、10×LAMP反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成，并对LAMP反应条件进行优化。
2.根据权利要求1所述的广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于四条 LAMP引物的广州管圆线虫LAMP检测试剂，还包括LAMP反应液，与四条LAMP引物共同构成 LAMP检测体系，25 μ 1 LAMP检测体系的具体配置为F3、B30· 1 0· 2μΜFIP, BIP1· 2 1· 6μΜdNTP1· 4 2. 8mMMg2+6 16mM反应缓冲液 IOXThermoPol Reaction Buffer链置换 DNA 聚合酶 BstDNA polymerase8U甜菜碱 betaine1. O 1. 6M
3.根据权利要求2所述的广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于所述试 剂的检测反应条件为63°C恒温60分钟，80°C 5分钟终止反应。
4.根据权利要求3所述的广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于扩增结 果的检测可以直接观察反应混合液中是否出现白色沉淀，出现白色沉淀为阳性结果，未出 现白色沉淀为阴性结果。
5.根据权利要求4所述的广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于反应后 的混合液中加入染色剂SYBR Green-Ι,出现绿色的为阳性结果，橙色的是阴性结果。
6.根据权利要求4所述的广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于，另一 种检测结果的方法是取反应后的混合液2μ 1，加入0. 5μ 1溴酚蓝上样缓冲液，在2%的琼 脂糖凝胶中电泳，电压为100伏，时间为30分钟，溴化乙锭(EB)染色剂染色后在紫外灯下 观察，出现梯度条带为阳性结果，如未出现则为阴性结果。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，特别是用于寄生虫病快速检测技术中的一种利用环介导等温扩增技术快速检测广州管圆线虫的方法。该方法包括两对用于检测广州管圆线虫的环介导等温扩增引物FIP、BIP、F3与B3，和一种利用上述两对引物检测广州管圆线虫的LAMP方法，其中包括反应模板的制备、LAMP反应体系、LAMP反应程序和检测结果判断。其操作简便、成本低廉，结果易于观察，非常适用于广州管圆线虫的现场快速检测。
文档编号C12Q1/68GK101899521SQ20101024223
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月30日 优先权日2010年7月30日
发明者卓敏敏, 张仪, 楼涤, 童群波, 陆绍红, 陈睿 申请人:浙江省医学科学院;中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所